專利名稱：檢測(cè)凝血酶、類凝血酶及凝血酶抑制劑的纖維蛋白原平板法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物蛋白酶特別是凝血酶、類凝血酶及凝血酶抑制劑檢測(cè)方法領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
凝血酶、類凝血酶及凝血酶抑制劑(如水蛭素、肝素)等廣泛存在于動(dòng)、植物中，是醫(yī)學(xué)、生物工程學(xué)及生物制藥的主要研究對(duì)象。對(duì)凝血酶、類凝血酶及其抑制劑進(jìn)行生物活性測(cè)定是科學(xué)研究與工業(yè)生產(chǎn)的必備條件。目前已建立的生物活性檢測(cè)方法主要有兩種凝血酶滴定法和凝血酶顯色底物法。凝血酶滴定法因其操作較為簡(jiǎn)便、快速，應(yīng)用最為廣泛。但存在用肉眼判斷凝固點(diǎn)(即反應(yīng)終點(diǎn))的差異大、檢品的濁度或顏色相互干擾、敏感度低(檢測(cè)到每毫升10酶活力單位)、定量不準(zhǔn)確等問(wèn)題。在有了人工合成的顯色底物后，用凝血酶顯色底物法實(shí)現(xiàn)了凝血酶的定量檢測(cè)，其敏感度大為提高(檢測(cè)到每毫升2.5酶活力單位)；但由于顯色底物試劑過(guò)于昂貴，測(cè)定時(shí)設(shè)備條件要求較高，檢品濁度或顏色也易受干擾，使其應(yīng)用受到限制。這對(duì)凝血酶、凝血酶抑制劑、類凝血酶(蛇毒降纖酶)等方面的深入研究與開(kāi)發(fā)利用帶來(lái)一定難度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種定量檢測(cè)凝血酶、類凝血酶及凝血酶抑制劑生物活性的簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、高敏感度、低成本的檢測(cè)方法。
本發(fā)明以如下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問(wèn)題采用纖維蛋白原平板法定量檢測(cè)凝血酶、類凝血酶及凝血酶抑制劑生物活性，方法是一、制板將加熱充分溶解的瓊脂糖和用0.1M pH7.4磷酸緩沖液溶解的纖維蛋白原，以重量比容積為1∶1的比例混合，在平皿中灌板，冷卻后即制成纖維蛋白原瓊脂平板。
二、打孔纖維蛋白原瓊脂平板冷卻后，按一定間距打孔。
三、標(biāo)準(zhǔn)品、檢品的準(zhǔn)備及加樣反應(yīng)用0.05M pH7.4磷酸緩沖液溶解標(biāo)準(zhǔn)品，并稀釋成系列濃度。用同樣的緩沖液溶解檢品并作適當(dāng)稀釋。將稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品、檢品分別在上述板孔中加樣。平皿加蓋后置37℃恒溫?cái)U(kuò)散反應(yīng)7-10小時(shí)。
四、測(cè)量反應(yīng)孔沉淀圈，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算結(jié)果在纖維蛋白原瓊脂平板加樣擴(kuò)散反應(yīng)后，可肉眼看到加樣孔由內(nèi)向外形成乳白色圓形沉淀圈，沉淀圈的大小與酶活力濃度成正相關(guān)。測(cè)量各標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)孔沉淀圈直徑，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪制酶活力單位標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)量各檢品反應(yīng)孔沉淀圈直徑，即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其酶活力單位數(shù)，乘以檢品的稀釋倍數(shù)即為檢品的實(shí)際酶活力單位數(shù)。
本發(fā)明的檢測(cè)凝血酶、類凝血酶及凝血酶抑制劑的纖維蛋白原平板法，操作簡(jiǎn)便、直觀、穩(wěn)定、敏感度高(檢測(cè)到每毫升0.15酶活力單位)，不受檢品濁度或顏色干擾，成本低廉。在普通實(shí)驗(yàn)室中只要有恒溫箱即可實(shí)施，是一種易于推廣使用的實(shí)驗(yàn)方法。


圖1為進(jìn)行類凝血酶檢測(cè)用的纖維蛋白原平板的照片。
圖2是實(shí)施例1的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
圖3是實(shí)施例2的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
圖4是實(shí)施例3的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
圖5是實(shí)施例4的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明主要是利用纖維蛋白原為底物，使用瓊脂糖與纖維蛋白原制作成纖維蛋白原瓊脂平板，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品及檢品在該平板上的擴(kuò)散反應(yīng)，對(duì)凝血酶、類凝血酶及凝血酶抑制劑進(jìn)行定量檢測(cè)。其基本原理在于將酶的底物—纖維蛋白原均勻地固定于瓊脂平板上，通過(guò)向樣孔內(nèi)加入酶溶液進(jìn)行擴(kuò)散反應(yīng)，酶在擴(kuò)散過(guò)程中與底物發(fā)生水解反應(yīng)，使纖維蛋白原水解成纖維蛋白，并發(fā)生交聯(lián)呈乳白色沉淀。白色沉淀圈大小與酶活力呈正相關(guān)。將已知活力單位的凝血酶、類凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成系列濃度及待檢樣品適當(dāng)稀釋，在纖維蛋白原平板進(jìn)行擴(kuò)散反應(yīng)，通過(guò)測(cè)量反應(yīng)孔沉淀圈大小即可繪制出相應(yīng)的酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)測(cè)量在相同條件下檢品反應(yīng)孔沉淀圈大小，即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對(duì)應(yīng)值而達(dá)到定量檢測(cè)的目的。
檢測(cè)凝血酶和類凝血酶的主要步驟是一、制作纖維蛋白原瓊脂平板(1)配制重量百分比(以下同)為2.5％瓊脂糖，加熱充分溶解。
(2)纖維蛋白原用0.1M pH7.4磷酸緩沖液溶解，與上述瓊脂糖(加熱至90～100℃)以重量比容積為1∶1的比例混合，在平皿中灌板，灌板厚度約為2毫米，冷卻后即制成纖維蛋白原瓊脂平板。
二、打孔在冷卻凝固的纖維蛋白原瓊脂平板上，按1.6厘米的間距打孔?？讖郊s為4毫米。
三、標(biāo)準(zhǔn)品、檢品的準(zhǔn)備及加樣反應(yīng)用0.05M pH7.4磷酸緩沖液溶解標(biāo)準(zhǔn)品，并稀釋成系列濃度。用同樣的緩沖液溶解檢品并根據(jù)不同要求作適當(dāng)稀釋。將稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品、檢品分別在上述纖維蛋白原瓊脂平板板孔中加樣，每孔加樣18μl。平皿加蓋后置37℃恒溫?cái)U(kuò)散反應(yīng)7-10小時(shí)。
四、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線、計(jì)算結(jié)果在纖維蛋白原瓊脂平板加樣擴(kuò)散反應(yīng)后，測(cè)量各標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)孔沉淀圈直徑(毫米)，在半對(duì)數(shù)座標(biāo)紙上繪制酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)量各檢品反應(yīng)孔沉淀圈直徑，即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相應(yīng)的酶活力單位，乘以檢品的稀釋倍數(shù)即為檢品的實(shí)際酶活性單位數(shù)。
凝血酶抑制劑-水蛭素的活性的定量檢測(cè)步驟是將水蛭素檢品用0.05M pH7.4磷酸緩沖液溶解，作2倍、4倍、8倍、16倍稀釋。用2.5U/ml凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品以1∶1的比例分別與上述稀釋的水蛭素混合(此時(shí)混合后水蛭素的稀釋倍數(shù)應(yīng)為4倍、8倍、16倍、32倍，凝血酶濃度應(yīng)為1.25U/ml)，置37℃反應(yīng)5分鐘，即可與各稀釋濃度的凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品在纖維蛋白原瓊脂平板上分別加樣，每孔加樣18μl，平皿加蓋后置37℃恒溫?cái)U(kuò)散反應(yīng)7-10小時(shí)。根據(jù)擴(kuò)散反應(yīng)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)量水蛭素檢品孔，即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出各孔凝血酶的剩余單位數(shù)。水蛭素的生物活性是用抑制一個(gè)活性單位的凝血酶的量來(lái)表示水蛭素一個(gè)抗凝血酶單位(ATU)。用參加反應(yīng)的凝血酶(1.25U/ml)的量與反應(yīng)后凝血酶的剩余量相減，再乘上水蛭稀釋倍數(shù)，即可計(jì)算出水蛭素檢品的實(shí)際活性單位。
實(shí)施例1凝血酶的定量檢測(cè)①配制2.5％瓊脂糖稱取2.5克瓊脂糖，置燒瓶中，加入蒸餾水至100ml，置100℃水浴約30分鐘，使瓊脂糖充分溶解備用。
②現(xiàn)配0.1％(百分比濃度，以下同)纖維蛋白原緩沖液稱取人纖維蛋白原8mg，用0.1M pH7.4磷酸緩沖液8ml溶解。
③制板取直徑為9厘米的平皿，放置水平的臺(tái)面上(用水平尺測(cè)量)。將配制好的2.5％瓊脂糖加熱至90～100℃，取8ml與0.1％纖維蛋白原緩沖液8ml混勻，立即倒入平皿中，室溫冷卻后即為纖維蛋白原平板。
④打孔在冷卻后的纖維蛋白原瓊脂平板上，按1.6厘米的間距打孔?？讖綖?毫米。
⑤標(biāo)準(zhǔn)品及檢品的準(zhǔn)備及加樣反應(yīng)用0.05M pH7.4磷酸緩沖液溶解標(biāo)準(zhǔn)品，并稀釋成5.0U/ml、2.5U/ml、1.25U/ml、0.62U/ml、0.31U/ml、0.15U/ml系列濃度。用同樣的緩沖液1ml溶解檢品，并作20倍、40倍、80倍稀釋。將稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品、檢品分別在上述板孔中加樣，每孔加樣18μl。平皿加蓋后置37℃恒溫?cái)U(kuò)散反應(yīng)9小時(shí)。
⑥繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線、計(jì)算結(jié)果使用油標(biāo)卡尺測(cè)量各反應(yīng)孔沉淀圈直徑(mm)大小；標(biāo)準(zhǔn)孔按5→0.15U/ml的順序，沉淀圈直徑依次為11.12mm，10.06mm，9.22mm，8.26mm，7.30mm，6.36mm；檢品孔取落在標(biāo)準(zhǔn)曲線中間的檢品孔進(jìn)行計(jì)算，稀釋80倍為8.98mm，在下述標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出的酶活性為1.07U/ml，乘上檢品的稀釋倍數(shù)80，檢品的實(shí)際酶活性為85.6單位/ml。
實(shí)施例2凝血酶的定量檢測(cè)步驟①～④同實(shí)施例1。
⑤標(biāo)準(zhǔn)品及檢品的準(zhǔn)備及加樣反應(yīng)用0.05M pH7.4磷酸緩沖液溶解標(biāo)準(zhǔn)品，并稀釋成5.0U/ml、2.5U/ml、1.25U/ml、0.62U/ml、0.31U/ml、0.15U/ml系列濃度。用同樣的緩沖液1ml溶解檢品，并作160倍稀釋。將稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品、檢品分別在上述板孔中加樣，每孔加樣18μl。平皿加蓋后置37℃恒溫?cái)U(kuò)散反應(yīng)7小時(shí)。
⑥繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算結(jié)果使用油標(biāo)卡尺測(cè)量各反應(yīng)孔沉淀圈直徑大小，標(biāo)準(zhǔn)孔按5→0.15U/ml的順序，沉淀圈直徑依次為7.94mm，7.62mm，7.20mm，6.78mm，6.24mm，5.94mm；檢品孔稀釋160倍為6.36mm，在下述標(biāo)準(zhǔn)曲線上檢出的酶活性為0.32U/ml，乘上檢品的稀釋倍數(shù)160，檢品的實(shí)際酶活性為51.2U/ml。
實(shí)施例3類凝血酶的定量檢測(cè)①同實(shí)施例1。
②現(xiàn)配0.15％纖維蛋白原緩沖液稱取人纖維蛋白原12mg，用0.1M pH7.4磷酸緩沖液8ml溶解。
③制板取直徑為9厘米的平皿，放置水平的臺(tái)面上(用水平尺測(cè)量)。將配制好的2.5％瓊脂糖加熱至90～100℃，取8ml與0.15％纖維蛋白原緩沖液8ml混勻，立即倒入平皿中，室溫冷卻后即為纖維蛋白原平板。
④打孔同實(shí)施例1。
⑤標(biāo)準(zhǔn)品及檢品的準(zhǔn)備及加樣反應(yīng)用0.05M PH7.4磷酸緩沖液溶解標(biāo)準(zhǔn)品，并稀釋成1.25U/ml、0.62U/ml、0.31U/ml、0.15U/ml、0.075U/ml系列濃度。用同樣的緩沖液1ml溶解檢品，并作10倍稀釋。將稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品、檢品分別在上述板孔中加樣，每孔加樣18μl。平皿加蓋后置37℃恒溫?cái)U(kuò)散反應(yīng)10小時(shí)。
⑥繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算結(jié)果使用油標(biāo)卡尺測(cè)量各反應(yīng)孔沉淀圈直徑大??；標(biāo)準(zhǔn)孔按1.25→0.075U/ml的順序，沉淀圈直徑依次為12.28mm，10.9mm，9.52mm，8.04mm，6.56mm；檢品孔稀釋10倍為10.68mm，在下述標(biāo)準(zhǔn)曲線上檢出的酶活性為0.56U/ml，乘上檢品的稀釋倍數(shù)10，檢品的實(shí)際酶活性為5.6U/ml。
實(shí)施例4凝血酶抑制劑生物活性的定量檢測(cè)制板、打孔同實(shí)施例1的①～④；標(biāo)準(zhǔn)品及檢品的準(zhǔn)備及加樣反應(yīng)凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品系列濃度稀釋同實(shí)施例1的⑤，水蛭素檢品用0.05M pH7.4磷酸緩沖液1ml溶解，作2倍、4倍、8倍、16倍稀釋。用稀釋好的2.5U/ml凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品按1∶1的比例分別與上述稀釋的水蛭素混合(此時(shí)混合后水蛭素的稀釋倍數(shù)應(yīng)為4倍、8倍、16倍、32倍，凝血酶濃度應(yīng)為1.25U/ml)，置37℃反應(yīng)5分鐘，即可在纖維蛋白原瓊脂平板上與標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)加樣，每孔加樣18μl，平皿加蓋后置37℃恒溫?cái)U(kuò)散反應(yīng)8小時(shí)。
繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算結(jié)果使用油標(biāo)卡尺測(cè)量各反應(yīng)孔沉淀圈直徑大??；標(biāo)準(zhǔn)孔按5→0.15U/ml的順序，沉淀圈直徑依次為10.88mm，9.74mm，8.88mm，7.8mm，6.90mm，6.48mm；檢品孔取落在標(biāo)準(zhǔn)曲線中間的檢品孔進(jìn)行計(jì)算，稀釋16倍為8.18mm，在下述標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出凝血酶的剩余單位數(shù)為0.7U/ml，被水蛭素抑制的凝血酶的量應(yīng)為1.25U/ml-0.7U/ml＝0.55ATU/ml。再乘上水蛭稀釋倍數(shù)，水蛭素檢品的實(shí)際為8.8ATU/ml。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)凝血酶、類凝血酶及凝血酶抑制劑的纖維蛋白原平板方法，利用纖維蛋白原為底物，其特征是步驟為a.制板將加熱充分溶解的瓊脂糖和用0.1M pH7.4磷酸緩沖液溶解的纖維蛋白原，以重量比容積為1∶1的比例混合，在平皿中灌板，冷卻后即制成纖維蛋白原瓊脂平板；b.打孔纖維蛋白原瓊脂平板冷卻后，按一定間距打孔；c.標(biāo)準(zhǔn)品、檢品的準(zhǔn)備及加樣反應(yīng)用0.05M pH7.4磷酸緩沖液溶解標(biāo)準(zhǔn)品，并稀釋成系列濃度；用同樣的緩沖液溶解檢品并作適當(dāng)稀釋；將稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品、檢品分別在上述板孔中加樣。平皿加蓋后置37℃恒溫?cái)U(kuò)散反應(yīng)7-10小時(shí)；d.測(cè)量反應(yīng)孔沉淀圈，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算結(jié)果在纖維蛋白原瓊脂平板加樣擴(kuò)散反應(yīng)后，可肉眼看到加樣孔由內(nèi)向外形成乳白色圓形沉淀圈，沉淀圈的大小與酶活力濃度成正相關(guān)；測(cè)量各標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)孔沉淀圈直徑，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪制酶活力單位標(biāo)準(zhǔn)曲線；測(cè)量各檢品反應(yīng)孔沉淀圈直徑，即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其酶活力單位數(shù)，乘以檢品的稀釋倍數(shù)即為檢品的實(shí)際酶活力單位數(shù)。
2.如權(quán)利要求書(shū)所述的檢測(cè)凝血酶、類凝血酶及凝血酶抑制劑的纖維蛋白原平板方法，其特征是凝血酶抑制劑-水蛭素的活性的定量檢測(cè)步驟是將水蛭素檢品用0.05M pH7.4磷酸緩沖液溶解，并作適當(dāng)倍數(shù)稀釋，凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品以1∶1的比例分別與上述稀釋后不同濃度的水蛭素混合稍置后，即與各稀釋濃度的凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品在纖維蛋白原瓊脂平板上分別加樣，恒溫?cái)U(kuò)散反應(yīng)；根據(jù)擴(kuò)散反應(yīng)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)量水蛭素檢品孔，即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出各孔凝血酶的剩余單位數(shù)；用參加反應(yīng)的凝血酶的量與反應(yīng)后凝血酶的剩余量相減，再乘上水蛭稀釋倍數(shù)，即可計(jì)算出水蛭素檢品的實(shí)際活性單位。
全文摘要
一種檢測(cè)凝血酶、類凝血酶及凝血酶抑制劑的纖維蛋白原平板方法，使用瓊脂糖與纖維蛋白原制作成纖維蛋白原瓊脂平板，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品及檢品在該平板上的擴(kuò)散反應(yīng)作定量檢測(cè)。本發(fā)明的檢測(cè)凝血酶、類凝血酶及凝血酶抑制劑的纖維蛋白原平板法，操作簡(jiǎn)便、直觀、穩(wěn)定、敏感度高(檢測(cè)到每毫升0.15酶活力單位)，不受檢品濁度或顏色干擾，成本低廉。在普通實(shí)驗(yàn)室中只要有恒溫箱即可實(shí)施，是一種易于推廣使用的實(shí)驗(yàn)方法。
文檔編號(hào)C12Q1/56GK1763219SQ200510019588
公開(kāi)日2006年4月26日 申請(qǐng)日期2005年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月11日
發(fā)明者廖共山, 班建東 申請(qǐng)人:廣西醫(yī)科大學(xué)