專(zhuān)利名稱(chēng)：枯草芽孢桿菌突變株、選育方法和該菌在發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是腺苷生產(chǎn)菌即枯草芽孢桿菌突變株，以及其選育方法和用該菌發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷。
背景技術(shù)：
腺苷(Adenosine)屬于重要的核苷酸衍生物，在生理生化過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用，具有廣泛的藥用價(jià)值。在美國(guó)，腺苷是經(jīng)FDA批準(zhǔn)的治療PSVT的一線藥物，也是經(jīng)FDA批準(zhǔn)的用于心臟藥物負(fù)荷試驗(yàn)的兩種藥物之一，已成為急診處理快速性心律失常和藥物負(fù)荷試驗(yàn)的常規(guī)用藥。發(fā)酵法大規(guī)模生產(chǎn)出腺苷在我國(guó)尚屬空白，目前國(guó)內(nèi)腺苷的生產(chǎn)主要是化學(xué)法和酶法，成本高、污染嚴(yán)重，推廣應(yīng)用受到嚴(yán)重的限制。原料來(lái)源廣泛、成本低、產(chǎn)品純度高、反映條件溫和的發(fā)酵法已是研究的大勢(shì)所趨。許多大專(zhuān)院校和研究機(jī)構(gòu)都在從事此領(lǐng)域的研究。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有腺苷的生產(chǎn)成本高、污染嚴(yán)重，推廣應(yīng)用受到嚴(yán)重限制的問(wèn)題，提供一種腺苷生產(chǎn)菌的選育及其選育方法和用該菌發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷。
本實(shí)驗(yàn)室(天津科技大學(xué)代謝控制發(fā)酵研究室)利用枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)ATCC 6872(保藏于美國(guó)菌種保藏中心)經(jīng)多次改良獲得一株肌苷生產(chǎn)菌TX-1(保藏于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)CICC-10082)，，是腺嘌呤(Ade)、組氨酸(His)、黃嘌呤(Xan)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型，即需要這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)才能維持生長(zhǎng)和積累高水平的肌苷。同時(shí)枯草芽孢桿菌TX-1還具有8-氮鳥(niǎo)嘌呤(8-AG)、6-巰基嘌呤(6-MP)、磺胺胍(SG)抗性。通過(guò)測(cè)定，其腺苷產(chǎn)量幾乎為零。
本發(fā)明在枯草芽孢桿菌TX-1的基礎(chǔ)上提出一種突變株Hj04130，即本菌株是以枯草芽孢桿菌TX-1為出發(fā)菌株，經(jīng)硫酸二乙酯(DES)誘變處理后再在培養(yǎng)基中添加異亮氨酸和纈氨酸作為補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，經(jīng)培養(yǎng)篩選和復(fù)篩獲得，對(duì)其遺傳標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證，確定其仍具有6-巰基嘌呤抗性，其遺傳標(biāo)記為Ile-+Val-+6-MPr。
本發(fā)明以枯草芽孢桿菌TX-1為出發(fā)菌株，旨在利用TX-1從葡萄糖到肌苷酸代謝主流的高通量來(lái)奠定進(jìn)一步提高腺苷的產(chǎn)量的基礎(chǔ)。
枯草芽孢桿菌HJ04130的選育方法，包括1)出發(fā)菌株選取選取枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)TX-1，是腺嘌呤(Ade)、組氨酸(His)、黃嘌呤(Xan)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型，同時(shí)TX-1還具有8-氮鳥(niǎo)嘌呤(8-AG)、6-巰基嘌呤(6-MP)、磺胺胍(SG)抗性；2)培養(yǎng)基的配制——斜面培養(yǎng)基牛肉膏8-20g，蛋白胨2-5g，酵母浸膏粉3-7g，NaCl1.0-5.0g，瓊脂15-30g，自來(lái)水定容至1L，pH7.0-7.2；—種子培養(yǎng)基葡萄糖30-60g，KH2PO42.0-5.0g，MgSO4·7H2O 0.5-0.8g，NH4Cl 3.0-6.0g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005-0.02g，MnSO4·7H2O 0.005-0.02g，豆餅水解液30-50ml，酵母浸膏粉0.1-0.7，尿素1.0-4.0，鳥(niǎo)嘌呤0.05-0.2g，自來(lái)水定容至1L，pH7.0-7.2；——發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖70-100g，KH2PO40.5-3.0g，NHCl 10-25g，MgSO4·7H2O 0.2-0.5g，豆餅水解液30-50ml，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005-0.02g，MnSO4·H2O 0.005-0.02g，鳥(niǎo)嘌呤0.05-0.2g，CaCl23-8g，CaCO320-35g，搖瓶時(shí)添加；異亮氨酸和纈氨酸各自的添加量為0-0.04g，自來(lái)水定容至1L，pH7.0-7.2；——基本培養(yǎng)基(MM)葡萄糖l0-30g，NH4Cl 3-8g，KH2PO40.5-2g，MgSO40.2-0.5g，檸檬酸鈉0.2-1.0g，谷氨酸鈉0.5-2.0g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005-0.02g，MnSO4·H2O 0.005-0.02g，pH7.0-7.2；——篩選培養(yǎng)基在MM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加0.015-0.040g異亮氨酸和0.015-0.040g纈氨酸；——完全培養(yǎng)基(CM)葡萄糖0.5-5g，蛋白胨5-15g，牛肉膏5-15g，酵母膏3-10g，NaCl 5-20g，pH7.0-7.2；——基本培養(yǎng)基、篩選培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基在配制固體平板培養(yǎng)基時(shí)須添加1.5-3.0％的瓊脂；3)突變株的誘變和分離篩選——從新鮮斜面上接一環(huán)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)TX-1菌種入種子培養(yǎng)基25-35mL/500mL錐形瓶，在30-34℃、160-200r/min下培養(yǎng)12-16h；——離心收集細(xì)胞，用無(wú)菌生理鹽水洗滌。然后，用0.1mol/L、pH7.0-7.2磷酸緩沖液洗滌一次后，將打散的細(xì)胞懸液懸浮于20-30ml含有1.5-2.5ml硫酸二乙酯(DES)的0.1mol/L、pH7.0-7.2磷酸緩沖液溶液中，30-34℃下振蕩處理0.25-1h；——反應(yīng)用10-15mL的硫代硫酸鈉溶液稀釋10倍終止反應(yīng)，離心收集細(xì)胞，用無(wú)菌生理鹽水洗滌后將其接入種子培養(yǎng)基中作中間培養(yǎng)24小時(shí)；——然后稀釋涂布CM平板，30-34℃下培養(yǎng)48h；——挑去CM平板上菌落圈大的菌落，對(duì)應(yīng)點(diǎn)種在CM、MM平板和篩選平板，挑取CM和篩選平板上生長(zhǎng)而在MM平板上不生長(zhǎng)的菌落或生長(zhǎng)較微弱的菌落，接種于斜面培養(yǎng)基，于30-34℃培養(yǎng)12-48h；——然后，每株接一環(huán)入發(fā)酵培養(yǎng)基，根據(jù)腺苷產(chǎn)量的高低來(lái)確定復(fù)篩用的菌株，復(fù)篩前，對(duì)復(fù)篩用菌株的氨基酸缺陷型遺傳標(biāo)記要進(jìn)行確認(rèn)，復(fù)篩時(shí)，將每株菌在斜面上連續(xù)傳代十次，每株接3瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，考察每一代的腺苷生產(chǎn)能力，根據(jù)腺苷產(chǎn)量高低和產(chǎn)苷穩(wěn)定性來(lái)篩選確定菌株，得到HJ04130異亮氨酸和纈氨酸缺陷腺苷生產(chǎn)菌。
——以枯草芽孢桿菌HJ04130作為發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷的菌株，接一環(huán)HJ04130于25-35mL/500mL盛有發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中，30-34℃，轉(zhuǎn)速200-240rpm下，發(fā)酵培養(yǎng)48-64小時(shí)，制得腺苷。
本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)和積極效果從枯草芽孢桿菌(Bacilus subtilis)TX-1選育的異亮氨酸和纈氨酸缺陷型菌株HJ04130，表現(xiàn)出積累更高水平腺苷的能力，這是由于相對(duì)于出發(fā)菌株來(lái)說(shuō)其IMP脫氫酶活力被降低了許多，在培養(yǎng)基中添加微量異亮氨酸和纈氨酸激活了IMP脫氫酶。用該菌已通過(guò)搖瓶水平、5L發(fā)酵罐水平的發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷的試驗(yàn)，具有一定的工業(yè)實(shí)用性價(jià)值。本發(fā)明提供的腺苷生產(chǎn)方法原料來(lái)源廣泛、成本低、產(chǎn)品純度高、反映條件溫和。
具體實(shí)施方式實(shí)施例1枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HJ04130的選育方法1)出發(fā)菌株選取
選取枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)TX-1；2)培養(yǎng)基的配制——斜面培養(yǎng)基牛肉膏10g，蛋白胨4g，酵母浸膏粉5g，NaCl 2.5g，瓊脂20g，自來(lái)水定容至1L，pH7.0；——種子培養(yǎng)基葡萄糖40g，KH2PO43.0g，MgSO4·7H2O 0.6g，NH4Cl5.0g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，MnSO4·7H2O 0.01g，豆餅水解液40ml，酵母浸膏粉0.5，尿素2.0，鳥(niǎo)嘌呤0.1g，自來(lái)水定容至1L，pH7.0；——發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖80g，KH2PO41.0g，NH4Cl 15g，MgSO4·7H2O 0.4g，豆餅水解液40ml，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，MnSO4·H2O 0.01g，鳥(niǎo)嘌呤0.1g，CaCl25g，CaCO330g，搖瓶時(shí)添加；異亮氨酸和纈氨酸各自的最佳添加量為0.015g，二者的混合比例為1∶1，自來(lái)水定容至1L，pH7.0-7.2；——基本培養(yǎng)基(MM)葡萄糖20g，NH4Cl 5g，KH2PO41g，MgSO40.4g，檸檬酸鈉0.5g，谷氨酸鈉0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，MnSO4·H2O 0.01g，pH7.0-7.2；——篩選培養(yǎng)基在MM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加0.02g異亮氨酸和0.02g纈氨酸；——完全培養(yǎng)基(CM)葡萄糖1g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，NaCl 5g，pH7.0-7.2；—基本培養(yǎng)基、篩選培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基在配制固體平板培養(yǎng)基時(shí)須添加2.0％的瓊脂；3)突變株的誘變和分離篩選——從新鮮斜面上接一環(huán)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)TX-1菌種入種子培養(yǎng)基30mL/500mL錐形瓶，在34℃、160r/min下培養(yǎng)12h；——離心收集細(xì)胞，用無(wú)菌生理鹽水洗滌三次然后，用0.1mol/L、pH7.0-7.2磷酸緩沖液洗滌一次后，將打散的細(xì)胞懸液懸浮于30ml含有2.0ml硫酸二乙酯(DES)的0.1mol/L、pH7.0-7.2磷酸緩沖液溶液中，32℃下振蕩處理0.25-1h；——反應(yīng)用10mL的硫代硫酸鈉溶液稀釋10倍終止反應(yīng)，離心收集細(xì)胞，用無(wú)菌生理鹽水洗滌后將其接入種子培養(yǎng)基中作中間培養(yǎng)24小時(shí)；
——然后稀釋涂布CM平板，32℃下培養(yǎng)48h；——挑去CM平板上菌落圈大的菌落，對(duì)應(yīng)點(diǎn)種在CM、MM平板和篩選平板，挑取CM和篩選平板上生長(zhǎng)而在MM平板上不生長(zhǎng)的菌落或生長(zhǎng)較微弱的菌落，接種于斜面培養(yǎng)基，于34℃培養(yǎng)48h；——然后，每株接一環(huán)入發(fā)酵培養(yǎng)基，根據(jù)腺苷產(chǎn)量的高低來(lái)確定復(fù)篩用的菌株，復(fù)篩前，對(duì)復(fù)篩用菌株的氨基酸缺陷型遺傳標(biāo)記要進(jìn)行確認(rèn)，復(fù)篩時(shí)，將每株菌在斜面上連續(xù)傳代十次，每株接3瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，考察每一代的腺苷生產(chǎn)能力，根據(jù)腺苷產(chǎn)量高低和遺產(chǎn)穩(wěn)定性(以產(chǎn)量≥5g/L，連續(xù)傳代10次遺傳標(biāo)記不丟失為標(biāo)準(zhǔn))來(lái)篩選確定菌株，得到HJ04130異亮氨酸和纈氨酸缺陷腺苷生產(chǎn)菌。
通過(guò)重復(fù)誘變處理，能得到HJ04130異亮氨酸和纈氨酸缺陷腺苷生產(chǎn)菌。用該菌已經(jīng)通過(guò)搖瓶水平、5L發(fā)酵罐水平的發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷的試驗(yàn)，具有工業(yè)實(shí)用性價(jià)值。
分析方法將含有8mL發(fā)酵液的塑料離心管置于臺(tái)式高速離心機(jī)(TGL-16G)中，于8000r/min下離心5min，取上清液備用。
腺苷濃度和葡萄糖濃度分別采用高效液相色譜法和SBA-40C多功能生物傳感分析儀測(cè)定。
菌體濃度用OD620測(cè)定。
在搖瓶水平上考察原種和突變株的腺苷發(fā)酵性能，結(jié)果列于表1。從表1中看出，突變株的腺苷產(chǎn)量要高出許多，產(chǎn)率也高出許多。對(duì)突變株進(jìn)行傳代實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)突變株HJ04130在傳代過(guò)程中腺苷產(chǎn)生能力強(qiáng)且穩(wěn)定。
表1 原種與突變株發(fā)酵腺苷的性能比較菌號(hào) 腺苷產(chǎn)量(g/L) 糖苷轉(zhuǎn)化率(g/g)出發(fā)菌株 0 0HJ041306.5 0.08突變株HJ04130的傳代實(shí)驗(yàn)對(duì)突變株HJ04130進(jìn)行反復(fù)傳代，在搖瓶水平上測(cè)定其積累腺苷的能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)如表2所示。HJ04130的遺傳、發(fā)酵性能穩(wěn)定，是一支較好的腺苷產(chǎn)生菌。
世代12345678910遺傳標(biāo)記++++++++++產(chǎn)量(g/L) 6.52 6.58 6.50 6.50 6.53 6.58 6.52 6.51 6.50 6.54實(shí)施例2、HJ04130的選育選取枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)TX-1，選育過(guò)程同例1。通過(guò)反復(fù)誘變處理，得到Ile-+Val-+6-MPr。在MM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加0.02g異亮氨酸和0.02g纈氨酸；從新鮮斜面培養(yǎng)基上接一環(huán)HJ04130菌種入發(fā)酵培養(yǎng)基(30ml/500ml錐形瓶)，發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖80g，KH2PO41.0g，NH4Cl 15g，MgSO4·7H2O 0.4g，豆餅水解液40ml，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，MnSO4·H2O 0.01g，鳥(niǎo)嘌呤0.1g，CaCl25g，CaCO330g，自來(lái)水定容至1L，pH7.0-7.2；搖瓶培養(yǎng)500ml錐形瓶?jī)?nèi)發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為30ml，發(fā)酵溫度為34℃，轉(zhuǎn)速為220rpm，發(fā)酵時(shí)間為48h，腺苷最高產(chǎn)量為6-52g/L，對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)化率為0.08g/g。
實(shí)施例3、以HJ04130發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷從新鮮斜面上接一環(huán)HJ04130菌種入種子培養(yǎng)基(30ml/500ml錐形瓶)，在34℃，160rpm下培養(yǎng)11h后，以10％接種量(V/V)接入發(fā)酵培養(yǎng)基。斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基組成——斜面培養(yǎng)基牛肉膏10g，蛋白胨4g，酵母浸膏粉5g，NaCl 2.5g，瓊脂20g，自來(lái)水定容至1L，pH7.0；——種子培養(yǎng)基葡萄糖40g，KH2PO43.0g，MgSO4·7H2O 0.6g，NH4Cl5.0g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，MnSO4·7H2O 0.01g，豆餅水解液40ml，酵母浸膏粉0.5，尿素2.0，鳥(niǎo)嘌呤0.1g，自來(lái)水定容至1L，pH7.0；——發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖90g，KH2PO41.0g，NH4Cl 15g，MgSO4·7H2O 1.2g，豆餅水解液35ml，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，MnSO4·H2O 0.01g，鳥(niǎo)嘌呤0.1g，CaCl25g，CaCO320g，搖瓶時(shí)添加；異亮氨酸和纈氨酸各自的最佳添加量為0.015g，二者的混合比例為1∶1，自來(lái)水定容至1L，pH7.0-7.2；搖瓶培養(yǎng)500ml錐形瓶?jī)?nèi)發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為30ml，發(fā)酵溫度為34℃，轉(zhuǎn)速為220rpm，發(fā)酵時(shí)間為48h，腺苷最高產(chǎn)量為7.7g/L，對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)化率為0.09g/g。
實(shí)施例4、以HJ04130在5L發(fā)酵罐合成腺苷斜面和種子培養(yǎng)基組成及其培養(yǎng)條件同實(shí)施例3，發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖90g，KH2PO41.0g，NH4Cl 7.5g，MgSO4·7H2O 1.2g，豆餅水解液35ml，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，MnSO4·H2O 0.01g，鳥(niǎo)嘌呤0.1g，CaCl25g，異亮氨酸和纈氨酸各自的最佳添加量為0.015g，二者的混合比例為1∶1，自來(lái)水定容至1L，pH7.0-7.2；5L發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基體積為3L。通氣量為3L/min，攪拌轉(zhuǎn)速前16h為350rpm，16h后每隔4小時(shí)(視發(fā)酵情況而定)轉(zhuǎn)速增加50rpm，增至700rpm為止。用6mol/L的NaOH或氨水控制pH在6.7-7.0，發(fā)酵溫度為32-34℃，發(fā)酵設(shè)備為上海保興生物設(shè)備工程有限公司生產(chǎn)的型號(hào)為Bio-2002的全自動(dòng)發(fā)酵罐。發(fā)酵時(shí)間為64-72h。腺苷最高產(chǎn)量為16g/L，對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)化率為0.2g/g。
權(quán)利要求
1.一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)突變株HJ04130，本菌株是以枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)TX-1(保藏于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)CICC-10082)為出發(fā)菌株，經(jīng)硫酸二乙酯(DES)誘變處理后再在培養(yǎng)基中添加異亮氨酸和纈氨酸作為補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，經(jīng)培養(yǎng)篩選和復(fù)篩獲得，對(duì)其遺傳標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證，確定其仍具有6-巰基嘌呤抗性，其遺傳標(biāo)記為Ile-+Val-+6-MPr。
2.一種枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HJ04130的選育方法，其特征在于包括1)出發(fā)菌株選取選取枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)TX-1(保藏于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)CICC-10082)，是腺嘌呤(Ade)、組氨酸(His)、黃嘌呤(Xan)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型，同時(shí)TX-1還具有8-氮鳥(niǎo)嘌呤(8-AG)、6-巰基嘌呤(6-MP)、磺胺胍(SG)抗性；2)培養(yǎng)基的配制——斜面培養(yǎng)基牛肉膏8-20g，蛋白胨2-5g，酵母浸膏粉3-7g，NaCl1.0-5.0g，瓊脂15-30g，自來(lái)水定容至1L，pH7.0-7.2；——種子培養(yǎng)基葡萄糖30-60g，KH2PO42.0-5.0g，MgSO4·7H2O 0.5-0.8g，NH4Cl 3.0-6.0g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005-0.02g，MnSO4·7H2O 0.005-0.02g，豆餅水解液30-50ml，酵母浸膏粉0.1-0.7，尿素1.0-4.0，鳥(niǎo)嘌呤0.05-0.2g，自來(lái)水定容至1L，pH7.0-7.2；——發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖70-100g，KH2PO40.5-3.0g，NH4Cl 10-25g，MgSO4·7H2O 0.2-0.5g，豆餅水解液30-50ml，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005-0.02g，MnSO4·H2O 0.005-0.02g，鳥(niǎo)嘌呤0.05-0.2g，CaCl23-8g，CaCO320-35g，搖瓶時(shí)添加；異亮氨酸和纈氨酸各自的添加量為0-0.04g，自來(lái)水定容至1L，pH7.0-7.2；——基本培養(yǎng)基(MM)葡萄糖10-30g，NH4Cl 3-8g，KH2PO40.5-2g，MgSO40.2-0.5g，檸檬酸鈉0.2-1.0g，谷氨酸鈉0.5-2.0g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.005-0.02g，MnSO4·H2O 0.005-0.02g，pH7.0-7.2；——篩選培養(yǎng)基在MM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加0.015-0.040g異亮氨酸和0.015-0.040g纈氨酸；——完全培養(yǎng)基(CM)葡萄糖0.5-5g，蛋白胨5-15g，牛肉膏5-15g，酵母膏3-10g，NaCl 5-20g，pH7.0-7.2；——基本培養(yǎng)基、篩選培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基在配制固體平板培養(yǎng)基時(shí)須添加1.5-3.0％的瓊脂；3)突變株的誘變和分離篩選——從新鮮斜面上接一環(huán)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)TX-1菌種入種子培養(yǎng)基25-35mL/500mL錐形瓶，在30-34℃、160-200r/min下培養(yǎng)12-16h；——離心收集細(xì)胞，用無(wú)菌生理鹽水洗滌。然后，用0.1mol/L、pH7.0-7.2磷酸緩沖液洗滌一次后，將打散的細(xì)胞懸液懸浮于20-30ml含有1.5-2.5ml硫酸二乙酯(DES)的0.1mol/L、pH7.0-7.2磷酸緩沖液溶液中，30-34℃下振蕩處理0.25-1h；——反應(yīng)用10-15mL的硫代硫酸鈉溶液稀釋10倍終止反應(yīng)，離心收集細(xì)胞，用無(wú)菌生理鹽水洗滌后將其接入種子培養(yǎng)基中作中間培養(yǎng)24小時(shí)；——然后稀釋涂布CM平板，30-34℃下培養(yǎng)48h；——挑去CM平板上菌落圈大的菌落，對(duì)應(yīng)點(diǎn)種在CM、MM平板和篩選平板，挑取CM和篩選平板上生長(zhǎng)而在MM平板上不生長(zhǎng)的菌落或生長(zhǎng)較微弱的菌落，接種于斜面培養(yǎng)基，于30-34℃培養(yǎng)12-48h；——然后，每株接一環(huán)入發(fā)酵培養(yǎng)基，根據(jù)腺苷產(chǎn)量的高低來(lái)確定復(fù)篩用的菌株，復(fù)篩前，對(duì)復(fù)篩用菌株的氨基酸缺陷型遺傳標(biāo)記要進(jìn)行確認(rèn)，復(fù)篩時(shí)，將每株菌在斜面上連續(xù)傳代十次，每株接3瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，考察每一代的腺苷生產(chǎn)能力，根據(jù)腺苷產(chǎn)量高低和產(chǎn)苷穩(wěn)定性來(lái)篩選確定菌株，得到HJ04130異亮氨酸和纈氨酸缺陷腺苷生產(chǎn)菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的枯草芽孢桿菌HJ04130的選育方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加異亮氨酸和纈氨酸各為0.015g。
4.枯草芽孢桿菌HJ04130的用途，其特征是用HJ04130作為發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷的菌株，發(fā)酵培養(yǎng)基見(jiàn)權(quán)利要求2所述發(fā)酵培養(yǎng)基，接一環(huán)HJ04130于25-35mL/500mL盛有發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中，30-34℃，轉(zhuǎn)速200-240rpm下，發(fā)酵培養(yǎng)48-64小時(shí)，制得腺苷。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的枯草芽孢桿菌HJ04130的用途，其特征是用HJ04130作為發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷的菌株，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.015g/L的異亮氨酸和0.015g/L纈氨酸作為補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)最佳。
全文摘要
枯草芽孢桿菌突變株、選育方法和該菌在發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷中的應(yīng)用。解決現(xiàn)有腺苷的生產(chǎn)成本高、污染嚴(yán)重，推廣應(yīng)用受到嚴(yán)重限制的問(wèn)題。本發(fā)明以枯草芽孢桿菌TX－1為出發(fā)菌株，經(jīng)硫酸二乙酯(DES)誘變處理后再在培養(yǎng)基中添加異亮氨酸和纈氨酸作為補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，經(jīng)培養(yǎng)篩選和復(fù)篩獲得，對(duì)其遺傳標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證，確定其仍具有6－巰基嘌呤抗性，其遺傳標(biāo)記為Ile
文檔編號(hào)C12P19/38GK1724646SQ200510013900
公開(kāi)日2006年1月25日 申請(qǐng)日期2005年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月24日
發(fā)明者陳寧, 黃金, 劉淑云 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)