專利名稱：大豆孢囊線蟲特異性scar標(biāo)記、特異性引物及快速pcr檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及大豆孢囊線蟲特異性SCAR標(biāo)記全序列、特異性SCAR標(biāo)記引物序列及大豆孢囊線蟲SACR特異性快速PCR檢測方法。
背景技術(shù)：
大豆孢囊線蟲病(Heterodera glycines)是世界大豆生產(chǎn)上的重大毀滅性生物災(zāi)害，在美國、日本、韓國、中國、俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)、阿根廷、巴西、埃及、印度尼西亞等國家普遍發(fā)生，危害嚴(yán)重。在我國，大豆孢囊線蟲主要分布在東北和黃淮海兩個大豆主產(chǎn)區(qū)，尤以東北三省西部風(fēng)沙、干旱、鹽堿地發(fā)生普遍嚴(yán)重，目前我國大豆孢囊線蟲發(fā)生面積達(dá)6000萬畝以上，一般發(fā)病造成損失10％-20％，嚴(yán)重時達(dá)30％-50％，使大豆減產(chǎn)約4億公斤，引起的損失是達(dá)8億元人民幣。目前大豆孢囊線蟲的鑒定多數(shù)情況下仍然依賴于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法，生理小種和致病性的鑒定主要是用鑒別寄主或寄主植物的不同品種的反應(yīng)型來確立。但形態(tài)學(xué)鑒定非常困難，需要許多的技術(shù)、耗時、費(fèi)力且許多表型特征的不穩(wěn)定性，形態(tài)特征測量值有重疊等原因使鑒定時常出現(xiàn)誤差。
以PCR為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)為解決線蟲鑒定診斷存在的問題提供了最有力的工具。特異性引物PCR或多重PCR技術(shù)是近年來線蟲分子診斷取得的重要進(jìn)展。通過一次PCR測驗(yàn)就可以在混合樣品中特異性地檢測出一個或多個線蟲種?；诤颂求wDNA(rDNA)而構(gòu)建的線蟲特異性引物進(jìn)展較快，在診斷根腐線蟲、根結(jié)線蟲中取得了突破性進(jìn)展，形成了特異性診斷4種重要根腐線蟲如穿刺根腐線蟲P.penetrans、斯克里布根腐線蟲P.scribneri、咖啡根腐線蟲P.Coffeae和盧賽根腐線蟲P.loosi的特異性引物，以及3種根結(jié)線蟲如戚烏得根結(jié)線蟲M.Chitwoodi、法拉克斯根結(jié)線蟲M.fallax和北方根結(jié)線蟲M.Hapla(Zijlstra，C.1997，Petersen et al.，1997，Williamson et al.，1997)的特異性引物，診斷的水平達(dá)到單條幼蟲的水平。
Mulholland et al.(1996)分別構(gòu)建了馬鈴薯金線蟲和馬鈴薯白線蟲的特異性引物，描述了一種基于rDNA-ITS區(qū)域特異性等位多重PCR技術(shù)檢測這兩種線蟲的方法，能快速鑒定馬鈴薯白線蟲和馬鈴薯金線蟲及其復(fù)合種群。與標(biāo)準(zhǔn)的PCR途徑不同，這一技術(shù)在每個PCR反應(yīng)中應(yīng)用了3個引物，通用引物5.8SrRNA、馬鈴薯金線蟲的特異性引物ITS1-Gr和馬鈴薯白線蟲的特異性引物ITS1-Gp。Bulman & Marshall(1997)成功應(yīng)用多重PCR技術(shù)快速診斷馬鈴薯孢囊線蟲。在研究了秘魯和澳大利亞的馬鈴薯金線蟲和馬鈴薯白線蟲的rDNA-ITS的序列結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，構(gòu)建了馬鈴薯金線蟲的特異性引物PITSr3和白線蟲的特異性引物PITSp4，通用引物ITS5與PITSr3可以擴(kuò)增343bp馬鈴薯金線蟲的特異性片段，與PITSp4可以擴(kuò)增出265bp特異性識別馬鈴薯白線蟲的DNA片段。在一個PCR反應(yīng)中，使用PITSr3，PITSp4和ITS5這3個引物，即使復(fù)合種群中金線蟲DNA的含量僅為白線蟲的百分之一，也能從復(fù)合種群檢測出金線蟲。
彭德良、Subbotin等構(gòu)建了基于rDNA-ITS區(qū)域上的大豆孢囊線蟲特異性引物GlyF1，應(yīng)用兩組引物D3A和D3B及大豆孢囊線蟲種特異性引物GlyF1和引物rDNA2成功地對大豆孢囊線蟲進(jìn)行了分子診斷研究。第一對引物D3A和D3B是證實(shí)PCR擴(kuò)增的成功性，第二對引物GlyFI和rDNA2是特異性檢測大豆孢囊線蟲。用這兩對引物進(jìn)行的雙倍PCR擴(kuò)增，從所有52個大豆孢囊線蟲群體都擴(kuò)大豆孢囊線蟲的特異性DNA片段(181bp)，而在所有測試的其他8種孢囊線蟲22群體沒有181bp片段。大豆孢囊線蟲種特異性引物GlyF1靈敏性非常高，能從單條幼蟲的微量DNA中擴(kuò)增出大豆孢囊線蟲種特異性片段。
Amiri，Subbotin等(2002)構(gòu)建了基于rDNA-ITS的甜菜孢囊線蟲(H.schachtii)特異性引物SHF6。將特異性引物SHF6與通用引物AB28引物結(jié)合，同時將通用引物D2A和D3B放在一個PCR反應(yīng)體系中，從58個孢囊線蟲群體中成功地鑒定出甜菜孢囊線蟲，從36個甜菜孢囊線蟲群體中擴(kuò)增200bp特異性片段，而沒有甜菜孢囊線蟲(H.schachtii)DNA的樣品沒有200bp的片段。
而基于基因組DNA的SCAR(Sequence Characterized Amplified Region)標(biāo)記植物線蟲特異性引物進(jìn)展較慢。但是在馬鈴薯金線蟲和馬鈴薯白線蟲的快速分子診斷中取得進(jìn)展，F(xiàn)ullanodo，A.et.al.(1999)用隨機(jī)引物OPG5分別擴(kuò)增出區(qū)分馬鈴薯金線蟲特異性RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)標(biāo)記片段為826bp，馬鈴薯白線蟲特異性RAPD標(biāo)記片段為1100bp。對擴(kuò)增出的馬鈴薯金線蟲和白線蟲的RAPD標(biāo)記片段進(jìn)行全序列分析，將RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化成SCAR標(biāo)記，設(shè)計出馬鈴薯金線蟲FullGrf和FullGrr以及馬鈴薯白線蟲的SCAR特異性標(biāo)記引物FullGpf和FullGpr，用FullGrf和FullGrr擴(kuò)增出了315bp馬鈴薯金線蟲的特異性片段，用FullGpf和FullGpr擴(kuò)增出798bp的馬鈴薯白線蟲的特異性片段。
國內(nèi)外雖然有基于核糖體DNA的ITS區(qū)域的大豆孢囊線蟲特異性引物GlyF1的報道，但是國內(nèi)外尚未見基于基因組DNA的大豆孢囊線蟲特異性SCAR標(biāo)記引物檢測大豆孢囊線蟲的報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述技術(shù)領(lǐng)域的空白，本發(fā)明提供大豆孢囊線蟲特異性SCAR標(biāo)記的全長序列，同時提供了特異性SCAR標(biāo)記的特異性引物。
本發(fā)明還提供大豆孢囊線蟲SACR特異性快速PCR檢測方法，為制定線蟲的快速分子檢測、大豆孢囊線蟲病的早期診斷和制定線蟲病害綜合治理對策服務(wù)。
大豆孢囊線蟲特異SCAR標(biāo)記，其特征在于其具有SEQ NO1所示的核苷酸序列。
大豆孢囊線蟲特異性SCAR標(biāo)記的引物SCNF1和SCNR1，其序列為SCNFI5’-GGA CCC TGA CCA AAA AGT TTC CGC-3’，SCNRI5’-GGA CCC TGA CGA GTT ATG GGC CCG-3’。
大豆孢囊線蟲SCAR標(biāo)記快速PCR檢測方法，其特征在于PCR反應(yīng)體系中含有上述引物SCNF1和SCNR1。
所述PCR反應(yīng)體系中還含有通用引物。
所述通用引物序列為D2A5′-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3′，D3B5′-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3′。
本發(fā)明利用RAPD技術(shù)，獲得了基于大豆孢囊線蟲基因組DNA的特異性RAPD標(biāo)記，將RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)換成SCAR標(biāo)記，經(jīng)克隆測序后獲得了特異性SCAR標(biāo)記的全長序列SEQNO1，構(gòu)建了特異性SCAR標(biāo)記的特異性引物SCNFI和SCNRI(即SEQ NO2和SEQ NO3)。利用大豆孢囊線蟲特異性引物SCNFI和SCNRI，在PCR擴(kuò)增條件下，所有大豆孢囊線蟲群體都獲得了500bp的特異性SCAR標(biāo)記片段，而其它線蟲類則沒有500bp的特異性SCAR標(biāo)記片段。為防止假陰性反應(yīng)，可以在PCR反應(yīng)體系中加入通用引物作內(nèi)標(biāo)。本發(fā)明選用核糖體引物D2A和D3B與上述特異性引物SCNF1和SCNR1相結(jié)合，利用一步雙重PCR方法檢測大豆孢囊線蟲，在PCR擴(kuò)增條件下，大豆孢囊線蟲群體都獲得了500bp的特異性SCAR標(biāo)記片段和800bp片段，而其它線蟲類則沒有500bp的特異性SCAR標(biāo)記片段，只有800bp片段，增加了可靠性。
本發(fā)明應(yīng)用特異性SCAR標(biāo)記及核糖體基因相結(jié)合的一步雙重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR檢測技術(shù)檢測目標(biāo)線蟲，與重復(fù)性較差的RAPD技術(shù)(RAPD-PCR)、核糖體DNA限制性內(nèi)切酶技術(shù)(RFLP-PCR)檢測方法相比，更能夠省時、準(zhǔn)確、靈敏，更能建立快速、準(zhǔn)確的大豆孢囊線蟲檢測技術(shù)。該技術(shù)可應(yīng)用于對大豆孢囊線蟲田間土壤樣品及大豆孢囊線蟲病發(fā)生的早期快速分子檢測，具有實(shí)際的應(yīng)用價值。


圖1用隨機(jī)引物OPA06擴(kuò)增大豆孢囊線蟲、馬鈴薯白線蟲、馬鈴薯金線蟲和禾谷孢囊線蟲的RAPD的特異性DNA片段結(jié)果。
M為標(biāo)準(zhǔn)DNA分子標(biāo)記(DNA marker DL 2,000)；1-2分別為馬鈴薯白線蟲(編碼為PCNp1，PCNp2)，3-4分別為馬鈴薯金線蟲(編碼為PCNr3，PCNr4)，5-13分別為大豆孢囊線蟲群體(編碼為SCN08，SCN09，SCN06，SCN10，SCN11，SCN03，SCN05，SCN07，SCN29)，14-15分別為禾谷孢囊線蟲群體(編碼為CCN02，CCN01)；16為陰性對照圖2用大豆孢囊線蟲特異性SCAR標(biāo)記引物(SCNFI和SCNRI)擴(kuò)增4種孢囊線蟲的結(jié)果。M為標(biāo)準(zhǔn)DNA分子標(biāo)記(DNA marker DL 2,000)；1-7分別為大豆孢囊線蟲7個不同群體(編碼為SCN29，SCN11，SCN03，SCN05，SCN10，SCN16，SCN07)，8-9分別為馬鈴薯金線蟲2個不同群體(編碼為PCNr3，PCNr4)，10-11別為馬鈴薯白線蟲2個不同群體(編碼為PCNp1，PCNp2)；12為禾谷孢囊線蟲群體(編碼為CCN02)；13為陰性對照。
圖3大豆孢囊線蟲特異性SCAR標(biāo)記引物與通用引物(D2A和D3B)結(jié)合一步雙重PCR檢測結(jié)果。
M為標(biāo)準(zhǔn)DNA分子標(biāo)記(DNA marker DL 2,000)；1-16分別為大豆孢囊線蟲SCN01，SCN02，SCN04，SCN06，SCN08，SCN09，SCN12，SCN13，SCN14，SCN15，SCN17，SCN18，SCN19，SCN20，SCN21，SCN22；17陰性對照圖4大豆孢囊線蟲特異性SCAR標(biāo)記引物與通用引物(D2A和D3B)結(jié)合一步雙重PCR檢測5種孢囊線蟲的結(jié)果。
M為標(biāo)準(zhǔn)DNA分子標(biāo)記(DNA marker DL 2,000)；1-13分別為大豆孢囊線蟲群體SCN23，SCN24，SCN25，SCN26，SCN27，SCN28，SCN30，SCN31，SCN32，SCN33，SCN34，SCN35，SCN36；14-15為馬鈴薯白線蟲群體PCNp1，PCNp2，16-17為馬鈴薯金線蟲群體PCNr3，PCNr4，18為甜菜孢囊線蟲群體BCN，19-23為禾谷孢囊線蟲群體CCN01，CCN03，CCN05，CCN07，CCN09；24陰性對照具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)選用的材料37個大豆孢囊線蟲群體為本實(shí)驗(yàn)室長期從吉林省、黑龍江省、遼寧省、河北省、河南省、湖北省、山東省、山西省、北京等地收集保存且繁殖在大豆上的孢囊線蟲種群，11個禾谷孢囊線蟲群體為本實(shí)驗(yàn)室從北京、河北、河南等省市收集保存，1個甜菜孢囊線蟲群體及4個馬鈴薯孢囊線蟲群體為本實(shí)驗(yàn)室工作人員從比利時收集(見表1、表2)。
表1大豆孢囊線蟲樣品代碼及群體來源


表2供試非大豆孢囊線蟲群體樣品代碼及來源

主要試劑Taq DNA聚合酶、DNA凝膠回收試劑盒、DNA marker購自TaKaRa公司，限制性內(nèi)切酶(Biolabs)購自京科宏達(dá)生物技術(shù)公司；引物由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成；pGEM-T Easy Vector(Promega，美國)購自北京華綠源生物技術(shù)公司。
實(shí)施例1大豆孢囊線蟲特異性SCAR標(biāo)記的DNA片段、特異性引物1.1大豆孢囊線蟲DNA的提取手挑大豆孢囊線蟲、馬鈴薯白線蟲、馬鈴薯金線蟲各群體各1個孢囊，放入14μl滅菌的重蒸水中，-20℃冰箱中冷凍1h。用75％酒精消毒的玻璃棒在eppendorf tube中轉(zhuǎn)動至冰融化，加入3μl的10X的PCR buffer，3μl蛋白酶K溶液(600μg/ml)，然后在-20℃下冷凍至少2h。2h后，將eppendorftube從冰箱中取出，置65℃下溫育1.5h，以降解脫氧核糖核酸；接著在95℃10min，使蛋白酶K變性，最后1000rpm下離心1min，取上清DNA懸浮液于-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 1.2大豆孢囊線蟲特異性RAPD標(biāo)記(SCAR標(biāo)記)的篩選根據(jù)彭德良(彭德良，小麥和大豆孢囊線蟲毒性、分子診斷及線蟲病害生防因子研究博士學(xué)位論文，2001年7月)研究大豆孢囊線蟲群體的遺傳變異分析結(jié)果，在能產(chǎn)生多態(tài)性的RAPD引物中，遴選12個Operon系列的含10個堿基的隨機(jī)引物OPA02、OPA03、OPA06、OPA09、OPA13、OPA18、OPB15、OPC06、OPD13、OPG06、OPG08、OPK16(見表3)進(jìn)行擴(kuò)增。從擴(kuò)增結(jié)果來看，隨機(jī)引物OPA06擴(kuò)增效果好，獲得的特異性片段穩(wěn)定，因此選用OPA06對24個大豆孢囊線蟲群體和6個其他孢囊線蟲群體的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，尋找出大豆孢囊線蟲群體的特異性SCAR標(biāo)記片段位500bp。
RAPD-PCR反應(yīng)體系采用25μl的PCR反應(yīng)體系，配比如下10X PCR-buffer(含Mg++)2.5μl，dNTPs 2.0μl，引物OPA06為0.5μl，Taq DNA多聚酶0.2μl(5U/μl)，模板DNA0.5μl，滅菌重蒸水補(bǔ)足25μl。在EppendorfPCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增。
PCR擴(kuò)增條件為94℃ 4min；94℃ 1min，35℃ 1min，72℃ 1min，10個循環(huán)；94℃ 30s；35℃ 30s；72℃ 2min，35個循環(huán)；72℃延伸10min；4℃過夜。PCR擴(kuò)增后，取5μl擴(kuò)增產(chǎn)物加1μl加樣緩沖液在1.0％瓊脂糖凝膠上電泳，用1X TAE作為電泳緩沖液，100V下電泳1小時，用EB染色，在紫光燈下觀測并照相。如圖1。
表3本發(fā)明所使用引物代碼和序列


用隨機(jī)引物OPA06經(jīng)過多次RAPD擴(kuò)增多態(tài)性較穩(wěn)定，從圖1中可以看出用隨機(jī)引物OPA06擴(kuò)增大豆孢囊線蟲群體獲得500bp的特異性DNA片段(圖1中5-13泳道)，用隨機(jī)引物OPA06擴(kuò)增馬鈴薯白線蟲得到520bp的特異性DNA片段，用隨機(jī)引物OPA06擴(kuò)增馬鈴薯金線蟲獲得480bp的特異性DNA片段。
1.3、大豆孢囊線蟲特異性SCAR的序列測定及構(gòu)建特異性SCAR標(biāo)記引物將隨機(jī)引物OPA06擴(kuò)增大豆孢囊線蟲獲得的500bp的RAPD特異性DNA片段從瓊脂糖凝膠上切割，使用大連寶生物公司的DNA回收試劑盒對500bp的RAPD特異性DNA片段進(jìn)行回收和純化后，純化后的RAPD-PCR產(chǎn)物連接到pGEM-T easy Vector載體上，PCR產(chǎn)物與載體連接后，轉(zhuǎn)化到E.coli中進(jìn)行克隆，用原來的RAPD引物和限制性內(nèi)切酶EcoRI對質(zhì)粒DNA進(jìn)行檢測。將表現(xiàn)為陽性克隆的重組質(zhì)粒委托大連寶生物公司進(jìn)行序列測定。用Vector NTI 9.0(InforMax Co.)軟件對序列進(jìn)行分析比較。
測定的500bp大豆孢囊線蟲特異性SCAR標(biāo)記的全序列如下5’-GGACCCTGACCAAAAAGTTTCCGCTGGTAGGATTTTAAGTTGAAGTGTTGGCTAAAAGTTAAAAAAAATTCCAGGCCGCTATCTCTAACCCCCTGGGCTGGGTGCTTCTAGAACTTTTCAGTACCAACTTTGTCCAGTTCAGTCCACGTTGAATAACTCATTAGGCTTTGACCTGAGCGCAGGGTGGCCAGCAGACTTATTGTAGAGCTTTAAAAGCCCGATTTTTCCAAATTTTAAAATTTCGAAAATTTTCAAAATTTTTCGAGCTAGGCCTAAAAAACTGTTTTCGGGTTTTTGAATTTTAGGATTTTTTAACGAATTTTCCCAGAGAAACGGAGACCACTTCCAAAACATAGTTTTTCGAGCTCTATCGATTGGTAATTTTTTCGGAAAATTTTCGATTTTTTTTCGGAAATAGAAAAATTTTTTGGCCTCAGCGGGACATTTGAGTCCCGGGCCCATAACTCGTCAGGGTCC-3’根據(jù)大豆孢囊線蟲特異性SCAR標(biāo)記的序列測序結(jié)果，上游引物以O(shè)PA06序列為起點(diǎn)，下游引物以O(shè)PA06序列5’-GGACCCTGAC的互補(bǔ)序列為起點(diǎn)，兩端各延長14個堿基，構(gòu)建了一對大豆孢囊線蟲特異性SCAR標(biāo)記引物，該引物對各含24堿基。將大豆孢囊線蟲特異性SCAR標(biāo)記上游引物和下游引物分別命名為SCNFI和SCNRI，其序列特征如下SCNFI(5’-GGA CCC TGA CCA AAA AGT TTC CGC-3’SCNRI(5’-GGA CCC TGA CGA GTT ATG GGC CCG-3’實(shí)施例2大豆孢囊線蟲特異性SCAR標(biāo)記引物的分子檢測本發(fā)明構(gòu)建的大豆孢囊囊線蟲特異性SCAR標(biāo)記引物SCNFI和SCNRI由上海博亞生物有限公司合成，特異性SCAR標(biāo)記的擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為50μl，其中含有5μl 10XPCRbuffer(含Mg++)；4μl 2.5mM dNTP；0.5μl SCNFI(0.1μg/μl)；0.5μl SCNRI(0.1μg/μl)；1UTaq DNA聚合酶(5U/μl)；2μl模板DNA(大豆孢囊線蟲及其它孢囊線蟲群體提取的DNA)；ddH2O 37.8μl。
所應(yīng)用的大豆孢囊線蟲特異性SCAR標(biāo)記引物序列如下SCNFI(5’-GGA CCC TGA CCA AAA AGT TTC CGC-3’SCNRI(5’-GGA CCC TGA CGA GTT ATG GGC CCG-3’PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性4min，然后94℃30S，75℃60S，72℃2min循環(huán)35次，72℃延伸10min，保存在4℃條件下。取5μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物與1μl上樣緩沖液(0.09％溴酚蘭，60％甘油，60mM EDTA)混勻，點(diǎn)入含0.5mg/L EB的1.2％瓊脂糖凝膠中，在100V下電泳1小時，取出凝膠，采用Kodak EDAS-120凝膠分析系統(tǒng)進(jìn)行照相分析。統(tǒng)計特異條帶的分離結(jié)果(見圖2)，與特異RAPD標(biāo)記的分離情況進(jìn)行對比分析。
利用大豆孢囊線蟲特異性SCAR標(biāo)記引物，在65℃的退火溫度和35個循環(huán)的條件下擴(kuò)增，所有大豆孢囊線蟲群體都獲得500bp特異性SCAR標(biāo)記片段(圖2中1-7泳道)，而馬鈴薯金線蟲(圖2中8-9泳道)、馬鈴薯白線蟲(圖2中10-11泳道)和禾谷孢囊線蟲(圖2中12泳道)沒有獲得500bp SCAR標(biāo)記片段。說明本發(fā)明所構(gòu)建的SCAR標(biāo)記引物對大豆孢囊線蟲具有特異性，這是目前國際首例大豆孢囊囊線蟲特異性SCAR標(biāo)記引物。
實(shí)施例3特異性SCAR標(biāo)記引物與通用引物(D2A和D3B)一步雙重PGR方法檢測大豆孢囊線蟲本發(fā)明將構(gòu)建的大豆孢囊線蟲特異性SCAR標(biāo)記引物SCNFI、SCNRI與通用引物D2A和D3B等4個引物置于同一個PCR反應(yīng)中，SCNFI與SCNRI特異性擴(kuò)增大豆孢囊線蟲基因組DNA的SCAR標(biāo)記片段，引物D2A和D3B用于擴(kuò)增rDNA基因D2和D3擴(kuò)展區(qū)域的DNA片段。本發(fā)明所采用的一步雙重PCR方法為世界首例大豆孢囊線蟲分子診斷方法，此分子檢測方法含有基因組DNA和核糖體DNA兩個片段。
本發(fā)明的大豆孢囊線蟲分子檢測方法含用20μl的PCR反應(yīng)體系，配比如下10XPCR-buffer(含Mg++)2.0μl，dNTPs 1.6μl，D2A 0.2μl，D3B 0.2μl，SCNFI1 0.2μl，SCNRI 0.2μl，Taq DNA多聚酶0.2μl(5U/μl)，模板DNA2.0μl，滅菌重蒸水12.6μl。
PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性4min，然后94℃30S，65℃60S，72℃2min循環(huán)35次，72℃延伸10min后，4℃條件下保存。取3μl擴(kuò)增產(chǎn)物加1μl加樣緩沖液在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳，用1×TAE作為電泳緩沖液，100V下電泳40min，用EB染色，在紫光燈下觀測并照相。相同樣品的雙重PCR至少重復(fù)兩次以證實(shí)結(jié)果的準(zhǔn)確性。同一采樣地點(diǎn)的樣品的鑒定試驗(yàn)重復(fù)三次。
所應(yīng)用的大豆孢囊線蟲特異性SCAR標(biāo)記引物序列如下SCNFI 5’-GGA CCC TGA CCA AAA AGT TTC CGC-3’SCNRI 5’-GGA CCC TGA CGA GTT ATG GGC CCG-3’D2A 5′-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3′D3B 5′-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3′用特異性SCAR標(biāo)記引物SCNFI、SCNRI和D2A及D3B兩對引物在同一個PCR反應(yīng)體系中對53個孢囊線蟲群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增(見圖3，圖4，大豆孢囊線蟲SCN01，SCN02，SCN04，SCN06，SCN08，SCN09，SCN12，SCN13，SCN14，SCN15，SCN17，SCN18，SCN19，SCN20，SCN21，SCN22、SCN23，SCN24，SCN25，SCN26，SCN27，SCN28，SCN30，SCN31，SCN32，SCN33，SCN34，SCN35、SCN36等29個全部擴(kuò)增到特異性SCAR標(biāo)記的500bp片段(圖3中1-17，圖4中1-13)及D2和D3擴(kuò)展區(qū)的800bp兩個DNA片斷。
而馬鈴薯白線蟲群體PCNp1，PCNp2(圖4中14-15)、馬鈴薯金線蟲群體PCNr3，PCNr4(圖4中16-17)、甜菜孢囊線蟲群體BCN(圖4中18)和禾谷孢囊線蟲CCN01，CCN03，CCN05，CCN07，CCN09(圖4中19-23)等4種其它孢囊線蟲16個群體僅擴(kuò)增到D2和D3擴(kuò)展區(qū)的800bpDNA片斷，而沒有特異性SCAR標(biāo)記的500bp片段(見圖4)。說明本發(fā)明所構(gòu)建的SCAR標(biāo)記引物與通用引物(D2A和D3B)一步雙重PCR方法對大豆孢囊線蟲具有特異性，這是目前國際首例大豆孢囊線蟲特異性SCAR標(biāo)記引物與通用引物(D2A和D3B)一步雙重特異性檢測大豆孢囊線蟲的分子方法。
附本發(fā)明所涉及的核苷酸序列SEQ NO1大豆孢囊線蟲特異性SCAR標(biāo)記的全序列5’-GGACCCTGACCAAAAAGTTTCCGCTGGTAGGATTTTAAGTTGAAGTGTTGGCTAAAAGTTAAAAAAAATTCCAGGCCGCTATCTCTAACCCCCTGGGCTGGGTGCTTCTAGAACTTTTCAGTACCAACTTTGTCCAGTTCAGTCCACGTTGAATAACTCATTAGGCTTTGACCTGAGCGCAGGGTGGCCAGCAGACTTATTGTAGAGCTTTAAAAGCCCGATTTTTCCAAATTTTAAAATTTCGAAAATTTTCAAAATTTTTCGAGCTAGGCCTAAAAAACTGTTTTCGGGTTTTTGAATTTTAGGATTTTTTAACGAATTTTCCCAGAGAAACGGAGACCACTTCCAAAACATAGTTTTTCGAGCTCTATCGATTGGTAATTTTTTCGGAAAATTTTCGATTTTTTTTCGGAAATAGAAAAATTTTTTGGCCTCAGCGGGACATTTGAGTCCCGGGCCCATAACTCGTCAGGGTCC-3’大豆孢囊線蟲特異性SCAR標(biāo)記引物序列SEQ NO2上游引物SCNFI(5’-GGA CCC TGA CCA AAA AGT TTC CGC-3’)SEQ NO3下游引物SCNRI(5’-GGA CCC TGA CGA GTT ATG GGC CCG-3’)
權(quán)利要求
1.大豆孢囊線蟲特異性SCAR標(biāo)記，其特征在于該SCAR標(biāo)記具有SEQ NO1所示的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1所述的大豆孢囊線蟲特異性SCAR標(biāo)記的引物SCNFI和SCNRI，其核苷酸序列為SCNFI5’-GGA CCC TGA CCA AAA AGT TTC CGC-3’，SCNRI5’-GGA CCC TGA CGA GTT ATG GGC CCG-3’。
3.大豆孢囊線蟲SCAR標(biāo)記快速PCR檢測方法，其特征在于PCR反應(yīng)體系中含有權(quán)利要求2所述引物SCNFI和SCNRI。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的大豆孢囊線蟲SCAR標(biāo)記快速PCR檢測方法，所述PCR反應(yīng)體系中還含有通用引物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的大豆孢囊線蟲SCAR標(biāo)記快速PCR檢測方法，所述通用引物的核苷酸序列為D2A5′-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3′，D3B5′-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3′。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的大豆孢囊線蟲SCAR標(biāo)記快速PCR檢測方法，所述PCR檢測為一步雙重PCR檢測。
全文摘要
本發(fā)明為“大豆孢囊線蟲特異性SCAR標(biāo)記、特異性引物及快速PCR檢測方法”，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。大豆孢囊線蟲特異性SCAR標(biāo)記，其特征在于該SCAR標(biāo)記具有SEQ NO1所示的核苷酸序列。根據(jù)大豆孢囊線蟲特異性SCAR標(biāo)記設(shè)計的引物SCNF1和SCNR1，在PCR快速檢測大豆孢囊線蟲的方法中，可擴(kuò)增出500bp的片段，同時還可以在PCR反應(yīng)體系中加入引物D2A和D3B作為內(nèi)標(biāo)，能同時擴(kuò)增出800bp的片段。本發(fā)明提高了分子檢測靈敏度并且快速準(zhǔn)確，在大豆孢囊線蟲檢測和大豆孢囊線蟲病的早期診斷方面，具有很高的應(yīng)用價值。
文檔編號C12Q1/68GK1900282SQ20051001224
公開日2007年1月24日 申請日期2005年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月22日
發(fā)明者彭德良, 歐師琪 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所