專(zhuān)利名稱：結(jié)核桿菌基因的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬結(jié)核桿菌基因的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
我國(guó)是結(jié)核桿菌感染較嚴(yán)重的國(guó)家之一。在我國(guó)衛(wèi)生部最近公布的數(shù)據(jù)中，全國(guó)曾患結(jié)核病人數(shù)超過(guò)一億，現(xiàn)有結(jié)核病人總數(shù)接近500萬(wàn)，其中傳染病人約占一半。而每個(gè)傳染病人每年可以傳染15-20人。若病情一旦發(fā)展成為抗藥性結(jié)核病，就很難治愈，病死率極高，故結(jié)核病是嚴(yán)重危害人民健康的傳染型疾病之一。我國(guó)十分重視對(duì)結(jié)核病的防治，要求全國(guó)盡可能高效率的查出結(jié)核病患者，以便及時(shí)治療，減少傳播。
目前在臨床上，對(duì)結(jié)核病的檢測(cè)方法主要有以下幾種1.傳統(tǒng)痰涂片染色法。該法利用結(jié)核菌抗酸原理進(jìn)行染色，涂片染上色的為陽(yáng)性，否則為陰性。該法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單易行、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠；但檢出率較低，涂陽(yáng)檢出率往往在30％左右。隨著結(jié)核病大范圍防治的鋪開(kāi)，今后涂陰結(jié)核病的病人比例越來(lái)越高，此傳統(tǒng)方法也就越發(fā)不能滿足市場(chǎng)所需了。
2.結(jié)核桿菌培養(yǎng)法。此法顯著優(yōu)點(diǎn)是特異性和準(zhǔn)確性高，但培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)(約4～6周)，檢出率也只是30％左右。
3.PCR熒光檢測(cè)法。該法利用PCR(聚合酶鏈反應(yīng))方法，擴(kuò)增出大量帶有螢光素的結(jié)核桿菌基因片段產(chǎn)物，通過(guò)螢光定量PCR儀檢測(cè)。此法最大優(yōu)點(diǎn)是高效、準(zhǔn)確，但設(shè)備昂貴，推廣使用難度大。
目前衛(wèi)生部要求各地結(jié)核病患者痰樣結(jié)核桿菌的檢出率要達(dá)到60％，但基層現(xiàn)普遍采用的方法的檢出率最多只能達(dá)到30％左右；各醫(yī)院被懷疑為結(jié)核的組織標(biāo)本檢出率也低于30％，距離國(guó)家要求還很遠(yuǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種靈敏、特異、高效、檢出率高和實(shí)用的結(jié)核桿菌的檢測(cè)方法。
本發(fā)明以如下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問(wèn)題使用一對(duì)特異引物P1和P2對(duì)結(jié)核桿菌特有的插入序列IS6110中的一段245bp區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中P1的5’端帶有生物素。將PCR產(chǎn)物與膜芯片上的探針進(jìn)行特異性雜交，再進(jìn)行酶聯(lián)反應(yīng)，最后通過(guò)顯色反應(yīng)判斷結(jié)果。
特異引物P1的序列為5’-Biotin-cgt gag ggc atc gag gtg gc-3’；特異引物P2的序列為5’-gcg tag gcg tcg gtg aca aa-3’；膜芯片上有結(jié)核桿菌特異性檢測(cè)探針T1、T2和T3以及質(zhì)控探針P和N。
其中質(zhì)控探針P的序列為5’-Biotin-cgt gag ggc atc gag gtg gc-3’檢測(cè)探針T1的序列為5’-ttt ttt ttg gct gtg gcc gga tca gcg atc gt-3’
檢測(cè)探針T2的序列為5’-ttt ttt ttt gga cga gat cgg cgg gac ggg ct-3’檢測(cè)探針T3的序列為5’-ttt ttt tta ggt gct ggt ggt ccg aag cg-3’使用本發(fā)明的結(jié)核桿菌基因的檢測(cè)方法，有以下突出優(yōu)點(diǎn)(1)由于采用PCR技術(shù)，數(shù)量極少的結(jié)核桿菌基因被成幾何倍擴(kuò)增了出來(lái)，故檢出率高。就目前所做的數(shù)百例試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，本方法對(duì)比傳統(tǒng)涂片法檢出率高出一倍以上。
(2)由于擴(kuò)增的特異性以及膜芯片探針雜交的特異性，決定了本方法具有準(zhǔn)確性高、特異性好的優(yōu)點(diǎn)，克服了單純PCR帶來(lái)的假陽(yáng)性的問(wèn)題。
(3)由于所需樣品極少、使用設(shè)備普通、診斷結(jié)果直觀、探針雜交顯色靈敏，使其具有高效、便利、靈敏的優(yōu)點(diǎn)。


圖1是膜芯片的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式
以下簡(jiǎn)要說(shuō)明本結(jié)核桿菌基因檢測(cè)方法的主要原理、所用設(shè)備、試劑、具體步驟1.原理首先使用經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)的一對(duì)特異引物P1和P2對(duì)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的目的基因?yàn)榻Y(jié)核桿菌特有的插入序列IS6110中的一段245bp的區(qū)域，IS6110插入序列是結(jié)核分支桿菌基因組中的一個(gè)多拷貝的保守片段，序列全長(zhǎng)約1300bp，主要在人型結(jié)核分支桿菌中發(fā)現(xiàn)有IS6110。引物P1的5’端標(biāo)記生物素，經(jīng)過(guò)PCR反應(yīng)后擴(kuò)增出大量含P1引物和延伸部分的DNA產(chǎn)物，這些產(chǎn)物均帶有生物素。然后T1探針、T2探針、T3探針?lè)謩e與產(chǎn)物中延伸部分的相應(yīng)序列發(fā)生特異性雜交。雜交后帶有生物素的目的基因與探針牢牢的聯(lián)在一塊，生物素就結(jié)合在了芯片上；洗去未結(jié)合的擴(kuò)增基因片段；再與帶有鏈霉親和素的辣根過(guò)氧化物酶進(jìn)行酶聯(lián)反應(yīng)，辣根過(guò)氧化物酶也被結(jié)合在芯片上。最后再與過(guò)氧化氫和顯色劑四甲基聯(lián)苯胺(TMB)進(jìn)行顯色反應(yīng)，通過(guò)顯色反應(yīng)即可判斷結(jié)果。三個(gè)檢測(cè)探針中只要有一個(gè)出現(xiàn)顯色反應(yīng)即可判為陽(yáng)性。
2.膜芯片的結(jié)構(gòu)和制作制作膜芯片是在基質(zhì)尼龍膜上設(shè)置三個(gè)如圖1所示的檢測(cè)探針T1、T2和T3，以及兩個(gè)質(zhì)控探針P和N；其中P為質(zhì)控點(diǎn)，P顯色，說(shuō)明酶聯(lián)反應(yīng)成功；N為陰性對(duì)照點(diǎn)，N處不能顯色，否則說(shuō)明檢測(cè)過(guò)程有污染或反應(yīng)非特異。
選用的探針為質(zhì)控探針P的長(zhǎng)度為20bp，序列為5’-Biotin-cgt gag ggc atc gag gtg gc-3’檢測(cè)探針T1的長(zhǎng)度為32bp，序列為5’-ttt ttt ttg gct gtg gcc gga tca gcg atc gt-3’，檢測(cè)探針T2的長(zhǎng)度為29bp，序列為5’-ttt ttt ttt gga cga gat cgg cgg gac ggg ct-3’，檢測(cè)探針T3的長(zhǎng)度為32bp，序列為5’-ttt ttt tta ggt gct ggt ggt ccg aag cg-3’，質(zhì)控探針N可以采用不同的序列，本發(fā)明推薦了一種探針的長(zhǎng)度為32bp，序列為5’-ttt ttt ttc cga cgc ctg cct att cgc tag ca-3’。
膜芯片的制作
膜芯片可選用寬×長(zhǎng)為7cm×15cm。
制作步驟為a.點(diǎn)膜在帶正電荷的尼龍膜上點(diǎn)上探針。其中P濃度為2.5μmol/l，(1.5～5μmol/l均可)0.3μl，T1、T2、T3、N均為25μmol/l，0.3μl。晾干。
b.烤膜60℃，30min。
3.檢測(cè)所需設(shè)備PCR儀、搖床、雜交爐(有最好，沒(méi)有時(shí)也可用水浴箱)、水浴箱。
4.所需試劑(1).20×SSC液(氯化鈉/檸檬酸鈉緩沖液)NaCl 175.3g，檸檬酸鈉88.2g。溶于800ml水中，調(diào)節(jié)pH至7.0，加水定容至1L，高溫高壓滅菌。
(2).10％SDS(十二烷基硫酸鈉)在900ml水中溶解100g電泳級(jí)SDS，加熱至68℃助溶，加幾滴濃鹽酸，調(diào)節(jié)pH至7.2，加水定容至1L。
(3).A液(2×SSC 0.1％SDS PH7.4)高溫高壓滅菌。
(4).B液(0.5×SSC 0.1％SDS pH7.4)高溫高壓滅菌。
(5).C液(0.1M檸檬酸鈉pH5.0)高溫高壓滅菌。
(6)3％過(guò)氧化氫溶液5、具體步驟(1)PCR(條件多種，僅舉其中之一)a.取DNA樣品8微升、雙蒸水13.66微升以及PCR反應(yīng)液3.34微升等物組成PCR反應(yīng)體系，共計(jì)25μl。
PCR反應(yīng)體系的配比中模板量(樣品) 8μl雙蒸水 13.66μlP1 25μmol/l(20～25均可) 0.2μlP2 25mol/l(20～25均可) 0.2μl10×Buffer 2.5μldNTP 10mmol/l0.2μlTaq酶 5U/μl 0.2μlUNG(尿嘧啶糖基化酶)1U/μl0.04μl其中P1的長(zhǎng)度為20bp，序列為5’-Biotin-cgt gag ggc atc gag gtg gc-3’，P2的長(zhǎng)度為20bp，序列為5’-gcg tag gcg tcg gtg aca aa-3’。
b.按以下程序進(jìn)行PCR反應(yīng)痰樣37℃ 5min，95℃ 5min，94℃ 40s，55℃ 50s，72℃ 1min，共計(jì)35個(gè)循環(huán)72℃ 10min；石蠟組織37℃ 5min，95℃ 5min，94℃ 40s，55℃ 50s，72℃ 1min，共計(jì)40個(gè)循環(huán)，72℃ 10min。
c.電泳(僅在必要時(shí)做)取5μl PCR產(chǎn)物加3μl 6×Loadingbuffer 150v，35min電泳。由于痰樣中極易出現(xiàn)較多且相近的雜帶，所以如僅根據(jù)電泳圖來(lái)判斷結(jié)核桿菌的結(jié)果，就容易發(fā)生判斷錯(cuò)誤。試驗(yàn)結(jié)果顯示，膜芯片雜交、顯色反應(yīng)的準(zhǔn)確率、檢出率均好于電泳觀察法。
(2)雜交a.55℃(50～60℃均可)預(yù)熱A液；3ml A液與膜芯片同時(shí)置入15ml有蓋的試管中，膜芯片置于液面以下。每管一條。保溫30～60min；b.變性產(chǎn)物PCR產(chǎn)物20-25μl置于98℃下10min，再置于冰上10min；c.雜交將b的產(chǎn)物加入a的產(chǎn)物中，55℃下保溫2h；同時(shí)預(yù)熱B液，55℃，40ml，30min；d.洗膜膜芯片取出放入已預(yù)熱的40ml B液中，保溫10min；e.酶聯(lián)取出膜芯片，置于1∶2000的親和素標(biāo)記的辣根過(guò)氧化物酶(POD液)與A液的混合液中，6～8條芯片可加5μl POD、10mlA液；4～5條則加4μlPOD、8ml A液；置于搖床上輕搖10min。
f.洗膜A液 室溫 20ml 15min 輕搖A液 室溫 20ml 10min 輕搖C液 室溫 20ml 10min 輕搖g.顯色反應(yīng)按順序加入以下試劑19ml C液+1ml TMB(四甲基聯(lián)苯胺)+10μl 3％過(guò)氧化氫避光顯色15minh.終止顯色芯片置于清水中(自來(lái)水即可)3～5min。
(3)判斷結(jié)果在兩個(gè)質(zhì)控點(diǎn)無(wú)異常的條件下，T1，T2，T3任何一點(diǎn)顯蘭色即可判定為陽(yáng)性。
PCR步驟之前樣品的DNA的提取方法可以多種多樣，使用者可根據(jù)自身情況、條件，尋找出合適的方法。以下僅各列舉兩種提取樣品的推薦方案(1)痰樣處理方法一①高溫高壓15min；②裝入1.5ml離心管，離心12000rpm.10min.去上清；③加入痰樣七倍體積的4％NaOH溶液，37℃水浴3h；④離心，12000rpm.10min.去上清；⑤沉淀用滅菌雙蒸水洗兩次；⑥加入100μl裂解液(5mMTris-HCI，5％Triton-100)，煮沸10min；⑦取上清用作PCR模板，剩余-20℃保存。
方法二①高溫高壓15min；②裝入1.5ml離心管，離心12000rpm.10min.去上清；③加入90μl的PK buffer+10μl PK(蛋白酶K20g/L)；(PK buffer100mMNaCl，5mMTris-HCl，25mMEDTA pH8.0，1％SDS)；④恒溫水浴37℃ 3h；⑤加入與步驟④樣品等體積的酚∶氯仿∶異戊醇混合液?；靹颍x心12000rpm10min，取水相轉(zhuǎn)移至一消毒過(guò)的1.5ml離心管中。酚∶氯仿∶異戊醇混合液配方為體積比25∶24∶1；⑥重復(fù)⑤一次；⑦加入0.5倍體積7.5M NH4AC或NaAC和3.5倍體積-20℃無(wú)水乙醇。-20℃放置1h。離心12000rpm 10min，倒棄乙醇；⑧加入-20℃保存的75％乙醇100μl，混勻，離心12000rpm 10min，倒棄乙醇，真空干燥(自然晾干也行)；⑨加入50μl滅菌雙蒸水，溶解DNA，20min，-20℃保存。
(2)組織處理(石蠟切片)方法一①取石蠟切片10～15μm切片2～3片，溶于0.5～1ml二甲苯，靜置10～15min，離心13000rpm 5min，棄上清；②重復(fù)①一次；③加入1ml無(wú)水乙醇，靜置3～5min，離心13000rpm，5min，棄上清；④重復(fù)③一次；⑤真空干燥；⑥加入裂解液100μl，37℃溫浴1h；⑦煮沸10min，取上清用作PCR模板，剩余-20℃保存。
方法二①取石蠟切片10～15μm切片2～3片，溶于0.5～1ml二甲苯，靜置10～15min，離心13000rpm 5min，棄上清；②重復(fù)①一次；③加入1ml無(wú)水乙醇，靜置3～5min，離心13000rpm，5min，棄上清；④重復(fù)③一次；⑤真空干燥；⑥5μl PK(20g/L)+90μl PK buffer，混勻，50℃1h.；⑦稍冷卻，追加10μl PK，混勻，置45℃消化過(guò)夜；接著按痰樣方法二⑤-⑨處理。
注文中所標(biāo)百分比濃度均為質(zhì)量百分比濃度。
權(quán)利要求
1.一種結(jié)核桿菌基因的檢測(cè)方法，其特征是使用一對(duì)特異引物P1和P2對(duì)結(jié)核桿菌特有的插入序列IS6110中的一段245bp區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中P1的5’端帶有生物素；將PCR產(chǎn)物與膜芯片上的探針進(jìn)行特異性雜交，再進(jìn)行酶聯(lián)反應(yīng)，最后通過(guò)顯色反應(yīng)判斷結(jié)果。
2.如權(quán)利要求1所述的結(jié)核桿菌基因的檢測(cè)方法，其特征是特異引物P1的序列為5’-Biotin-cgt gag ggc atc gag gtg gc-3’；特異引物P2的序列為5’-gcg tag gcg tcg gtg aca aa-3’。
3.如權(quán)利要求1或2所述的結(jié)核桿菌基因的檢測(cè)方法，其特征是膜芯片是在基質(zhì)尼龍膜上設(shè)置三個(gè)檢測(cè)探針T1、T2和T3以及兩個(gè)質(zhì)控探針P和N；質(zhì)控探針P的序列為5’-Biotin-cgt gag ggc atc gag gtg gc-3’檢測(cè)探針T1的序列為5’-ttt ttt ttg gct gtg gcc gga tca gcg atc gt-3’檢測(cè)探針T2的序列為5’-ttt ttt ttt gga cga gat cgg cgg gac ggg ct-3’檢測(cè)探針T3的序列為5’-ttt ttt tta ggt gct ggt ggt ccg aag cg-3’
全文摘要
一種結(jié)核桿菌基因的檢測(cè)方法，使用一對(duì)特異引物P1和P2對(duì)結(jié)核桿菌特有的插入序列IS6110中的一段245bp區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中P1的5’端帶有生物素；將PCR產(chǎn)物與膜芯片上的探針進(jìn)行特異性雜交，再進(jìn)行酶聯(lián)反應(yīng)，最后通過(guò)顯色反應(yīng)判斷結(jié)果。用本發(fā)明的方法檢測(cè)結(jié)核桿菌基因，檢出率比傳統(tǒng)涂片法檢出率高出一倍以上，且準(zhǔn)確性高、特異性好；檢測(cè)時(shí)所需樣品極少、使用設(shè)備普通、診斷結(jié)果直觀、探針雜交顯色靈敏，實(shí)現(xiàn)了高效、便利、靈敏、準(zhǔn)確。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1743462SQ20051001956
公開(kāi)日2006年3月8日 申請(qǐng)日期2005年10月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月1日
發(fā)明者何敏, 周凌云, 何曉 申請(qǐng)人:廣西醫(yī)科大學(xué)