專利名稱：一種蕎麥胰蛋白酶抑制劑及其表達(dá)和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體屬于一種蕎麥胰蛋白酶抑制劑(buckwheat TrypsinInhibitor，簡(jiǎn)稱BTI)及其表達(dá)、純化和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蛋白酶抑制劑是一類對(duì)專一性蛋白酶有抑制作用的蛋白質(zhì)。這類蛋白質(zhì)普遍存在于動(dòng)物、植物和微生物中，是自然界含量最為豐富的蛋白種類之一。它們?cè)隗w內(nèi)的作用是抑制某些蛋白酶的水解作用，從而保護(hù)機(jī)體功能蛋白的無(wú)意義降解。1995年Kennedy報(bào)道了大豆胰蛋白酶抑制劑對(duì)結(jié)腸腫瘤、肝腫瘤、口腔上皮腫瘤等具有不同程度的抑制作用。1996年他進(jìn)一步證實(shí)了來(lái)自大豆的Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制劑可防止導(dǎo)致癌變的特異基因的激活，保護(hù)組織免受輻射和自由基的損傷等。目前，蛋白酶抑制劑在醫(yī)學(xué)方面的作用受到世人的矚目，進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)蛋白酶抑制劑在對(duì)抗人類免疫缺陷病毒(HIV)感染疾病具有一定的療效。
蕎麥屬于蓼科植物，種子中含有多種生物活性物質(zhì)，包括生物類黃銅、胰蛋白酶抑制劑等。近幾年來(lái)，Belozersky和Dunaevsky等人從蕎麥中分離到幾種胰蛋白酶抑制劑，并采用質(zhì)譜、高壓液相色譜及蛋白質(zhì)序列測(cè)定等技術(shù)，對(duì)蕎麥胰蛋白酶抑制劑的生物化學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了研究。但有關(guān)重組蕎麥胰蛋白酶抑制劑的制備及其生物學(xué)功能報(bào)道很少，其對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，制備一種新型的胰蛋白酶抑制劑，并揭示它在體內(nèi)可能的生物學(xué)功能，對(duì)于豐富蛋白酶抑制劑的作用范圍，制備新的蛋白類抗腫瘤藥物具有重要的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種蕎麥胰蛋白酶抑制劑及其表達(dá)方法，和該胰蛋白酶抑制劑的用途。
本發(fā)明提供的一種蕎麥胰蛋白酶抑制劑(Buckweat Trypsin Inhibitor，簡(jiǎn)稱BTI)為生物體內(nèi)的一類小分子蛋白質(zhì)，含有69個(gè)氨基酸殘基，能特異性的抑制胰蛋白酶的活性。其氨基酸序列如下
LRQCSGKQEW PELVGERGSK AAKIIENENE DVRAIVLPEG SAVPRDLRCD50RVWVFVDERG VVVDTPVVM 69本發(fā)明提供的BTI的核苷酸序列由210個(gè)核苷酸組成，包括一個(gè)通順的閱讀框和終止密碼子TAA。其核苷酸序列如下CTGCGTCAGT GCTCCGGTAA ACAAGAATGG CCAGAGCTCG TTGGAGAGAG50AGGGTCCAAG GCTGCCAAGA TCATCGAAAA CGAGAACGAA GACGTGCGAG 100CTATCGTCTT GCCTGAGGGT AGCGCGGTGC CTAGAGACCT CCGATGTGAC 150CGTGTGTGGG TTTTCGTAGA CGAGCGAGGA GTTGTTGTTG ATACTCCTGT 200TGTTATGTAA 210一種含有編碼BTI的核苷酸序列的載體，它是將編碼BTI的核苷酸片段克隆至原核表達(dá)載體后獲得的重組子pQE-31-BTI。所述的載體，是質(zhì)粒，含有T7啟動(dòng)子。
一種BTI工程菌，它含有如前所述的載體。是將所述的pQE-31-BTI重組子轉(zhuǎn)化至一種菌中，例如大腸桿菌M15細(xì)胞中，構(gòu)建成工程菌，例如pQE-31-BTI/M15。
BTI的表達(dá)方法，優(yōu)選將pQE-31-BTI表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌M15，構(gòu)建大腸桿菌工程菌pQE-31-BTI/M15，將工程菌接種在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃，165r/min振蕩培養(yǎng)至O.D 600nm為0.5-0.7，加入IPTG使終濃度為0.5mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)2-4小時(shí)，收集菌體，破碎細(xì)胞，將上清液經(jīng)親和層析純化，合并每次柱洗脫獲得的目的蛋白，冷凍干燥后獲得產(chǎn)品。
BTI是胰蛋白酶抑制劑家族中的一個(gè)新成員，專一性的抑制實(shí)驗(yàn)表明該抑制劑以競(jìng)爭(zhēng)性抑制的方式與胰蛋白酶形成1∶1的復(fù)合物，抑制胰蛋白酶的水解作用。
采用MTT法和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)重組BTI的生物學(xué)活性研究，實(shí)驗(yàn)證明重組BTI作用于多發(fā)性骨髓瘤病人的IM-9細(xì)胞時(shí)，能有效的抑制IM-9細(xì)胞的生長(zhǎng)，當(dāng)BTI濃度在0.2g/L時(shí)，即顯示出一定的誘導(dǎo)IM-9細(xì)胞調(diào)亡的作用(見(jiàn)圖5)。該抑制劑可用于新型抗腫瘤藥物的制備。


附圖1BTI的氨基酸序列。
附圖2BTI的核苷酸序列。
附圖3BTI的SDS-PAGE電泳圖。
附圖4BTI的SDS-PAGE純度鑒定電泳圖。
附圖5BTI誘導(dǎo)IM-9腫瘤細(xì)胞的調(diào)亡形態(tài)圖(A.對(duì)照，B.0.2g/L BTI)
實(shí)施例1(1)BTI表達(dá)載體的構(gòu)建將實(shí)驗(yàn)室保存的pGEM-T-BTI和pQE31空載體分別用BamH I和Hind III雙酶切，用promega公司的膠回收試劑盒回收目的基因，通過(guò)T4 DNA連接酶與pQE31原核表達(dá)載體在4℃過(guò)夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，挑取陽(yáng)性克隆，進(jìn)行菌落PCR并對(duì)表達(dá)質(zhì)粒測(cè)序鑒定。經(jīng)DNA序列分析表明，蕎麥蛋白酶抑制劑基因已克隆至pQE31中，將此重組質(zhì)粒命名為pQE31-BTI。
(2)BTI的原核表達(dá)將重組質(zhì)粒pQE31-BTI轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15，構(gòu)建大腸桿菌工程菌株pQE-31-BTI/M15，將工程菌接種在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，選用不同的誘導(dǎo)時(shí)間(1h-7h)，不同的IPTG濃度(0.1-1.0)及16℃低溫誘導(dǎo)和37℃常溫誘導(dǎo)分別表達(dá)目的蛋白。通過(guò)優(yōu)化表達(dá)條件，選定IPTG的終濃度為0.2mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為4h，誘導(dǎo)溫度為37℃時(shí)BTI的表達(dá)量最高。進(jìn)一步收集菌體，超聲破碎細(xì)胞，13000r/min離心分離上清和沉淀。將上清和沉淀經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)表明，在凝膠圖譜上約10.0kD處出現(xiàn)一條新的蛋白帶，該蛋白的分子量與預(yù)計(jì)目的蛋白分子量大小相同(見(jiàn)圖3)。說(shuō)明本法構(gòu)建的原核表達(dá)載體在M15中能大量表達(dá)目的蛋白，且絕大部分以可溶的方式表達(dá)，表達(dá)量占菌體總蛋白的40％左右。
(3)BTI的純化將上述獲得的可溶性表達(dá)蛋白樣品通過(guò)Hitrap chelating親和柱，平衡后用0.5ml0.1mol/L鎳鹽溶液洗脫，收集目的蛋白，冷凍干燥即為重組蕎麥蛋白酶抑制劑產(chǎn)品。該產(chǎn)品經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)后在電泳圖譜上顯示單一條帶(見(jiàn)圖4)，經(jīng)蛋白質(zhì)含量分析表明，Ni金屬鰲和親和柱純化的目的蛋白回收率達(dá)到79％，證明本法建立的親和層析方法柱效應(yīng)高，利用本法只需一步純化即可獲得產(chǎn)量較高的目的蛋白純品。
純化的目的蛋白采用BApNA法進(jìn)行抑制劑活性分析，具體方法為在3ml反應(yīng)體系中先后加入底物BApNA、胰蛋白酶及本法制備的蕎麥蛋白酶抑制劑，在37℃條件下作用10分鐘，加入33％醋酸終止反應(yīng)，之后在410nm波長(zhǎng)下進(jìn)行比色分析。以不加抑制劑的體系為對(duì)照，比較各自的剩余酶活性。抑制活性的定義為每分鐘內(nèi)使每毫升反應(yīng)液在A410nm的吸收值降低.0.01為一個(gè)抑制活力單位(UI)，抑制比活力(UI/mg)為每毫克蛋白產(chǎn)生的抑制活力。具體測(cè)定參照Erlanger的方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，本法制備的重組蕎麥胰蛋白酶抑制劑能特異性的抑制胰蛋白酶的活性，并以競(jìng)爭(zhēng)性抑制的方式與胰蛋白酶形成1∶1的復(fù)合物，抑制胰蛋白酶對(duì)其底物BApNA的水解作用。
另外進(jìn)一步采用MTT法和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)重組BTI的生物學(xué)活性研究證明重組BTI作用于多發(fā)性骨髓瘤病人的IM-9細(xì)胞時(shí)，能有效的抑制IM-9細(xì)胞的生長(zhǎng)，當(dāng)BTI濃度在0.2g/L時(shí)，即顯示出一定的誘導(dǎo)IM-9細(xì)胞調(diào)亡的作用(見(jiàn)圖5)。該抑制劑可用于新型抗腫瘤藥物的制備。
本發(fā)明是按上述方案采用原核表達(dá)的方法構(gòu)建重組質(zhì)粒及工程菌株，批量表達(dá)目的蛋白，親和純化獲得純度較高的BTI，該蛋白可專一性的抑制胰蛋白酶的活性，誘導(dǎo)IM-9腫瘤細(xì)胞的調(diào)亡。是一種極具潛力及應(yīng)用前景的新型抗腫瘤藥物。
權(quán)利要求
1.一種蕎麥胰蛋白酶抑制劑，其特征在于具有如下氨基酸序列LRQCSGKQEW PELVGERGSK AAKIIENENE DVRAIVLPEG SAVPRDLRCD 50RVWVFVDERG VVVDTPVVM69。
2.編碼權(quán)利要求1的蕎麥胰蛋白酶抑制劑的核苷酸序列CTGCGTCAGT GCTCCGGTAA ACAAGAATGG CCAGAGCTCG TTGGAGAGAG 50AGGGTCCAAG GCTGCCAAGA TCATCGAAAA CGAGAACGAA GACGTGCGAG 100CTATCGTCTT GCCTGAGGGT AGCGCGGTGC CTAGAGACCT CCGATGTGAC 150CGTGTGTGGG TTTTCGTAGA CGAGCGAGGA GTTGTTGTTG ATACTCCTGT 200TGTTATGTAA 210。
3.一種載體，它含有權(quán)利要求2所述的核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求3所述的載體，是質(zhì)粒，含有T7啟動(dòng)子。
5.一種工程菌，其特征在于它含有權(quán)利要求3所述的載體。
6.權(quán)利要求5所述工程菌為原核表達(dá)系統(tǒng)。
7.權(quán)利要求6所述的原核表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于，表達(dá)步驟如下(a)構(gòu)建pQE-31-BTI表達(dá)載體；(b)按照標(biāo)準(zhǔn)法轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15，構(gòu)建大腸桿菌工程菌株pQE-31-BTI/M15，將工程菌接種在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃，165r/min振蕩培養(yǎng)至O.D 600nm為0.5-0.7，加入IPTG使終濃度為0.5mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)2-4小時(shí)；(c)、收集菌體，破碎細(xì)胞，將上清液經(jīng)親和層析純化，合并每次柱洗脫獲得的目的蛋白，冷凍干燥后獲得產(chǎn)品。
8.如權(quán)利要求1所述的蕎麥胰蛋白酶抑制劑可用于抑制胰蛋白酶的水解。
9.如權(quán)利要求1所述的蕎麥胰蛋白酶抑制劑可用于抗腫瘤藥物的制備。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種蕎麥胰蛋白酶抑制劑及其表達(dá)和產(chǎn)物在抑制胰蛋白酶水解中的應(yīng)用。本發(fā)明的胰蛋白酶抑制劑是一個(gè)由69個(gè)氨基酸組成的小分子蛋白，分子量約10kD。該胰蛋白酶抑制劑對(duì)胰蛋白酶具有明顯的抑制作用，以競(jìng)爭(zhēng)性抑制的方式與胰蛋白酶形成1∶1的復(fù)合物，抑制胰蛋白酶的水解。蕎麥胰蛋白酶抑制劑具有一定的促進(jìn)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡的作用，可用于新型抗腫瘤藥物的制備。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1718241SQ20051001238
公開(kāi)日2006年1月11日 申請(qǐng)日期2005年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月12日
發(fā)明者王轉(zhuǎn)花, 張政, 李玉英, 史曉儒 申請(qǐng)人:山西大學(xué)