專利名稱：用于制備他克莫司的菌種誘變方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于制備他克莫司的菌種誘變方法，屬于菌種的誘變選育技術(shù)。
背景技術(shù)：
自上世紀(jì)九十年代以來(lái)，我國(guó)器官移植工作已躍居亞洲首位，全國(guó)有100多家醫(yī)院和200多位專家能進(jìn)行25種同種異體器官移植。免疫抑制劑是進(jìn)行器官移植的必需藥物。環(huán)孢菌素等免疫抑制劑由于其腎毒性使其應(yīng)用受到限制，新型免疫抑制劑的需求迫切。眾多應(yīng)運(yùn)而生的許多新型免疫抑制劑在我國(guó)成功上市銷(xiāo)售，其中以FK506(Tacrolimus)增長(zhǎng)最快。FK506的中文名稱為他克莫司，其商品名為譜樂(lè)可復(fù)(Prograf)。與環(huán)孢菌素相比，他克莫司有如下特點(diǎn)①免疫抑制作用強(qiáng)；②肝腎移植受體的急、慢性排斥反應(yīng)小；③對(duì)細(xì)菌和病毒的抵抗力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已成為肝臟及腎臟移植后排斥反應(yīng)的臨床一線藥物，并將成為治療特應(yīng)性皮炎的首選藥物。
盡管?chē)?guó)內(nèi)已有制備他克莫司的菌種，但該菌為未經(jīng)有效的正誘變的普通菌株，制備他克莫司能力弱，效能低。其原始模式菌株為“筑波鏈霉菌”，拉丁文名稱為“Streptomyces tsukubaensis”。
激光誘變技術(shù)在微生物誘變育種中的應(yīng)用較為廣泛，其作用于微生物細(xì)胞產(chǎn)生光、熱、壓力、電磁場(chǎng)、弱磁場(chǎng)作用等，改變了微生物細(xì)胞中DNA和RNA遺傳密碼的次序，引起變異。陳哲超等用半導(dǎo)體激光誘變處理果膠酶產(chǎn)生菌——黑曲霉，可使果膠酶產(chǎn)量提高3倍。韓建榮等采用激光對(duì)青霉PT95菌株的原生質(zhì)體進(jìn)行了誘變處理，選育到一株類(lèi)胡蘿卜素提高28.3％的突變菌株。而把激光應(yīng)用在生產(chǎn)他克莫司菌種的選育方面，則未見(jiàn)相關(guān)專利和文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種用于制備他克莫司的菌種誘變方法，依此方法誘變的菌種可以有效地提高他克莫司的產(chǎn)量。
本發(fā)明的目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明對(duì)制備他克莫司的原始模式菌進(jìn)行誘變，該模式菌為筑波鏈霉菌(Streptomyces tsukubaensis)。該菌種誘變方法其特征在于包括以下過(guò)程在室溫下，取斜面孢子用無(wú)菌水制成孢子懸液，將懸液分裝于無(wú)菌玻璃試管內(nèi)，采用波長(zhǎng)為632.8nmHe-Ne功率10～30mW下，對(duì)該孢子輻照5～25min，然后把經(jīng)輻照處理的孢子懸液經(jīng)無(wú)菌水稀釋100～10000倍后，涂布于高氏一號(hào)培養(yǎng)基平板中培養(yǎng)，從中獲得誘變的遺傳性狀穩(wěn)定、發(fā)酵單位提高5～30％的純菌筑波鏈霉菌。
本發(fā)明的采用He-Ne激光照射的方式進(jìn)行對(duì)制備他克莫司的菌種進(jìn)行激光誘變的誘變方法，激光誘變?cè)O(shè)備簡(jiǎn)單、方法易行、操作安全，其誘變效果遠(yuǎn)較傳統(tǒng)的物理化學(xué)誘變方法好，在微生物制藥菌種選育中有較大的推廣價(jià)值。本發(fā)明通過(guò)利用He-Ne激光輻照進(jìn)行誘變，可選育出高產(chǎn)免役抑制劑他克莫司鏈霉菌突變株。突變株正變率5～25％。發(fā)酵單位同原始菌株相比，提高5～30％。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施例1在室溫下，取斜面用無(wú)菌水制成105～107個(gè)孢子/mL的懸液5mL置于直徑2cm無(wú)菌小試管內(nèi)，進(jìn)行He-Ne激光(λ＝632.8nm)輻照5min，輻照功率10mW，處理后的懸液涂布于平板。突變株正變率6～8％。發(fā)酵單位提高12～13％。
實(shí)施例2在室溫下，取斜面孢子用無(wú)菌水制成105～107個(gè)孢子/mL懸液，取上述經(jīng)He-Ne激光輻照的懸液5mL置于直徑2cm無(wú)菌小試管內(nèi)進(jìn)行He-Ne激光(λ＝632.8nm)輻照5min，輻照功率20mW處理后的懸液涂布于平板。突變株正變率12～13％。發(fā)酵單位提高17～18％。
實(shí)施例3在室溫下，取斜面孢子用無(wú)菌水制成105～107個(gè)孢子/mL懸液，取上述經(jīng)He-Ne激光輻照的懸液5mL置于直徑2cm無(wú)菌小試管內(nèi)進(jìn)行He-Ne激光(λ＝632.8nm)輻照15min，輻照功率20mW處理后的懸液涂布于平板。突變株正變率22～23％。發(fā)酵單位提高27～28％。
實(shí)施例4在室溫下，取斜面孢子用無(wú)菌水制成105～107個(gè)孢子/mL懸液，取上述經(jīng)He-Ne激光輻照的懸液5mL置于直徑2cm無(wú)菌小試管內(nèi)進(jìn)行He-Ne激光(λ＝632.8nm)輻照15min，輻照功率30mW處理后的懸液涂布于平板。突變株正變率17～18％，發(fā)酵單位提高12～13％。
實(shí)施例5在室溫下，取斜面孢子用無(wú)菌水制成105～107個(gè)孢子/mL懸液，取上述經(jīng)He-Ne激光輻照的懸液5mL置于直徑2cm無(wú)菌小試管內(nèi)進(jìn)行He-Ne激光(λ＝632.8nm)輻照25min，輻照功率10mW處理后的懸液涂布于平板。突變株正變率17～18％，發(fā)酵單位提高12～13％。
實(shí)施例6在室溫下，取斜面孢子用無(wú)菌水制成105～107個(gè)孢子/mL懸液，取上述經(jīng)He-Ne激光輻照的懸液5mL置于直徑2cm無(wú)菌小試管內(nèi)進(jìn)行He-Ne激光(λ＝632.8nm)輻照25min，輻照功率30mW處理后的懸液涂布于平板。突變株正變率7～8％，發(fā)酵單位提高7～8％。
權(quán)利要求
1.一種用于制備他克莫司的菌種誘變方法，其特征在于包括以下過(guò)程在室溫下，取斜面孢子用無(wú)菌水制成105～107個(gè)孢子/mL懸液，將懸液分裝于無(wú)菌玻璃試管內(nèi)，采用波長(zhǎng)為632.8nmHe-Ne激光在照射功率10～30mW下，對(duì)該孢子輻照5～25min，然后把經(jīng)激光輻照處理的孢子懸液經(jīng)無(wú)菌水稀釋100～10000倍后，涂布于高氏一號(hào)培養(yǎng)基平板中培養(yǎng)，從中獲得誘變的遺傳性狀穩(wěn)定、發(fā)酵單位提高5～30％的純菌筑波鏈霉菌(Streptomycestsukubaensis)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用于制備他克莫司的菌種誘變方法，屬于菌種的誘變選育技術(shù)。該方法包括以下過(guò)程在室溫下，取斜面孢子用無(wú)菌水制成孢子懸液，將懸液分裝于無(wú)菌玻璃試管內(nèi)，采用He－Ne激光輻照一定時(shí)間，然后把經(jīng)激光輻照處理的孢子懸液經(jīng)無(wú)菌水稀釋后，涂布于高氏一號(hào)培養(yǎng)基平板中培養(yǎng)，從中獲得誘變的遺傳性狀穩(wěn)定的純筑波鏈霉菌。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于采用的激光誘變?cè)O(shè)備簡(jiǎn)單、方法易行、操作安全，其誘變效果遠(yuǎn)較傳統(tǒng)的物理化學(xué)誘變方法好，依此方法誘變得到的筑波鏈霉菌，同原始菌株相比，發(fā)酵單位提高5～30％。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1687398SQ20051001332
公開(kāi)日2005年10月26日 申請(qǐng)日期2005年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月15日
發(fā)明者聞建平, 盧文玉, 馮偉, 財(cái)音青格樂(lè) 申請(qǐng)人:天津大學(xué)