專利名稱：利用水稻胚乳細(xì)胞作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組人血清白蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，它涉及到利用谷物種子水稻胚乳細(xì)胞作為生物反應(yīng)器來生產(chǎn)醫(yī)用的重組人血清白蛋白的方法。即以水稻作為宿主，以胚乳細(xì)胞作為生物反應(yīng)器，通過DNA重組技術(shù)，將水稻胚乳細(xì)胞特異性表達(dá)人血清白蛋白的載體導(dǎo)入水稻細(xì)胞，在轉(zhuǎn)基因水稻的胚乳細(xì)胞中特異性表達(dá)和大量積累人血清白蛋白的方法以及由該方法所生產(chǎn)的植物來源的重組人血清白蛋白。
背景技術(shù)：
在上世紀(jì)50年代主要醫(yī)藥產(chǎn)品的生產(chǎn)是以細(xì)菌作為生物反應(yīng)器。但由于細(xì)菌屬于原核生物不具備真核生物的蛋白質(zhì)合成與加工系統(tǒng)。而一些蛋白質(zhì)的生物活性是依靠蛋白質(zhì)的修飾來達(dá)到的，所以，它的應(yīng)用受到了限制。酵母作為第二代生物反應(yīng)器，在上世紀(jì)70年代開始應(yīng)用于醫(yī)藥產(chǎn)品生產(chǎn)，由于產(chǎn)量低，其體修飾/加工系統(tǒng)不完善，也限制了它的廣泛應(yīng)用。第三代生物反應(yīng)器是利用高等植、動(dòng)物細(xì)胞作為生物反應(yīng)器。目前真核生物反應(yīng)器可分為動(dòng)物和植物生物反應(yīng)器兩大類，動(dòng)物生物反應(yīng)器有細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)基因動(dòng)物兩種，目前一些主要的醫(yī)用抗體使用動(dòng)物CHO細(xì)胞系(或小鼠)細(xì)胞培養(yǎng)來生產(chǎn)。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究方面主要是在轉(zhuǎn)基因乳牛的乳腺細(xì)胞表達(dá)重組蛋白質(zhì)以及在雞蛋蛋清中表達(dá)重組蛋白質(zhì)。然而，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物由于不能克服動(dòng)物病原菌的污染問題，加上動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的成本極高，大規(guī)模生產(chǎn)需要巨大的投資，有人估計(jì)，全世界目前只有1000公斤的生產(chǎn)單克隆抗體的能力；據(jù)計(jì)算，每擴(kuò)大1000公斤的生產(chǎn)能力，需要投資40億美元，并要花10年的時(shí)間來建成投產(chǎn)，這些數(shù)據(jù)說明目前的重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)能力大大地小于市場需求。在醫(yī)藥應(yīng)用方面沒有競爭優(yōu)勢，使得在醫(yī)藥上的應(yīng)用也受到限制。目前的應(yīng)用是沒有選擇的選擇。因而急需一個(gè)高效、安全的表達(dá)系統(tǒng)來滿足巨大的市場需求。
人血清白蛋白由585個(gè)氨基酸組成，它是一個(gè)非糖苷化、可溶性相當(dāng)好的單體分子，其分子量為65kD，是人血液中的主要蛋白成分，占總血清蛋白的60％，在人血液中濃度高達(dá)每毫升40毫克。它在肝內(nèi)合成后，對(duì)保持血液的正常滲透壓具有重要的作用；它還在血液中作為多種功能分子的載體，調(diào)節(jié)人體內(nèi)的多種生理功能。在體外，它作為多種藥物的穩(wěn)定劑被廣泛地用于各種疾病的治療、藥物載體、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、血漿替代物等。在國際市場上具有巨大的需求，每年的需求量高達(dá)500噸以上。然而，幾乎目前所有人血清白蛋白的來源是從人血漿中提取。由于血漿來源的限制，尤其是來自血液傳播的疾病如艾滋病、肝炎等的威脅，使得人們對(duì)應(yīng)用血漿中提取的血清白蛋白作為醫(yī)藥用途產(chǎn)生巨大的擔(dān)憂，從而對(duì)重組人血清蛋白的生產(chǎn)與應(yīng)用產(chǎn)生了極大的興趣。目前，國際上已有人試圖采用原核生物大腸桿菌，真核生物如酵母、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)基因奶牛來生產(chǎn)重組人血清白蛋白。但這些方法因表達(dá)水平較低或生產(chǎn)成本太高，不能用于生產(chǎn)。如德國GTC生物醫(yī)藥公司在轉(zhuǎn)基因牛的人血清白蛋白的表達(dá)水平在每升40克左右。美國的雞基因遺傳(AviGenic)有限公司利用轉(zhuǎn)基因雞蛋來表達(dá)重組人血清白蛋白，在雞蛋清里的表達(dá)水平很低，為每毫升1.65微克。英國的德爾塔(Delta)生物技術(shù)公司利用酵母來生產(chǎn)重組人血清白蛋白，其產(chǎn)量每升達(dá)到了150毫克，雖然已經(jīng)在市場上開始應(yīng)用，但用動(dòng)物細(xì)胞作為生物反應(yīng)器來生產(chǎn)人血清白蛋白，由于不能避免動(dòng)物病原菌的污染，在應(yīng)用上受到了限制。而用植物細(xì)胞或器官來表達(dá)重組人血清白蛋白具有較大的優(yōu)勢，目前在國際上只有兩個(gè)試驗(yàn)室開展這方面的研究，一個(gè)是西班牙的國家農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所利用馬鈴薯塊莖表達(dá)重組人血清白蛋白，其表達(dá)在每公斤馬鈴薯塊莖為10毫克的水平，它的表達(dá)水平還是達(dá)不到商業(yè)化水平，因而不能用于生產(chǎn)；另一家是美國的佛羅里達(dá)州立大學(xué)利用葉綠體表達(dá)技術(shù)在葉綠體表達(dá)重組人血清白蛋白，雖然其表達(dá)水平每公斤達(dá)到250毫克，該系統(tǒng)的一個(gè)致命弱點(diǎn)是重組人血清白蛋白在葉綠體內(nèi)表達(dá)形成類似于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的包涵體，重組人血清白蛋白呈不溶形式，從而使人血清白蛋白的生物活性喪失，而要解決其可溶性問題，將大大地提高其生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人針對(duì)現(xiàn)有原核和真核生物為宿主的生物反應(yīng)器的表達(dá)量低、可溶性差、無生物活性和不安全等缺點(diǎn)，利用人類的主要食物之一的水稻胚乳細(xì)胞的蛋白體作為重組蛋白的儲(chǔ)藏地點(diǎn)，采用水稻胚乳特異性表達(dá)的啟動(dòng)子和信號(hào)肽，介導(dǎo)重組人血清白蛋白進(jìn)入水稻胚乳細(xì)胞的內(nèi)膜系統(tǒng)，并儲(chǔ)存到水稻胚乳的蛋白體中，從而使重組人血清白蛋白能在水稻種子內(nèi)大量積累，最終達(dá)到較高水平，本發(fā)明不僅可以克服其他表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)量低、可溶性差、無生物活性等問題，還可以完全杜絕動(dòng)物病原菌的污染問題。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供了利用水稻儲(chǔ)藏醇溶谷蛋白基因Gt13a的啟動(dòng)子和信號(hào)肽介導(dǎo)重組人血清白蛋白在胚乳細(xì)胞特異性表達(dá)并儲(chǔ)存在水稻胚乳細(xì)胞的蛋白體內(nèi)的方法，使重組人血清白蛋白不受細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的蛋白酶攻擊，從而在水稻胚乳內(nèi)大量積累，最終獲得較高的產(chǎn)量的表達(dá)技術(shù)。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是將人血清白蛋白基因的遺傳密碼子轉(zhuǎn)換為水稻偏愛的遺傳密碼子，從而提高了重組蛋白質(zhì)的翻譯水平，最終提高人血清白蛋白在水稻胚乳細(xì)胞的表達(dá)與積累。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供了一個(gè)表達(dá)重組人血清白蛋白的新體系，該體系利用水稻或谷物胚乳細(xì)胞來生產(chǎn)重組人血清白蛋白。該體系不僅比轉(zhuǎn)基因奶牛和雞更安全、無病毒污染，而且容易規(guī)?；槐绕渌参锉磉_(dá)體系具有更高的產(chǎn)量和更低的生產(chǎn)成本。
本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供了一個(gè)完善的水稻基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用水稻的半胱氨酸蛋白酶B(Cysteine Proteinaseβ)基因的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子特異介導(dǎo)選擇性標(biāo)記基因在水稻愈傷組織表達(dá)，從而使選擇效果大大地提高。同時(shí)避免使用非水稻的啟動(dòng)子而產(chǎn)生的其他不利環(huán)境的效應(yīng)。
下面對(duì)本發(fā)明的方法進(jìn)行詳細(xì)描述水稻特異性啟動(dòng)子及信號(hào)肽的獲得為了獲得較強(qiáng)的水稻胚乳特異性表達(dá)的啟動(dòng)子和信號(hào)肽，根據(jù)蛋白組學(xué)的研究，發(fā)現(xiàn)水稻儲(chǔ)藏蛋白的醇溶谷蛋白基因家簇中的一個(gè)成員Gt13a基因在水稻胚乳細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)量為最高，推導(dǎo)這個(gè)基因成員具有較強(qiáng)的啟動(dòng)子活性。為了獲得Gt13a啟動(dòng)子和它的信號(hào)肽序列，根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫的Gt13a(基因庫登記號(hào)AP003256)合成了一對(duì)核苷酸引物用于PCR擴(kuò)增(序列1、2)。為了便于基因克隆，在正向引物的5’端加入了一個(gè)HindIII的酶切位點(diǎn)，在反向引物的5’端加了一個(gè)NaeI的酶切位點(diǎn)。從任何水稻品種葉片中提取基因組DNA，以此DNA為模版，按照標(biāo)準(zhǔn)的PCR程序，利用上述引物擴(kuò)增出了一個(gè)1284堿基的DNA片段。經(jīng)DNA序列分析，此DNA片段具有明顯的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)。與Gt1啟動(dòng)子比較具有明顯的差異，在AT含量明顯高于現(xiàn)有的Gt1啟動(dòng)子和較長的核苷酸序列。
水稻胚乳細(xì)胞特異性表達(dá)載體的構(gòu)建經(jīng)PCR獲得Gt13a啟動(dòng)子和信號(hào)肽的序列后，PCR產(chǎn)物經(jīng)HindIII和NaeI消化后，將這個(gè)片段與經(jīng)HindIII和NaeI消化的pBI221片段(美國克隆技術(shù)Clontech有限公司)連接，然后導(dǎo)入大腸桿菌品系DH10B，形成了含有Gt13a啟動(dòng)子、Gt13a信號(hào)肽和Nos終止子的水稻胚乳特異性表達(dá)的基本載體，并將這個(gè)載體質(zhì)粒命名為pOsPMP1(見序列3)。
水稻遺傳密碼子優(yōu)化的人血清白蛋白基因的基因合成與表達(dá)載體的構(gòu)建為了使重組人血清白蛋白在水稻胚乳獲得較高的表達(dá)，必須使用水稻優(yōu)化的遺傳密碼子，因而，從美國生物技術(shù)信息中心(NCBI)基因庫里獲得了成熟的人血清白蛋白基因(基因庫登記號(hào)CAA01491)的氨基酸序列，由DNA分析軟件馬克載體MacVector(英國的阿克爾勒斯Accelrys公司產(chǎn)品)將人血清白蛋白基因的氨基酸序列轉(zhuǎn)換成含有優(yōu)化水稻遺傳密碼子的核苷酸序列，然后采用PCR延伸法，人工合成了人血清白蛋白基因(見序列4)。經(jīng)密碼子優(yōu)化后的人血清白蛋白基因的核苷酸序列比原來的人血清白蛋白基因改變了25.5％，遺傳密碼改變了71.1％，但其氨基酸的序列不變(見表1)。
表1、密碼子優(yōu)化后的人血清白蛋白基因的比較

在人工合成人血清白蛋白基因時(shí)，在基因合成的引物兩端分別加上限制性內(nèi)切酶MylI和XhoI位點(diǎn)，然后克隆到pUC19載體(美國的克隆技術(shù)Clontech有限公司)，產(chǎn)生了帶有重組人血清白蛋白基因的載體pOsHSA；pOsHSA經(jīng)限制性內(nèi)切酶MylI和XhoI消化，在5’端產(chǎn)生了一個(gè)平齊末端和在3’末端產(chǎn)生了一個(gè)粘性末端，同時(shí)用NaeI和XhoI消化載體質(zhì)粒pOsPMP1，也在5’端產(chǎn)生了一個(gè)平齊末端和在3’末端產(chǎn)生了一個(gè)粘性末端，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，回收人血清白蛋白基因片段，將此重組人血清白蛋白基因的片斷連接到經(jīng)NaeI和XhoI消化的載體質(zhì)粒pOsPMP1，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌品系DH10B，產(chǎn)生水稻胚乳特異性表達(dá)重組人血清白蛋白基因的載體質(zhì)粒pOsPMP2(圖2和序列5)。
選擇性標(biāo)記基因載體的構(gòu)建為了使選擇性際記基因在水稻愈傷組織內(nèi)高效表達(dá)而提高選擇效果，采用水稻半胱氨酸蛋白酶基因(cysteineproteinaseβ，CP)的啟動(dòng)子介導(dǎo)選擇性標(biāo)記基因(抗草霉素基因-草霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)在愈傷組織中表達(dá)。首先，合成了一對(duì)PCR引物(見序列6、7)，在PCR引物的兩端加了HindIII和SmaI位點(diǎn)；以水稻基因組DNA為模版，采用標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出一個(gè)長度為1103堿基含有啟動(dòng)子的片斷，PCR產(chǎn)物經(jīng)HindIII和SmaI消化后，該P(yáng)CR片段與克隆載體pBI221(美國的克隆技術(shù)Clontech有限公司)連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌品系DH10B，產(chǎn)生了中間質(zhì)粒pOsPMP4。CP啟動(dòng)子序列經(jīng)序列分析，具有明顯的啟動(dòng)子特征和元件(序列10)。選擇性標(biāo)記基因采用草霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(Hygromycin β Phosphotransferas，Hpt)，該基因從質(zhì)粒pCAMBIA1301(澳大利亞的哥侖比亞CAMBIA公司)擴(kuò)增，在正向引物(見序列8、9)的5’末端加上了一個(gè)平末端限制性內(nèi)切酶為位點(diǎn)SmaI，在反向引物的5’末端加上了一個(gè)粘性末端的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)XhoI，以pCAMBIA1301質(zhì)粒為模版，采用標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出草霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因片斷，PCR產(chǎn)物用SmaI和XhoI消化，pOsPMP4DNA用NaeI和XhoI消化，然后將草霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因片斷與具有CP啟動(dòng)子的pOsPMP4質(zhì)粒經(jīng)NaeI和XhoI消化的DNA片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌系DH10B，最終產(chǎn)生了水稻組織特異性表達(dá)的選擇性標(biāo)記表達(dá)載體，命名為pOsPMP5。
水稻基因遺傳轉(zhuǎn)化水稻種子去殼后，在20％次氯酸鈉中消毒20分鐘，用滅菌水漂洗3次，然后在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)20-25天，誘導(dǎo)的愈傷組織轉(zhuǎn)移到預(yù)處理培養(yǎng)基上生長9-10天后，用于遺傳轉(zhuǎn)化。將0.5微克的人血清白蛋白表達(dá)載體質(zhì)粒pOsPMP2和具有選擇性標(biāo)記質(zhì)粒pOsPMP5的DNA，與50微升的金粉、250微升的1M氯化鈣和50微升的0.1M亞精胺混合后，反應(yīng)30分鐘，用酒精洗三次，將DNA包裹在金粉上，然后按照美國杜邦公司的基因槍方法，將兩個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到由中華11號(hào)產(chǎn)生的愈傷組織。在含有草霉素B的選擇培養(yǎng)基上經(jīng)45天的篩選，具有草霉素B抗性的愈傷組織在再生培養(yǎng)基上在光照下，經(jīng)20天左右的誘導(dǎo)，愈傷組織分化成綠色的植株，然后將幼小植株轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上，經(jīng)15-20天的誘導(dǎo)，形成完整的植株，獲得轉(zhuǎn)基因植株，這些轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)PCR檢測，證明其含有人血清白蛋白基因后，轉(zhuǎn)到試驗(yàn)田生長發(fā)育成成熟的種子，此為T1種子。
高表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的篩選轉(zhuǎn)基因水稻經(jīng)過4個(gè)月左右的生長和發(fā)育，抽穗開花后，經(jīng)一個(gè)月的時(shí)間，形成成熟的轉(zhuǎn)基因水稻種子。其中有50-60％的轉(zhuǎn)基因植株正常結(jié)實(shí)。當(dāng)T1種子收獲后，利用蛋白質(zhì)檢測技術(shù)---酶聯(lián)免疫(ELISA)藥盒(美國的北索實(shí)驗(yàn)室Bethyl Laboratory)檢測技術(shù)，首先，每株轉(zhuǎn)基因取10粒種子，加10毫升的提取緩沖液(50mMTris，pH8.0，50mM NaCl，10mM EDTA)勻漿，在離心機(jī)上每分鐘14000轉(zhuǎn)，離心10分鐘，上清液用人血清白蛋白ELISA定量藥盒進(jìn)行酶聯(lián)免疫檢測。經(jīng)檢測每粒種子的重組人血清白蛋白的表達(dá)水平在9.82-282.22微克之間。其中最高的一個(gè)轉(zhuǎn)基因單株pPMP2-68的重組人血清白蛋白的表達(dá)量平均高達(dá)174.18微克。折合成每克水稻種子含有8.29mg重組人血清白蛋白，即占0.83％的種子干重。從T1種子中篩選表達(dá)人血清白蛋白高的轉(zhuǎn)基因個(gè)體，經(jīng)T1代的繼續(xù)選擇，形成穩(wěn)定表達(dá)重組人血清白蛋白的轉(zhuǎn)基因品系。供大面積生產(chǎn)植物來源的重組人血清白蛋白之用。
本發(fā)明是利用水稻胚乳作為生物反應(yīng)器來生產(chǎn)可溶的、具有生物活性的重組人血清白蛋白，使其表達(dá)水平至少達(dá)到水稻種子重量的0.3％以上，即每公斤種子的人血清白蛋白產(chǎn)量達(dá)到3克以上，是葉綠體表達(dá)體系的最高量的12倍和馬鈴薯塊莖表達(dá)體系的最高量的300倍。
本發(fā)明描述的利用谷物作物-水稻胚乳細(xì)胞作為生物反應(yīng)器，用水稻種子來生產(chǎn)重組人血清白蛋白的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下幾個(gè)方面的優(yōu)特點(diǎn)1)、它具有高效地表達(dá)系統(tǒng)，植物細(xì)胞具有與人類和動(dòng)物相同的蛋白質(zhì)合成體系，具有高效的表達(dá)外源蛋白質(zhì)的潛力。2)、它具有類似動(dòng)物人類的蛋白質(zhì)加工修飾系統(tǒng)；3)、它的產(chǎn)品安全可靠。由于植物種子如水稻、小麥和大麥等都是人類的主要食物、由它生產(chǎn)出的蛋白質(zhì)產(chǎn)品絕對(duì)沒有任何病源菌的污染、因此安全可靠；4)、生產(chǎn)成本極低，其生產(chǎn)成本分別是細(xì)菌和動(dòng)物系統(tǒng)的1/20和1/200；5)、容易儲(chǔ)存和加工。由于重組蛋白質(zhì)儲(chǔ)存在種子里，不需要像其他植物系統(tǒng)需要及時(shí)加工，也不需要特殊的儲(chǔ)存設(shè)備和低溫要求；6)、大批量生產(chǎn)極為容易。這項(xiàng)技術(shù)在形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因品種后，一旦需要，擴(kuò)大種植面積即可，不需要增加任何工場設(shè)施。相反，細(xì)菌或者酵母需要添置大量的場房和發(fā)酵設(shè)備；而動(dòng)物系統(tǒng)的動(dòng)物繁殖加代與育種極為困難。
將表達(dá)載體質(zhì)粒的代號(hào)及其功能與用途對(duì)照如下pOsPMP1----水稻胚乳特異性表達(dá)的基本載體pOsHSA-----帶有重組人血清白蛋白基因的載體pOsPMP2------水稻胚乳特異性表達(dá)重組人血清白蛋白基因的載體質(zhì)粒pOsPMP4-----中間質(zhì)粒
pOsPMP5-----水稻組織特異性表達(dá)的選擇性標(biāo)記表達(dá)載體


圖1、Gt13a啟動(dòng)子與信號(hào)肽的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。箭頭指示是PCR擴(kuò)增的1284個(gè)堿基的核苷酸片斷。泳道1為分子標(biāo)記，泳道2為PCR產(chǎn)物，箭頭所指是1284堿基的Gt13a的啟動(dòng)子序列。
圖2、構(gòu)建的水稻胚乳特異性表達(dá)的人血清白蛋白表達(dá)載體的限制性內(nèi)切酶圖譜。
圖3、水稻愈傷組織特異性表達(dá)的選擇性標(biāo)記基因的限制性內(nèi)切酶圖譜。
圖4、顯示水稻胚乳中表達(dá)的重組人血清白蛋白的聚丙烯酰胺凝膠和蛋白質(zhì)印跡法圖譜。從轉(zhuǎn)基因水稻胚乳中提取的重組人血清白蛋白，10粒轉(zhuǎn)基因水稻種子用10毫升蛋白質(zhì)提取緩沖液提取的重組人血清白蛋白。15微升點(diǎn)樣在10％聚丙烯酰胺凝膠。然后經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色和蛋白質(zhì)印跡法檢測。圖A為考馬斯亮藍(lán)染色的聚丙烯酰胺凝膠圖譜；圖B為蛋白質(zhì)印跡法圖譜。箭頭所指是人血清白蛋白在轉(zhuǎn)基因胚乳中顯而易見，但在對(duì)照樣品臺(tái)北309中缺少對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)帶。
具體實(shí)施例方式
下面對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本實(shí)施方式不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
克隆Gt13a啟動(dòng)子和信號(hào)肽為了從水稻基因組序列里克隆醇溶谷蛋白的Gt13a基因的啟動(dòng)子與信號(hào)肽，利用序列1的引物，采用標(biāo)準(zhǔn)的多聚酶鏈(PCR)反應(yīng)，從臺(tái)北309品種的基因組DNA中擴(kuò)增到了1284堿基的DNA片段(圖1)，擴(kuò)增的片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶NaeI和XhoI消化，克隆到載體質(zhì)粒pBI221中，產(chǎn)生了水稻胚乳細(xì)胞特異性表達(dá)的表達(dá)載體pOsPMP1，經(jīng)DNA序列分析，這個(gè)DNA片段具有明顯的啟動(dòng)子特征和信號(hào)肽的序列(序列3)。
合成含有水稻遺傳密碼子的人血清白蛋白基因。
人血清白蛋白基因序列(基因庫登記號(hào)為CAA01491)的氨基酸序列，使用DNA分析軟件馬克載體MacVector將人血清白蛋白基因轉(zhuǎn)換成水稻遺傳密碼子的核苷酸序列，其修改后的人血清白蛋白基因的脫氧核苷酸序列改變了25.5％，遺傳密碼改變了71.1％，但其氨基酸序列完全相同。然后，根據(jù)密碼子優(yōu)化的脫氧核苷酸序列，采用PCR延伸法，人工合成了重組人血清白蛋白基因。在基因合成過程中，在基因兩端加上了MylI和XhoI酶切位點(diǎn)，克隆到pUC19質(zhì)粒載體，產(chǎn)生了含有水稻密碼子優(yōu)化的人血清白蛋白基因(pOsHSA)。
構(gòu)建水稻特異性表達(dá)人血清白蛋白的載體。
pOsHSA質(zhì)粒DNA用限制性內(nèi)切酶MylI和XhoI消化，同時(shí)用NaeI和XhoI消化pOsPMP1質(zhì)粒DNA，將人血清白蛋白基因與載體質(zhì)粒pOsPMP1連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌品系DH10B，產(chǎn)生表達(dá)載體質(zhì)粒為pOsPMP2。其質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶圖譜見圖2。
克隆水稻半胱氨酸蛋白酶B(cysteine proteinase B)啟動(dòng)子。
采用PCR的方法從水稻基因組DNA克隆水稻半胱氨酸蛋白酶β基因的啟動(dòng)子，根據(jù)基因庫的核苷酸序列設(shè)計(jì)了兩個(gè)PCR引物，引物核苷酸序列見序列6、7，利用標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)，從水稻人工細(xì)菌染色體文庫中，篩選到一個(gè)陽性克隆42M2。BAC克隆經(jīng)XhoI消化后，一個(gè)5kb的片斷Southern雜交證實(shí)含有半胱氨酸蛋白酶B基因的全DNA序列，以這個(gè)BAC克隆DNA為模板，用引物(見序列6、7)采用標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)，獲得了一個(gè)1113堿基的DNA片段，將這個(gè)片段克隆到pBI221載體中，產(chǎn)生了一個(gè)中間載體(pOsPMP4)。
構(gòu)建選擇性際記基因載體。
pOsPMP4的DNA用NaeI和XhoI消化，應(yīng)用引物(見序列8、9)，以pCAMBIA1301DNA為模版，用標(biāo)準(zhǔn)PCR方法，擴(kuò)增出的PCR片段經(jīng)SmaI和XhoI消化，然后克隆到經(jīng)NaeI和XhoI消化的pOsPMP4載體上，產(chǎn)生了水稻特異性表達(dá)的選擇性標(biāo)記載體pOsPMP5(圖3)。
以基因槍介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化水稻品種中花11號(hào)的種子，脫去谷殼后，經(jīng)20％的次氯酸鈉消毒20分鐘，經(jīng)無菌水漂洗3次，每次10分鐘，然后放在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上經(jīng)20-30天的誘導(dǎo)，產(chǎn)生愈傷組織。將0.5微克的質(zhì)粒pOsPMP2和0.5微克具有選擇性標(biāo)記質(zhì)粒pOsPMP5的DNA，與50微升的金粉、250微升的1M氯化鈣和50微升的0.1M亞精胺混合后，在室溫下反應(yīng)30分鐘，用酒精洗三次，然后按照杜邦公司的基因槍方法，將包裹有兩個(gè)質(zhì)粒DNA金粉，共轉(zhuǎn)化到從中華11號(hào)產(chǎn)生的愈傷組織的細(xì)胞中；在含有50微克/毫升的草霉素B的選擇培養(yǎng)基上經(jīng)45天的篩選，繼續(xù)生長的愈傷組織為抗草霉素B的陽性愈傷組織，草霉素B抗性的愈傷組織轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基上，在光照下經(jīng)20天左右的誘導(dǎo)，愈傷組織分化成綠色的小植株，然后將幼小植株轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上，經(jīng)15-20天的誘導(dǎo)，形成完整的植株，最后轉(zhuǎn)到溫室或試驗(yàn)田生長發(fā)育成成熟的種子。
篩選表達(dá)人血清白蛋白高的轉(zhuǎn)基因植株。
轉(zhuǎn)基因植株在溫室或大田經(jīng)生長與發(fā)育，然后開花結(jié)種子，形成轉(zhuǎn)基因一代種子，當(dāng)T1種子收獲后，每株轉(zhuǎn)基因植株取10粒種子，在提取緩沖溶液里(50mM Tris，pH 8.0，50mM NaCl，1mM EDTA)抽提蛋白質(zhì)，經(jīng)酶聯(lián)免疫檢測(ELISA)技術(shù)檢測人血清白蛋白的表達(dá)量。其在轉(zhuǎn)基因水稻品系的重組人血清白蛋白的表達(dá)水平總結(jié)(見表3)。
表3、不同轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá)重組人血清白蛋白的結(jié)果


從T1種子中篩選表達(dá)重組人血清白蛋白最高的轉(zhuǎn)基因個(gè)體。為了檢驗(yàn)高效表達(dá)人血清白蛋白的轉(zhuǎn)基因株系，不同轉(zhuǎn)基因品系的T1代種子的粗提取液經(jīng)SDS-PAGE聚丙烯凝膠電泳，考馬斯亮藍(lán)染色和蛋白質(zhì)印跡法檢測，人血清白蛋白在聚丙烯凝膠中清晰可見，與陽性對(duì)照具有相同的分子量(圖4)，在蛋白質(zhì)印跡法中顯示與考馬斯亮藍(lán)染色相同的帶型，說明在轉(zhuǎn)基因胚乳中的特異蛋白質(zhì)帶是人血清白蛋白。
有關(guān)核苷酸的序列<110>楊代常<120>利用水稻胚乳細(xì)胞作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組人血清白蛋白<140>2005100190844<141>2005-07-13<160>10<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>34<212>DNA<213>人工合成<400>1cccaagcttc aacctgctga gaagaacaac tgac 34<210>2<211>31<212>DNA<213>人工合成<400>2cggtgccggc tagagagcca ttgcacaaga g 31<210>3<211>1284<212>DNA<213>水稻<400>3tcacacctta tgtaaagtat ttgttgcaag aaaagtctaa gatgacagca acctgctgag 60aagaacaact gacgatgtca taaggagagg gagcttttcg ataggtgccg tgcagttcaa120agagttagtt agcagtagga tgaagatttt tgcacatggc aatgagaagt taattatggt180gtaggcaacc caaatgaaac accaaaatat gcacaagaca gtttgttgta ttctgtagta240cagaataaac taaagtaatg aaagaagatg gtgttagaaa atgaaacaat attatgagta300atgtgtgagc attatgggac cacgaaataa aaaaagaaca tttttatgag cagtgtgttc360tcaatgagcc ttgaatgtta tcacccagga taagaaaccc ttaagcaatg aaacatgcaa420gcgtttaatg tgcaaagttg gcattctcca cgacataatg caaaagaaga tataatctat480gacatagcaa gtcatgcatc atttcatgcc tctgtcaacc tattcatttc tagtcatcta540ggtaagtatc ttaagctaaa gtgttagaac ttcccataca taagtcataa ctgatgacaa600ttgggtgtaa cacatgacaa accagagagt caagcaagat aaagcaaaag gatgtgtaca660
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1.用于介導(dǎo)重組人血清白蛋白在轉(zhuǎn)基因水稻胚乳細(xì)胞中表達(dá)的水稻儲(chǔ)藏蛋白的Gt13a啟動(dòng)子和信號(hào)肽的核苷酸如序列3所示。
2.使用水稻優(yōu)化的遺傳密碼子合成的帶有重組人血清白蛋白基因載體pOsHSA的核苷酸如序列4所示。
3.包括權(quán)利要求1所述Gt13a啟動(dòng)子和信號(hào)肽的命名為pOsPMP1的，水稻胚乳特異性表達(dá)載體Gt13a-sp-HSA-Nos的核苷酸如序列5所示。
4.用于轉(zhuǎn)基因愈傷組織篩選的CP啟動(dòng)子核苷酸如序列10所示。
5.一種利用水稻胚乳細(xì)胞作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組人血清白蛋白的方法，其步驟如下(1)水稻特異性啟動(dòng)子及信號(hào)肽的獲得用PCR反應(yīng)獲得含有水稻胚乳特異性表達(dá)的Gt13a啟動(dòng)子和信號(hào)肽的1284堿基的DNA片段；(2)水稻胚乳細(xì)胞特異性表達(dá)載體的構(gòu)建將1284堿基的DNA片段克隆到pBI221載體，形成中間質(zhì)粒，然后導(dǎo)入大腸桿菌品系DH10B，構(gòu)建了水稻胚乳細(xì)胞特異性表達(dá)的基本載體新體系，命名為pOsPMP1；(3)水稻遺傳密碼子優(yōu)化的人血清白蛋白基因合成與表達(dá)載體的構(gòu)建從基因庫里獲得人血清白蛋白基因的氨基酸序列，由DNA分析軟件將人血清白蛋白基因的氨基酸序列轉(zhuǎn)換成含有優(yōu)化的水稻遺傳密碼子核苷酸序列，然后采用PCR延伸法，人工合成帶有重組人血清白蛋白基因，克隆到pUC19載體，形成pOsHSA；然后將重組人血清白蛋白基因連接到水稻胚乳表達(dá)載體pOsPMP1，產(chǎn)生水稻胚乳特異性表達(dá)重組人血清白蛋白基因的載體質(zhì)粒pOsPMP2；(4)水稻組織特異性表達(dá)的選擇性標(biāo)記基因載體的構(gòu)建用CP啟動(dòng)子構(gòu)建水稻組織特異性表達(dá)的選擇性標(biāo)記表達(dá)載體，命名為pOsPMP5；首先用PCR擴(kuò)增出一個(gè)長度為1103堿基的CP啟動(dòng)子的片斷，上述PCR片段與克隆載體pBI221連接，產(chǎn)生了中間質(zhì)粒pOsPMP4；采用標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出選擇性標(biāo)記基因草霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因片斷，然后將草霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因片斷與具有CP啟動(dòng)子的中間質(zhì)粒連接，最終產(chǎn)生了水稻組織特異性表達(dá)的選擇性標(biāo)記表達(dá)載體，命名為pOsPMP5。(5)進(jìn)行水稻基因遺傳轉(zhuǎn)化將一定數(shù)量的表達(dá)人血清白蛋白基因的載體質(zhì)粒pOsPMP2和具有選擇性標(biāo)記的表達(dá)質(zhì)粒pOsPMP5的DNA，以基因槍的方法共轉(zhuǎn)化到由水稻品種產(chǎn)生的愈傷組織。通過選擇—培養(yǎng)—篩選—誘導(dǎo)，形成完整的植株。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，水稻特異性啟動(dòng)子及信號(hào)肽的獲得的優(yōu)選方法是采用如序列1、2所示的引物，采用標(biāo)準(zhǔn)的多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)反應(yīng)，從臺(tái)北309品種的基因組DNA中擴(kuò)增到含有水稻胚乳特異性表達(dá)的Gt13a啟動(dòng)子和信號(hào)肽的1284堿基的DNA片段。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，水稻胚乳細(xì)胞特異性表達(dá)載體的構(gòu)建優(yōu)選方法是獲得含有Gt13a啟動(dòng)子和信號(hào)肽的序列后，將這個(gè)片段與經(jīng)HindIII和NaeI消化的pBI221片段連接，然后導(dǎo)入大腸桿菌品系DH10B，形成含有Gt13a啟動(dòng)子、Gt13a信號(hào)肽和Nos終止子的水稻胚乳特異性表達(dá)的基本載體pOsPMP1。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，獲得水稻胚乳特異性表達(dá)重組人血清白蛋白基因的載體質(zhì)粒pOsPMP2的優(yōu)選方法是將帶有重組人血清白蛋白基因的載體pOsHSA經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化，在5‘端產(chǎn)生一個(gè)平齊末端和在3’末端產(chǎn)生一個(gè)粘性末端，同時(shí)用NaeI和XhoI消化載體質(zhì)粒pOsPMP1，也在5‘端產(chǎn)生一個(gè)平齊末端和在3’末端產(chǎn)生一個(gè)粘性末端，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，回收上述帶有重組人血清白蛋白基因的片段，將此重組人血清白蛋白基因的片斷連接到經(jīng)NaeI和XhoI消化的載體質(zhì)粒pOsPMP1，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌品系DH10B，產(chǎn)生水稻胚乳特異性表達(dá)重組人血清白蛋白基因的載體質(zhì)粒pOsPMP2。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，用CP啟動(dòng)子構(gòu)建命名為pOsPMP5的水稻組織特異性表達(dá)的選擇性標(biāo)記表達(dá)載體的優(yōu)選方法是合成的一對(duì)PCR引物如序列6、7所示，在PCR引物的兩端加了HindIII和SmaI位點(diǎn)；以水稻品種臺(tái)北309的基因組DNA為模版，采用標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出一個(gè)長度為1103堿基含有啟動(dòng)子的片斷；PCR產(chǎn)物經(jīng)HindIII和SmaI消化后，該P(yáng)CR片段與克隆載體pBI221連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌品系DH10B，產(chǎn)生了中間質(zhì)粒pOsPMP4。將草霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因片斷與具有CP啟動(dòng)子的pOsPMP4質(zhì)粒經(jīng)NaeI和XhoI消化的DNA片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌系DH10B，最終產(chǎn)生了水稻組織特異性表達(dá)的選擇性標(biāo)記的表達(dá)載體，命名為pOsPMP5。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法產(chǎn)生的水稻胚乳中的植物來源的人血清白蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開了利用水稻胚乳細(xì)胞作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組人血清白蛋白的方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。它涉及到利用谷物種子水稻胚乳細(xì)胞作為生物反應(yīng)器來生產(chǎn)醫(yī)用的重組人血清白蛋白。利用人類的主要食物之一的水稻胚乳細(xì)胞的蛋白體作為重組蛋白的儲(chǔ)藏地點(diǎn)，采用水稻胚乳特異性表達(dá)的啟動(dòng)子和信號(hào)肽，介導(dǎo)重組人血清白蛋白進(jìn)入水稻胚乳細(xì)胞的內(nèi)膜系統(tǒng)，并儲(chǔ)存到水稻胚乳的蛋白體中，從而使重組人血清白蛋白能在水稻種子內(nèi)大量積累，最終達(dá)到較高水平。其表達(dá)水平至少達(dá)到水稻種子重量的0.3％以上。比其他植物表達(dá)體系具有更高的產(chǎn)量和更低的生產(chǎn)成本。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1896239SQ20051001908
公開日2007年1月17日 申請(qǐng)日期2005年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月13日
發(fā)明者楊代常 申請(qǐng)人:楊代常