專利名稱：一種病原菌多重pcr檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種奶牛乳房炎四種病原菌多重PCR檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
奶牛乳房炎(Bovine Mastitis)是奶牛乳腺組織的炎癥，主要為乳腺組織感染病原微生物所致，是奶牛的常見(jiàn)病、多發(fā)病。引起奶牛乳房炎的致病菌約為一百五十多種，以金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌為主，約占整個(gè)奶牛乳房炎病例的90％以上。根據(jù)臨床表現(xiàn)可分為隱性型和臨床型乳房炎。我國(guó)奶牛臨床型乳房炎的發(fā)病率約為33.4％，造成產(chǎn)奶量下降、病乳廢棄，嚴(yán)重者乳區(qū)化膿、壞疽、萎縮，致使永久失去泌乳能力而被淘汰，占總淘汰牛的10％；隱性乳房炎奶牛的平均頭陽(yáng)性率為73.9％，引起產(chǎn)奶量的下降和乳品的質(zhì)量下降，每年造成的直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)12億元人民幣。
目前，我國(guó)仍缺乏奶牛乳房炎病原菌快速敏感的檢測(cè)和鑒定技術(shù)，常規(guī)的微生物學(xué)檢測(cè)和鑒定方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，且難以快速、準(zhǔn)確的進(jìn)行檢測(cè)。因此，研究并產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)奶牛乳房炎病原菌的特異、靈敏和快速檢測(cè)和鑒定技術(shù)，必將對(duì)整體提高我國(guó)奶牛乳房炎的防治水平，提高奶牛業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，促進(jìn)奶牛業(yè)的發(fā)展，為社會(huì)提供更多的優(yōu)質(zhì)安全牛奶起到有力的保障作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在提供一種快速、敏感、特異的奶牛乳房炎四種病原菌檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。
本發(fā)明提供了一種病原菌PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于它含有如下引物(1)檢測(cè)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的引物上游引物5’AAG GAT ATA TTC GGA ACA TCT 3’下游引物5’TAA GTC AAA CGT TAA CAT ACG 3’(2)檢測(cè)無(wú)乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)的引物上游引物5’GCT AGG CTC CAT TGA ATC 3’下游引物5’TTA ACC TAG TTT CTT TAA AAC TAG AA 3’(3)檢測(cè)停乳鏈球菌(Strpetococcus dysgalactiae)的引物上游引物5’GAA CAC GTT AGG GTC GTC 3’下游引物5’AGT ATA TCT TAA CTA GAA AAA CTA TTG 3’(4)檢測(cè)大腸桿菌(Escherichia coli)的引物上游引物5’AAG AAG CTT GCT TCT TTG CTG 3’下游引物5’GAG CCC GGG GAT TTC ACA T 3’。
優(yōu)選的本發(fā)明所述試劑盒，其中各組分終濃度為檢測(cè)金黃色葡萄球菌的引物3.0μmol/L、檢測(cè)無(wú)乳鏈球菌的引物1.25μmol/L、檢測(cè)停乳鏈球菌的引物1.5μmol/L、檢測(cè)大腸桿菌為的引物0.5μmol/L、Mg2+1.0mmol/L，dNTP 0.175mmol/L、10×PCR反應(yīng)緩沖液4μL、TaqDNA聚合酶2U、用滅菌無(wú)離子水補(bǔ)足體積至40μL。
本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)方法，它包括如下步驟(1)將模板DNA加入本發(fā)明所述試劑盒中；(2)在PCR擴(kuò)增儀上孵育，PCR循環(huán)參數(shù)為95℃預(yù)變性5min；95℃變性1min，53℃退火30s，72℃延伸30s，36個(gè)循環(huán)；72℃終延伸7min，4℃10min結(jié)束PCR擴(kuò)增。
(3)將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。
本發(fā)明所述檢測(cè)方法，其中電泳后擴(kuò)增片段的特異性條帶分別為金黃色葡萄球菌439bp、無(wú)乳鏈球菌162bp、停乳鏈球菌264bp、大腸桿菌544bp。
本發(fā)明所述試劑盒在檢測(cè)奶牛金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌、大腸桿菌中的應(yīng)用。
本發(fā)明奶牛乳房炎四種病原菌多重PCR檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法，是針對(duì)奶牛乳房炎主要病原菌金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌和大腸桿菌16S-23S rRNA區(qū)間，設(shè)計(jì)4對(duì)PCR擴(kuò)增引物，應(yīng)用多重PCR反應(yīng)體系對(duì)奶牛乳房炎四種病原菌進(jìn)行檢測(cè)。擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度分別為無(wú)乳鏈球菌162bp、停乳鏈球菌264bp、金黃色葡萄球菌439bp和大腸桿菌544bp。采用本發(fā)明的方法可用于奶牛乳房炎病原菌檢測(cè)。
本發(fā)明的產(chǎn)品優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在①多重PCR方法具有良好的特異性，它對(duì)不同菌株的同一類(lèi)細(xì)菌具有廣泛的適用性。
②多重PCR方法與各病原菌的單重PCR方法一樣具有相當(dāng)高的敏感性，可以檢測(cè)出痕量的DNA模板。
③本發(fā)明檢測(cè)試劑盒，市場(chǎng)應(yīng)用前景廣。


圖1本發(fā)明試劑盒檢測(cè)結(jié)果圖。
MDL2000；1無(wú)乳鏈球菌；2停乳鏈球菌；3金黃色葡萄球菌；4大腸桿菌；5無(wú)乳鏈球菌+停乳鏈球菌；6無(wú)乳鏈球菌+金黃色葡萄球菌；7無(wú)乳鏈球菌+大腸桿菌；8停乳鏈球菌+金黃色葡萄球菌；9停乳鏈球菌+大腸桿菌；10金黃色葡萄球菌+大腸桿菌；11無(wú)乳鏈球菌+停乳鏈球菌+金黃色葡萄球菌；12無(wú)乳鏈球菌+停乳鏈球菌+大腸桿菌；13無(wú)乳鏈球菌+金黃色葡萄球菌+大腸桿菌；14停乳鏈球菌+金黃色葡萄球菌+大腸桿菌；15無(wú)乳鏈球菌+停乳鏈球菌+金黃色葡萄球菌+大腸桿菌。
具體實(shí)施例方式
(1)采集病料、病原菌培養(yǎng)奶樣采集時(shí)先用溫水清洗奶牛乳房并擦凈，再用75％酒精棉球或5％的碘酊棉球擦拭乳頭，擠去每個(gè)乳區(qū)的第1～3把奶，然后把奶汁擠入預(yù)先滅菌的試管內(nèi)，奶量為5mL/管，作好標(biāo)記，4℃保存待檢。將采集的新鮮奶樣搖勻，每份奶樣吸取0.1mL分別接種于10％綿羊血平板培養(yǎng)基，置37℃恒溫箱培養(yǎng)48h，觀察菌落形態(tài)，挑取形態(tài)不同的單個(gè)菌落接種于綿羊血瓊脂培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)48h。挑取純化培養(yǎng)菌落接種于THB液體培養(yǎng)基中37℃劇烈振搖培養(yǎng)18h。
(2)病原菌模版DNA的制備(煮沸法)取1mL菌液8000rpm/min(4℃)離心3min；棄上清，并將殘余液滴吸凈。加入500μL TE(pH8.0)100℃煮沸10min；立即放入冰水混合物中，冷卻后10000rpm/min(4℃)離心3min；取上清作為PCR反應(yīng)的模版，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> (3)多重PCR反應(yīng)用提取病料的DNA，加入檢測(cè)試劑盒中，在PCR反應(yīng)儀中進(jìn)行PCR。
試劑盒40μL反應(yīng)體系其中各組分終濃度為檢測(cè)金黃色葡萄球菌的引物3.0μmol/L、檢測(cè)無(wú)乳鏈球菌的引物1.25μmol/L、檢測(cè)停乳鏈球菌的引物1.5μmol/L、檢測(cè)大腸桿菌為的引物0.5μmol/L、Mg2+1.0mmol/L，dNTP 0.175mmol/L、10×PCR反應(yīng)緩沖液4μL、TaqDNA聚合酶2U、用滅菌無(wú)離子水補(bǔ)足體積至40μL。
各病原菌DNA模板各2μL。
在PCR擴(kuò)增儀上孵育，PCR循環(huán)參數(shù)為95℃預(yù)變性5min；95℃變性1min，53℃退火30s，72℃延伸30s，36個(gè)循環(huán)；72℃終延伸7min，4℃10min結(jié)束PCR擴(kuò)增。
(4)瓊脂糖電泳分析PCR產(chǎn)物
1×TAE緩沖液配制成2％的瓊脂糖凝膠溶液，微波爐加熱使瓊脂糖完全溶解后，加入溴化乙錠(5mg/mL EB)至終濃度為0.5μg/mL，灌膠；然后取適量待電泳的DNA樣品與1/6體積的電泳上樣液(0.25％溴酚藍(lán)，0.25％二甲苯青FF，40％蔗糖)混勻，將待檢樣品加到上樣槽中，以5V/cm進(jìn)行恒壓電泳。當(dāng)樣品電泳至適當(dāng)位置后，用長(zhǎng)波紫外燈觀察、記錄結(jié)果，用紫外凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，Gel Doc 2000)拍照保存(見(jiàn)圖1)。電泳后擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度分別為無(wú)乳鏈球菌162bp、停乳鏈球菌264bp、金黃色葡萄球菌439bp和大腸桿菌544bp。根據(jù)有無(wú)以上片段進(jìn)行病原菌的檢測(cè)和鑒定。
權(quán)利要求
1.一種病原菌PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于它含有如下引物(1)檢測(cè)金黃色葡萄球菌的引物上游引物5’AAG GAT ATA TTC GGA ACA TCT 3’下游引物5’TAA GTC AAA CGT TAA CAT ACG 3’(2)檢測(cè)無(wú)乳鏈球菌的引物上游引物5’GCT AGG CTC CAT TGA ATC 3’下游引物5’TTA ACC TAG TTT CTT TAA AAC TAG AA 3’(3)檢測(cè)停乳鏈球菌的引物上游引物5’GAA CAC GTT AGG GTC GTC 3’下游引物5’AGT ATA TCT TAA CTA GAA AAA CTA TTG 3’(4)檢測(cè)大腸桿菌的引物上游引物5’AAG AAG CTT GCT TCT TTG CTG 3’下游引物5’GAG CCC GGG GAT TTC ACA T 3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，其中各組分終濃度為檢測(cè)金黃色葡萄球菌的引物3.0μmol/L、檢測(cè)無(wú)乳鏈球菌的引物1.25μmol/L、檢測(cè)停乳鏈球菌的引物1.5μmol/L、檢測(cè)大腸桿菌為的引物0.5μmol/L、Mg2+1.0mmol/L，dNTP 0.175mmol/L、10×PCR反應(yīng)緩沖液4μL、Taq DNA聚合酶2U、用滅菌無(wú)離子水補(bǔ)足體積至40μL。
3.一種檢測(cè)方法，它包括如下步驟(1)將模板DNA加入權(quán)利要求1或2所述的試劑盒中；(2)在PCR擴(kuò)增儀上孵育，PCR循環(huán)參數(shù)為95℃預(yù)變性5min；95℃變性1min，53℃退火30s，72℃延伸30s，36個(gè)循環(huán)；72℃終延伸7min，4℃10min結(jié)束PCR擴(kuò)增。(3)將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的檢測(cè)方法，其中電泳后擴(kuò)增片段的特異性條帶分別為金黃色葡萄球菌439bp、無(wú)乳鏈球菌162bp、停乳鏈球菌264bp、大腸桿菌544bp。
5.權(quán)利要求1或2所述試劑盒在檢測(cè)奶牛金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌、大腸桿菌中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明是針對(duì)奶牛乳房炎主要病原菌金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌和大腸桿菌16S－23S rRNA區(qū)間，合成4對(duì)相應(yīng)的特異擴(kuò)增引物，應(yīng)用多重PCR反應(yīng)體系對(duì)奶牛乳房炎病原菌進(jìn)行檢測(cè)。擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度分別為無(wú)乳鏈球菌162bp、停乳鏈球菌264bp、金黃色葡萄球菌439bp和大腸桿菌544bp。該多重PCR檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、敏感。能夠同時(shí)對(duì)四種病原菌進(jìn)行檢測(cè)和鑒定，從而達(dá)到降低PCR診斷的工作量和成本的目的。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1900306SQ20051001224
公開(kāi)日2007年1月24日 申請(qǐng)日期2005年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月21日
發(fā)明者崔玉東, 朱戰(zhàn)波, 樸范澤 申請(qǐng)人:崔玉東, 朱戰(zhàn)波, 樸范澤