專利名稱：利用水稻核蛋白基因OsSKIP1促進植物在逆境條件下的生長的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物生物技術領域。具體涉及一種水稻DNA片段(基因)的分離克隆、功能驗證和應用。所述的基因OsSKIP1與植物生長有關。將該基因的完整翻譯區(qū)(Coding sequence)與花椰菜花葉病毒啟動子(CaMV35S)結合后直接轉入水稻，轉基因植株在逆境條件下的生長速度顯著提高；而通過RNAi技術抑制內(nèi)源基因OsSKIP1的表達則顯著降低植株生長速度。
背景技術：
植物的生長速度除了有其固有的遺傳基礎外，往往還會受到諸多環(huán)境因素的影響，其中一些不利的非生物逆境(如干旱、高溫、低溫或鹽害等)往往限制了植物正常生長，從而造成作物減產(chǎn)。非生物逆境在許多地區(qū)是農(nóng)業(yè)發(fā)展的瓶頸，因此，培育抗逆性作物品種一直是農(nóng)業(yè)科學技術研究的主要目標之一。為了抵抗或適應環(huán)境不利因素，植物體感受細胞外環(huán)境條件的變化并通過多種途徑將其傳遞到細胞內(nèi)，會誘導表達一些應答基因，產(chǎn)生一些使細胞免受干旱、高鹽、低溫等脅迫傷害的功能蛋白、滲透調節(jié)物質以及傳遞信號和調控基因表達的轉錄因子，從而對外界的變化做出相應的反應(Xiong等，Cell signaling during cold，drought andsalt stress.Plant Cell.14(suppl)，S165-S183，2002)。而那些功能基因對環(huán)境做出反應的過程中能否正確表達受到調控因子的精細調節(jié)。轉錄因子作為一種調控基因，當生物體感受逆境脅迫時，能調控一系列下游基因的表達，從而增強植物體對逆境的耐受能力，達到抵抗不良環(huán)境條件脅迫的效果。Kawasaki等(2001)利用表達芯片分析了水稻在高鹽脅迫下的早期表達譜，發(fā)現(xiàn)有大量的基因能被誘導或抑制，這些基因的誘導表達受到了轉錄因子的調節(jié)參與(Kawasaki S，Borchert C，Deyholos M，Wang H，Brazille S，KawaiK，Galbraith D and Bohnert H J.Gene expression profiles during the initial phase of salt stressin rice.Plant Cell，13889-905，2001)。而在擬南芥中發(fā)現(xiàn)AP2/EREBP，Zinc finger，Myb，bZIP類轉錄因子家族在不同的逆境脅迫下，可誘導表達或被抑制(Shinozaki等，Monitoring the Expression Patternof 1300 Arabidopsis Genes under Drought and Cold Stresses by Using a Full-Length cDNA Microarray.Plant Cell，1361-72，2001)。因而認為這些轉錄因子家族在植物對逆境的應答過程中起著非常重要的調控作用。因此分離和鑒定對逆境起核心調控作用的轉錄因子，并用于作物抗逆境的遺傳改良有著重要的意義。根據(jù)已有的擬南芥轉錄因子的信息，人們已在植物抗性改良方面作了嘗試，利用DREB1A和DREB2A培育的轉基因擬南芥植株，其低溫耐性和干旱，高鹽耐性都比野生型強(Liu Q等，Two transcription factors，DREB1and DREB2，with an EREBP/AP2 DNA domains separate two cellular signal thansduction pathways indrought-and low-temperature-responsive gene expression，respectively，in Arabidopsis.Plant Cell，101391-1406，1998)。美國Michigan州立大學的Thomashow MF研究小組利用擬南芥CBF1基因，進行遺傳轉化，也培育出耐寒性增強的植株(Jaglo-Ottosen等，Arabidopsis CBF1 overexpression induces CORgenes and enhances freezing tolerance.Science，280(5360)104-106，1998)。近年來，通過遺傳轉化其它類型的轉錄因子來提高植物的抗逆性的報道也不少，如擬南芥NAC基因(Tran等，Isolation andfunctional analysis of Arabidopsis stress-inducible NAC transcription factors that bind to adrought-responsive cis-element in the early responsiye to dehydration stress 1 promoter.Plant Cell，162481-2498，2004)，水稻鋅指蛋白基因OSISAP1(Mukhopadhyay等，Overexpression of a zinc-fingerprotein gene from rice confers tolerance to cold，dehydration，and salt stress in transgenic tobacco.Proc Natl Acad Sci U S A，1016309-6314，2004)。
這些已經(jīng)報道的轉錄調控基因所介導的抗逆性通常是使植物對極端逆境的耐受能力增強，但對于逆境條件下植物生長速度的影響還無詳細研究。由于植物在遭受逆境脅迫時生長往往受阻(如水稻在孕穗期遭受干旱脅迫會延遲抽穗)，甚至暫時停止生長，這是植物避開不利環(huán)境的自我保護機制。但是，這種逆境導致的生長減緩往往使植物體變小、生育期延長從而使產(chǎn)量降低。因此，植物抗逆性遺傳改良不僅要增強植物對極端逆境的耐受能力，更為重要的是要把植物在逆境條件下的生長受阻降低到最低程度。
水稻是最重要的糧食作物之一，培育抗逆水稻新品種具有重要意義。在我們的前期研究中分離到一條受干旱誘導的cDNA，序列分析表明它與人類和動物中的SKIP(Ski-interacting protein)蛋白有一定的相似性。SKIP可能是一個起核心作用的核蛋白，通過它與眾多不同的核蛋白互作來實現(xiàn)對基因組的表達調控(Scott等，CHES1/FOXN3 interacts with Ski-interacting protein and acts as a transcriptional repressor.Gene，359119-126，2005；Leong等，Ski-interacting protein interacts with Smad proteins to augmenttransforming growth factor-beta-dependent transcription.J Biol Chem.27618243-8，2001；Prathapam等，Ski interacts with the evolutionarily conserved SNW domain of Skip.Nucleic Acids Res.2293469-76，2001)。目前在植物中尚無SKIP同源基因的報道。因此，從水稻中分離出SKIP同源基因并鑒定它對水稻在非生物逆境條件下的生長速度的影響，對于培育抗逆水稻新品種將具有非常重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是從水稻中分離克隆一個包含核蛋白同源基因完整編碼區(qū)段的DNA片段，利用該基因提高水稻或其它植物在逆境和/或正常條件下的生長速度。對這個基因編碼的蛋白序列進行分析表明它與人類和動物中的SKIP(Ski-interacting protein)蛋白有一定的相似性，因此被命名為OsSKIP1。
本發(fā)明涉及分離和應用一種包含OsSKIP1基因的DNA片段，該片段賦予植物(例如水稻)在在正常和逆境條件下的生長速度加快的能力。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO1所示，或者基本上相當于SEQ ID NO1所示的高度同源DNA序列，或者其功能相當于SEQ ID NO1所示序列的亞片段。
可以采用已經(jīng)克隆的OsSKIP1基因作探針，從cDNA和基因組文庫中篩選得到本發(fā)明的基因或同源基因。同樣，也可以采用PCR(polymerase chain reaction)技術，從基因組、mRNA和cDNA中擴增得到本發(fā)明的OsSKIP1基因以及任何感興趣的一段DNA或與其同源的一段DNA。采用以上技術，可以分離得到包含OsSKIP1基因的序列，將這一序列與任何一種可以引導外源基因在植物中表達的載體連接后轉化植物，可獲得在正常和逆境條件下的生長速度加快的轉基因植株。本發(fā)明的基因在構建到植物表達載體中時，在其轉錄起始核苷酸前加上任何一種強啟動子或誘導型啟動子。本發(fā)明的基因在構建到植物表達載體中時，也可使用增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子和鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的翻譯。
攜帶有本發(fā)明OsSKIP1基因的表達載體可通過使用Ti質粒，植物病毒載體，直接DNA轉化，微注射，電穿孔等常規(guī)生物技術方法導入植物細胞(Weissbach，1998，Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，pp.411-463；Geiserson and Corey，1998，Plant Molecular Biology(2ndEdition)。
可使用包括本發(fā)明的OsSKIP1基因的表達載體轉化宿主是包括水稻在內(nèi)多種植物，培育抗旱，抗鹽或抗寒的植物品種。
本發(fā)明基因是受逆境誘導表達的，因此可將本發(fā)明的基因與任何感興趣的逆境誘導啟動子結合后連入合適的表達載體，并轉化植物宿主，在逆境條件下可誘導表達基因，提高植物在逆境條件下的生長速度。
下面結合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步說明。


序列表SEQ ID No1顯示的是本發(fā)明分離克隆的包含有OsSKIP1基因編碼區(qū)和啟動子區(qū)的DNA片段序列。
圖1是本發(fā)明利用ClustalW軟件(公開使用軟件)將OsSKIP1基因預測的蛋白序列與SKIP同源蛋白序列進行比對的結果。
圖2是本發(fā)明利用RT-PCR檢測OsSKIP1基因在不同組織中的的表達水平。圖中1.分蘗期的根；2.劍葉；3.莖；4.短于1cm的幼穗；5.3-5cm的幼穗；6.長于10cm的幼穗；7.雄蕊；8.雌蕊；9.發(fā)芽3天的幼苗；3周的幼葉；10.3周的幼苗；11.3周的黃化苗。
圖3是本發(fā)明的OsSKIP1基因的啟動子控制的GUS報告基因在轉基因水稻中的表達情況。其中A為對照植株；B為轉基因植株；C為對照植株 D為轉基因植株E為對照植株；F為轉基因植株；G為對照植株；H轉基因植株I上為對照植株；I下為轉基因植株；J為轉基因植株愈傷時期的GUS染色圖。
圖4是本發(fā)明的RNAi轉基因植株T1代種子無菌條件下在含125μMG418(一種在植物轉基因篩選中使用的商品化的抗生素)的生根培養(yǎng)基上發(fā)芽(經(jīng)PCR檢測，G418上能發(fā)芽的均為轉基因陽性)，對照(野生型中花11)三天后在不含抗生素的生根培養(yǎng)基上發(fā)芽，長到大小基本一致移栽。圖為其中一個RNAi轉基因植株(S59R)和對照(ZH11)的生長曲線。
圖5是本發(fā)明在水培條件下10個代表性OsSKIP1抑制表達轉基因家系(T1)的生長速度(生長天后的株高和鮮重)。其中1號家系為轉基因陰性。
圖6是本發(fā)明在水培條件下代表性OsSKIP1超量表達轉基因家系(T1)和對照的生長速度比較。
圖7是本發(fā)明在不同逆境條件下5個OsSKIP1超量表達轉基因家系(T1)和對照的生長速度比較。
圖8本發(fā)明的超量表達載體OsSKIP1pCAMBIA1301的結構示意圖。將本發(fā)明實施實例中用到的啟動子CaMV35S插入pCAMBIA1301多克隆位點EcoRI和SacI處，再將OsSKIP1全長基因插入該啟動子后。
圖9本發(fā)明的抑制表達載體OsSKIP1’pHellsgate2的結構示意圖。將OsSKIP1的一段特異序列重組到抑制表達載體pHellsgate2上。
圖10本發(fā)明的啟動子表達載體OsSKIP1PpCAMBIAI1391Z載體結構示意圖。將OsSKIP1的啟動子插入pCAMBIAI1391Z的多克隆位點。
具體實施例方式
本發(fā)明的前期工作獲得了來源于水稻品種“明恢63”(一種中國普遍推廣應用的一個雜交水稻親本)的cDNA克隆V2CHIP15006。該cDNA是OsSKIP1基因的cDNA片段，是一個影響植物生長速度的SKIP同源基因。主要依據(jù)有以下幾個方面(1)采用cDNA芯片技術分析發(fā)現(xiàn)cDNA克隆V2CHIP15006在水稻品種“中旱5號”(由中國上海農(nóng)科院提供的一個公開使用的一個水稻品種)干旱脅迫處理15天后表達量增加2.1倍。對其進行測序，分析發(fā)現(xiàn)其編碼產(chǎn)物與人蛋白SKIP同源性高達62.3％，且含有保守的SNW結構域(圖1)，據(jù)此將此基因命名為OsSKIP1。(2)對其進行逆境條件下的表達譜分析，發(fā)現(xiàn)在脅迫處理的過程中，表達量有明顯的提高，RT-PCR(圖2)和啟動子表達活性分析(圖3)表明OsSKIP1在不同組織中均有一定表達量。(3)通過RNAi技術抑制水稻內(nèi)源基因OsSKIP1的表達，轉基因植株與對照植株相比，其生長速度大大降低((圖4，圖5)；而將其全長基因在植株中超量表達后，轉基因植株與對照植株相比，無論在正常生長條件還是在逆境條件下其生長速度都顯著要快(圖6，圖7)。這些結果都表明OsSKIP1基因不僅是水稻中一個新的SKIP同源基因，并且可用于調控植物的生長速度。
以下實施例進一步定義本發(fā)明，并描述了本發(fā)明在上述前期工作基礎上分離克隆包含有OsSKIP1基因完整編碼區(qū)段的DNA片段以及驗證OsSKIP1基因功能的方法。根據(jù)以下的描述和這些實施例，本領域技術人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明做出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。
實施例1分離克隆包含有OsSKIP1基因區(qū)段的DNA片段和OsSKIP1基因通過水稻品種“中旱5號”(由中國上海農(nóng)科院提供的一個公開使用的一個水稻品種)的干旱誘導基因表達譜分析，發(fā)現(xiàn)了一個受干旱誘導(干旱脅迫后期表達量提高2.1倍)的EST(表達序列簽)，經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因(OsSKIP1)編碼產(chǎn)物與人蛋白SKIP有62.3％同源性，并且是5’端部分序列。通過查找日本水稻全長數(shù)據(jù)庫(http://cdna01.dna.affrc.go.jp)，找到其所對應的cDNA克隆JO13098N03，并將其定位于第2染色體BAC克隆AP004159的34212 bp-36565 bp上。根據(jù)BAC克隆AP004159中OsSKIP1對應的基因組序列，預測其啟動子區(qū)域，并設計引物PF(5’-TAGGTACCGATCGCGTTGCCCAAATAATTAC，見序列表SEQ ID NO1所示，該序列特異引物外加接頭KpnI位點)和PR(5’-TAGGATCCCAGAACACGGAATTTATGTATC，見序列表SEQ ID NO1所示，在該序列特異引物外外加接頭BamHI)，將BAC克隆AP004159的34212 bp-36581bp從“明恢63”(一個中國普遍推廣應用的一個雜交水稻親本)的總DNA中擴增出來。擴增產(chǎn)物就是本發(fā)明的序列1-2351bp。具體步驟為提取水稻品種“明恢63”葉片中的總DNA(CTAB法抽提，參照文獻Zhang等，genetic diversity and differentiation of indica an japonica rice detected by RFLP analysis，Theor Appl Genet，83，495-499，1992)作為模板進行擴增，反應條件為94℃預變性3min；94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 3min，30個循環(huán)；72℃延伸5min。將擴增獲得的PCR產(chǎn)物連入pGEM-T載體(購自Promega公司)，篩選陽性克隆并測序(ABI3730測序儀)，獲得所需的包含有OsSKIP1基因的DNA片段。該克隆命名為pGEM-OsSKIP1。
采用TRIZOL試劑(購自Invitrogen公司)從干旱脅迫處理的水稻品種“中旱5號”中提取葉片總RNA(提取方法根據(jù)上述TRIZOL試劑說明書)，利用反轉錄酶SSII(購自Invitrogen公司)將其反轉錄合成cDNA第一鏈，反應條件為65℃ 5min，42℃ 50min，70℃ 10min。用上述引物(PF和PR)擴增出OsSIPK1基因的全長cDNA。PCR反應條件為94℃預變性2min；94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 2min，30個循環(huán)；72℃延伸5min。將擴增獲得的PCR產(chǎn)物連入pGEM-T載體(購自Promega公司)，篩選陽性克隆并測序，獲得所需的全長基因cDNA。該克隆命名為pGEM-OsSKIP1c。
實施例2，OsSKIP1基因抑制表達、超量表達以及啟動子表達載體的構建和轉化為了能更好地闡明此基因的功能，申請人將其在水稻中抑制表達和超量表達，從轉基因植株的表型來驗證；同時也將其啟動子融合于GUS報告基因后轉化水稻，檢測其活性。
抑制表達(RNAi)載體構建方法如下本發(fā)明如圖9所示首先用RNAi引物V15006F(5’-CACCGACTCTGGGTTTGCTACAG)和V15006R(5’-AAGATGCCCCTTGGAAGTAGA)以從實施例1獲得的克隆pGEM-OsSKIP1c為模板擴增出OsSKIP1基因的特異片段(572bp)。反應條件為94℃預變性2min；94℃30sec，55℃ 30sec，72℃ 2min，30個循環(huán)；72℃延伸5min。將該片段亞克隆到pGEM-T載體上。再用引物ALLF(5’-GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTT AAT ACG ACT CAC TAT AGG G)和ALLR(5’-GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTA TTT AGG TGA CAC TAT AG)從帶有該片段的pGEM-T載體上擴增出一條可供重組到pHellsgate2載體上的片段(622 bp)。PCR條件同上。重組反應按Invitrogen公司提供的重組克隆試劑盒說明書進行。pHellsgate2是已公開發(fā)表的專門用于RNAi載體構建的載體(Wesley等，Construct design for efficient，effective and high-throughput gene silencing inplants.Plant J，27581-590，2001)。
超量表達載體構建方法如下如圖8所示首先將實施例1中得到的陽性克隆pGEM-OsSKIP1質粒用BamHI和KpnI雙酶切，回收外源片段；同時，用同樣的方法酶切攜帶不同啟動子的遺傳轉化載體pC1301S酶切完畢，用氯仿∶異戊醇(按體積比24∶1)抽提，純化酶切產(chǎn)物。用包含OsSKIP1基因的酶切片段和酶切后的載體做連接反應，轉化大腸桿菌DH10β(菌株購自Invitrogen公司)。通過酶切篩選陽性克隆，獲得轉化載體。遺傳轉化的載體pC1301S是在國際上常用的植物遺傳轉化載體pCAMBIA1301(其構建見圖8，其原始載體來自澳大利亞CAMBIA[Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture]實驗室)基礎上，在酶切位點EcoRI和SacI處引入廣泛使用的組成型表達的CaMV 35S啟動子而得到的。
啟動子與報告基因的融合載體構建方法如下如圖10所示OsSKIP1啟動子序列通過引物5’-TAAAGCTTTGTTTGTGCTTTTGGAG和5’TAAGAATTCTTTGGTTCGATTCGTGTAAT，見序列表SEQ ID NO2所示(擴增產(chǎn)物對應NCBI數(shù)據(jù)庫中BAC克隆AP004159的36566-37565 bp)，以水稻品種明恢63的基因組DNA為模板擴增獲得；通過HindIII和EcoRI將OsSIPK1啟動子序列酶切后連接到國際上常用的植物啟動子活性檢測載體pCAMBIA1391Z(來自澳大利亞CAMBIA實驗室)中的GUS報告基因前面。
通過農(nóng)桿菌介導的水稻遺傳轉化體系將其導入到水稻品種中花11(中國水稻研究所提供的一個公開使用的一個水稻品種)中，經(jīng)過預培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、篩選具有潮霉素或G418抗性的愈傷、分化、生根、練苗移栽，得到轉基因植株。農(nóng)桿菌介導的水稻(粳稻亞種)遺傳轉化體系在Hiei等人報道的方法(Hiei等，Efficient transformation of rice，Oryza sativa L.，mediated byAgrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA，Plant J，6271-282，1994)基礎上改良進行。
具體步驟(1)愈傷誘導將成熟的水稻種子(水稻品種“中花11”)去殼，然后依次用70％的乙醇處理1分鐘，0.15％氯化汞(HgCl2)種子表面消毒15分鐘；用滅菌水洗種子4-5次；將種子放在誘導培養(yǎng)基上；將接種后的培養(yǎng)基置于黑暗處培養(yǎng)4周，溫度25±1℃。(2)愈傷繼代挑選亮黃色、緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于繼代培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25±1℃。(3)預培養(yǎng)挑選緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于預培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25±1℃。(4)農(nóng)桿菌培養(yǎng)在帶有對應抗性選擇的LA培養(yǎng)基上預培養(yǎng)農(nóng)桿菌EHAi05(來源于CAMBIA，商用菌株)兩天，溫度28℃；將農(nóng)桿菌轉移至懸浮培養(yǎng)基里，28℃搖床上培養(yǎng)2-3小時。(5)農(nóng)桿菌侵染將預培養(yǎng)的愈傷轉移至滅菌好的瓶子內(nèi)；調節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液至OD6000.8-1.0；將愈傷在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；轉移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；然后放置在共培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天，溫度19-20℃。(6)愈傷洗滌和選擇培養(yǎng)滅菌水洗滌愈傷至看不見農(nóng)桿菌；浸泡在含400ppm羧芐青霉素(CN)的滅菌水中30分鐘；轉移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；轉移愈傷至選擇培養(yǎng)基上選擇2-3次，每次培養(yǎng)2周(第一次篩選用400ppm羧芐青霉素+250ppm潮霉素，第二次以后為250ppm羧芐青霉素以+250ppm潮霉素)。(7)分化將抗性愈傷轉移至預分化培養(yǎng)基上黑暗處培養(yǎng)5-7周；轉移預分化培養(yǎng)的愈傷至分化培養(yǎng)基上，光照下培養(yǎng)，溫度26℃。(8)生根剪掉分化時產(chǎn)生的根；然后將其轉移至生根培養(yǎng)基中光照下培養(yǎng)2-3周，溫度26℃。(9)移栽洗掉根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉入溫室，同時在最初的幾天保持水分濕潤。
上述步驟的培養(yǎng)基如下所述試劑配方(1)試劑和溶液縮寫本發(fā)明中培養(yǎng)基所用到的植物激素的縮寫表示如下6-BA(6-芐基腺嘌呤)；CN(羧芐青霉素)；KT(激動素或稱細胞分裂素)；NAA(萘乙酸)；IAA(吲哚乙酸)；2，4-D(2、4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(水解酪蛋白)；HN(HygromycinB，潮霉素)；DMSO(二甲基亞砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6mix(N6微量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmix(MS微量成分溶液)(2)主要溶液配方1)N6培養(yǎng)基大量元素母液[10倍濃縮液(10X)]的配制硝酸鉀(KNO3) 28.3g磷酸二氫鉀(KH2PO4)4.0g硫酸銨((NH4)2SO4) 4.63g硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 1.85g氯化鈣(CaCl2·2H2O) 1.66g逐一溶解，然后室溫下定容至1000ml。
2)N6培養(yǎng)基微量元素母液[100倍濃縮液(100X)]的配制碘化鉀(KI)0.08g硼酸(H3BO3) 0.16g硫酸錳(MnSO4·4H2O) 0.44g硫酸鋅(ZnSO4·7H2O) 0.15g室溫下溶解并定容至1000ml。
3)鐵鹽(Fe2EDTA)貯存液(100X)的配制準備800ml雙蒸水并加熱至70℃，加入乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA·2H2O)3.73克，充分溶解后在70℃水浴中保持2小時，定容至1000ml，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 4)維生素貯存液(100X)配制煙酸(Nicotinic acid) 0.1g維生素B1(Thiamine HCl)0.1g維生素B6(Pyridoxine HCl) 0.1g甘氨酸(Glycine) 0.2g肌醇(Inositol)10g加水定容至1000ml，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 5)MS培養(yǎng)基大量元素母液(10X)的配制硝酸銨(NH4NO3)16.5g硝酸鉀19.0g磷酸二氫鉀1.7g硫酸鎂3.7g
氯化鈣 4.4g室溫下溶解并定容至1000ml。
6)MS培養(yǎng)基微量元素母液(100X)的配制碘化鉀 0.083g硼酸 0.62g硫酸錳 0.86g鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)0.025g硫酸銅(CuSO4·5H2O) 0.0025g室溫下溶解并定容至1000ml。
7)2，4-D貯存液，6-BA貯存液，萘乙酸(NAA)貯存液，吲哚乙酸(IAA)貯存液1均為mg/ml。
8)葡萄糖貯存液0.5g/ml。
9)AS貯存液的配制秤取AS 0.392g，DMSO 10ml。
(3)用于水稻遺傳轉化的培養(yǎng)基配方1)誘導培養(yǎng)基N6max母液(10X)100mlN6mix母液(100X) 10mlFe2+EDTA貯存液(100X) 10ml維生素貯存液(100X)10ml2，4-D貯存液 2.5ml脯氨酸(Proline) 0.3gCH0.6g蔗糖(Sucrose) 30gPhytagel 3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調節(jié)pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。
2)繼代培養(yǎng)基N6max母液(10X) 100mlN6mix母液(100X)10mlFe2+EDTA貯存液(100X) 10ml維生素貯存液(100X) 10ml2，4-D貯存液 2.0ml脯氨酸 0.5gCH 0.6g蔗糖 30gPhytagel 3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調節(jié)pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。
3)預培養(yǎng)基N6max母液(10X) 12.5mlN6mix母液(100X)1.25mlFe2+EDTA貯存液(100X) 2.5ml維生素貯存液(100X) 2.5ml2，4-D貯存液 0.75mlCH 0.15g蔗糖 5g瓊脂粉(Agarose)1.75g加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調節(jié)pH值到5.6，封口滅菌。使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250μl AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。
4)共培養(yǎng)基N6max母液(10X) 12.5mlN6mix母液(100X)1.25mlFe2+EDTA貯存液(100X) 2.5ml維生素貯存液(100X) 2.5ml2，4-D貯存液 0.75mlCH 0.2g蔗糖 5g瓊脂粉 1.75g加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調節(jié)pH值到5.6，封口滅菌。使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250μl AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/每皿)。
5)懸浮培養(yǎng)基N6max母液(10X) 5mlN6mix母液(100X) 0.5mlFe2+EDTA貯存液(100X)0.5ml維生素貯存液(100X) 1ml2，4-D貯存液0.2mlCH 0.08g蔗糖2g加蒸餾水至100ml，調節(jié)pH值到5.4，分裝到兩個100ml的三角瓶中，封口滅菌。使用前加入1ml葡萄糖貯存液和100μl AS貯存液。
6)選擇培養(yǎng)基N6max母液(10X) 25mlN6mix母液(100X) 2.5mlFe2+EDTA貯存液(100X) 2.5ml維生素貯存液(100X) 2.5ml
2，4-D貯存液0.625mlCH 0.15g蔗糖7.5g瓊脂粉 1.75g加蒸餾水至250ml，調節(jié)pH值到6.0，封口滅菌。使用前溶解培養(yǎng)基，加入250μl HN和400ppm CN，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。
7)預分化培養(yǎng)基N6max母液(10X)25mlN6mix母液(100X) 2.5mlFe2+EDTA貯存液(100X) 2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml6-BA貯存液0.5mlKT貯存液 0.5mlNAA貯存液 50μlIAA貯存液 50μlCH0.15g蔗糖 7.5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調節(jié)pH值到5.9，封口滅菌。使用前溶解培養(yǎng)基，加入250μl HN和200ppm CN，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。
8)分化培養(yǎng)基N6max母液(10X)100mlN6mix母液(100X) 10mlFe2+EDTA貯存液(100X) 10ml維生素貯存液(100X)10ml6-BA貯存液2mlKT貯存液 2mlNAA貯存液 0.2mlIAA貯存液 0.2mlCH1g蔗糖 30gPhytagel 3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調節(jié)pH值到6.0。煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口滅菌。
9)生根培養(yǎng)基MSmax母液(10X)50mlMSmix母液(100X) 5ml
Fe2+EDTA貯存液(100X) 5ml維生素貯存液(100X) 5ml蔗糖 30gPhytagel 3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調節(jié)pH值到5.8。煮沸并定容至1000ml，分裝到生根管中(25ml/管)，封口滅菌。
將OsSKIP1抑制表達的轉基因水稻植株分別命名為S59-N(其中S59為pHellsgate2-OsSKIP1載體，含有組成型啟動子CaMV 35S，N獨立轉化植株的編號)；將OsSKIP1超量表達的轉基因水稻植株分別命名為S60-N(S60為pC1301S-OsSKIP1載體，含有組成型啟動子CaMV 35S)；將OsSKIP1啟動子與GUS報告基因的融合載體的轉基因水稻植株分別命名為S61-N(S61為pCAMBIA1391-OsSKIP1-P載體，含有OsSKIP1啟動子和GUS報告基因)。每個轉化載體獲得了至少30株獨立的轉基因水稻植株，本發(fā)明總共獲得獨立轉基因水稻植株101株。
實施例3檢測水稻內(nèi)源基因OsSKIP1的表達水平以水稻品種“明恢63”為材料，提取不同生長時期的組織的RNA用RT-PCR檢測OsSKIP1基因的表達水平。選取的10種組織分別是1.分蘗期的根；2.劍葉；3.莖；4.短于1cm的幼穗；5.3-5的幼穗；6.長于10cm的幼穗；7.雄蕊；8.雌蕊；9.發(fā)芽3天的幼苗；10發(fā)芽3周的幼葉；11.3周的黃化苗?？俁NA采用TRIZOL試劑(購自Invitrogen公司)提取(提取方法根據(jù)上述TRIZOL試劑說明書)，利用反轉錄酶SSII(購自Invitrogen公司)將其反轉錄合成cDNA第一鏈(方法根據(jù)反轉錄酶試劑說明書)，反應條件為65℃ 5min，42℃ 50min，70℃ 10min。以cDNA第一鏈為模板，采用引物(5’-GACTCTGGGTTTGCTACAG和5’-AAGATGCCCCTTGGAAGTAGA)PCR擴增出OsSKIP1基因的特異片段(572bp)。采用引物(AF5’-GCGTCGACTCCACTCTCGC和AR5’-CCATGAAACAAATCCAACAACA)擴增出的水稻Actin1基因的特異片段(1400bp)以作為內(nèi)對照進行定量分析。反應條件為94℃預變性2min；94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 2min，30個循環(huán)；72℃延伸5min。將擴增出的OsSKIP1基因及Actin1基因的特異帶的亮度進行比較，并以Actin1基因的特異帶的亮度為標準進行均一化后比較不同組織中OsSKIP1基因的表達量。結果表明OsSKIP1基因在所選取的組織中均有一定量的表達，但以黃化苗和幼穗中表達量相對較高(圖2)。
啟動子活性分析將OsSKIP1基因啟動子序列通過引物5’-TAAAGCTTTGTTTGTGCTTTTGGAG和5’-TAAGAATTCTTTGGTTCGATTCGTGTAAT(擴增產(chǎn)物對應NCBI數(shù)據(jù)庫中BAC克隆AP004159的36566-37565bp)從水稻品種明恢63擴增獲得后，通過HindIII和EcoRI將OsSKIP1啟動子序列酶切后連接到國際上常用的植物啟動子活性檢測載體pCAMBIA1391Z(由澳大利亞CAMBIA[Center for the Application of Molecular Biology toInternational Agriculture]實驗室提供)的GUS報告基因前面并通過農(nóng)桿菌介導的水稻遺傳轉化體系將其導入到水稻品種中花11中。對轉基因植株不同組織和器官進行GUS染色。染色液配方；pH＝7.0的0.1M磷酸鈉緩沖液20mL，0.5M EDTA溶液1mL，Trion X-100 0.5mL，亞鐵氰化鉀(Pataxium ferrocyamide)42.5mg，鐵氰化鉀(Pataxium ferricyamide)33mg，氯霉素(Chloramphenicol)5mg，X-Gluc 50mg，甲醇溶液10mL，加水至50mL)。取新鮮的轉化植株的不同組織器官浸泡于GUS染液中置于37℃恒溫箱中過夜。脫色后(脫色液使用70％的乙醇)過夜后觀察并拍照記錄。GUS染色情況(圖3)表明OsSKIP1基因啟動子具有組成型表達活性，這與RT-PCR的結果是一致的。
實施例4OsSKIP1抑制表達轉基因T1家系的生長速度本發(fā)明選取了10個OsSKIP1表達受明顯抑制的T1家系進行生長速度的測定。具體步驟如下每個T1代家系選取30-40粒種子在含有G418抗生素的水溶液(50mg/ml)中浸種，去除不發(fā)芽種子(不含轉基因的種子)。將轉基因和野生型對照(水稻品種中花11)發(fā)芽后5天的幼苗水培種植在90×60×20cm3的培養(yǎng)盒中，培養(yǎng)盒上蓋有92×62cm2大小的木蓋，木蓋上鉆有均勻分布的96個孔，每孔種一棵苗，用海綿固定植株。水培的營養(yǎng)液成份如下N40ppm；P10ppm；K40ppm；Ca40ppm；Mg40ppm；Mn0.5ppm；Mo0.05ppm；B0.2ppm；Zn0.01ppm；Cu0.01ppm；Fe2ppm。母液配方如下1、NH4NO3914g/10L2、NaH2PO4-2H2O403g/10L3、K2SO4714g/10L4、CaCl2886g/10L5、MgSO4-7H2O3240g/10L6、MnCl2-4H2O15g，(NH4)6Mo7O24-4H2O0.74g，H3BO39.34g，ZnSO4-7H2O0.35g，CuSO4-5H2O0.31g，F(xiàn)eCl3-6H2O77g，(CH2O)n119g。分別溶解后與500ml濃硫酸混合，定容至10L。
水培時，每3970mL水中加上述母液各5mL.
每家系種植8單株，隨即區(qū)組設計，三次重復(每個盒中設置對照)。在發(fā)芽后的第8，14，20，26，45天時小心45取出秧苗測量植株高度和鮮重。隨后將45天的秧苗移栽到大田，按水稻生產(chǎn)上的正常的栽培管理，考查抽穗期和單株產(chǎn)量。圖4是一個代表性轉基因家系和對照的苗期生長曲線；圖5是10個轉基因家系和對照在水培45天后的株高和鮮重比較。結果表明OsSKIP1抑制表達的轉基因植株的生長顯著地受到抑制。
實施例5OsSKIP1超量表達轉基因T1家系在不同環(huán)境條件下的生長速度本發(fā)明選取了5個OsSKIP1超量表達T1家系進行了不同條件下生長速度的測定。具體步驟如下每個T1代家系選取100-150粒種子在含有潮霉素抗生素的水溶液(50mg/ml)中浸種，去除不發(fā)芽種子(不含轉基因的種子)。將轉基因和野生型對照(水稻品種中花11)發(fā)芽后5天的幼苗水培種植。水培種植方法同實施例4。與實施例4不同的是，除了正常生長實驗外還設置了三個逆境處理實驗缺水脅迫(發(fā)芽后第10天加入PEG6000，終濃度10％)，鹽脅迫(發(fā)芽后第10天加入NaCl，終濃度100mM)和低溫處理(發(fā)芽后第10天移入低溫生長箱，晝溫10℃保持16小時并且光照充足，夜溫6℃保持8小時無光照)。四個生長條件下的生長實驗均按隨即區(qū)組設計，三次重復(每個盒中設置對照)，每個重復中每家系種植8單株。在發(fā)芽后的第8，14，20，26，45天時小心取出秧苗測量植株高度和鮮重。隨后將45天的秧苗移栽到大田，按水稻生產(chǎn)上的正常的栽培管理，考查抽穗期和單株產(chǎn)量。圖6是5個代表性轉基因家系和對照的苗期生長曲線；圖7是5個轉基因家系和對照在不同逆境條件下生長45天后的植株鮮重比較。結果表明OsSKIP1超量表達的轉基因植株的生長不論在正常條件還是在逆境脅迫處理下都要顯著地優(yōu)于對照，說明OsSKIP1基因的表達不僅對水稻生長具有促進作用，而且還可以緩解逆境條件造成的植株生長受阻。
序列表SEQUENCE LISTING<110>華中農(nóng)業(yè)大學<120>利用水稻核蛋白基因OsSKIP1促進植物在逆境條件下的生長<130>
<141>2005-10-13<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2351<212>DNA<213>水稻(Oryza sativa)<220>
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cct ctt gag cca ccg aaa ttc aag cat aag cga gtg ccc cgc gct tct842Pro Leu Glu Pro Pro Lys Phe Lys His Lys Arg Val Pro Arg Ala Ser225 230 235gga tca ccg cct gtc cca gtg atg cac tcg cca cca cgg cca gtg aca890Gly Ser Pro Pro Val Pro Val Met His Ser Pro Pro Arg Pro Val Thr240 245 250gtg aag gac cag caa gat tgg aag att cca cca tgc att tca aat tgg938Val Lys Asp Gln Gln Asp Trp Lys Ile Pro Pro Cys Ile Ser Asn Trp255 260 265aaa aat cca aag ggt tac acc ata cca ctc gac aag agg ttg gca gct986Lys Asn Pro Lys Gly Tyr Thr Ile Pro Leu Asp Lys Arg Leu Ala Ala270 275 280 285gat gga agg ggg ctg cag gag gtt caa att aat gat aac ttt gca aag1034Asp Gly Arg Gly Leu Gln Glu Val Gln Ile Asn Asp Asn Phe Ala Lys290 295 300ctc tct gaa gca ctg tat gtg gcg gag cag aag gcc agg gag gca gta1082Leu Ser Glu Ala Leu Tyr Val Ala Glu Gln Lys Ala Arg Glu Ala Val305 310 315cag atg cga tcc aag gtg cag agg gag ctg cag ctg aag gag aag gag1130Gln Met Arg Ser Lys Val Gln Arg Glu Leu Gln Leu Lys Glu Lys Glu320 325 330agg aag gag caa gag cta agg gca ctt gca cag aag gcg cgc atg gag1178Arg Lys Glu Gln Glu Leu Arg Ala Leu Ala Gln Lys Ala Arg Met Glu335 340 345agg act ggt gcc cca cct gca cct aca ggg gtt cct gct ggt ggt ggt1226Arg Thr Gly Ala Pro Pro Ala Pro Thr Gly Val Pro Ala Gly Gly Gly350 355 360 365aga ggt gct gtt ggt gac agg gag gaa gat atg gat ttg gag cag cct1274Arg Gly Ala Val Gly Asp Arg Glu Glu Asp Met Asp Leu Glu Gln Pro370 375 380cgt gag caa cga agg ggg agt aga gaa gaa agg gaa gca agg att gag1322Arg Glu Gln Arg Arg Gly Ser Arg Glu Glu Arg Glu Ala Arg Ile Glu385 390 395cgt gac agg att cgt gag gag agg aga cgt gag agg gag aga gag agg1370Arg Asp Arg Ile Arg Glu Glu Arg Arg Arg Glu Arg Glu Arg Glu Arg400 405 4l0agg ctg gag gcc agg gat gct gca atg ggc aag aag agt aag ctc act1418
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權利要求
1.OsSKIP1基因介導的賦予植物在逆境和/或正常條件下生長速度加快的DNA序列，它是(a)SEQ ID NO1中第1-2351位所示的DNA序列；或(b)編碼與(a)編碼的蛋白質相同的蛋白質的DNA序列。
2.合適啟動子連接的權利要求1所述的DNA序列。
3.權利要求2所述的DNA序列，它是SEQ ID NO1所示的DNA序列。
4.賦予植物在逆境和/或正常條件下生長速度加快的DNA序列，它是與SEQ ID NO1中第1-2351位所示DNA序列相似性達90％以上的DNA序列。
5.權利要求1-4任一項所述的DNA序列在促進水稻在逆境和/或正常條件下生長中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程技術領域。具體涉及一種水稻DNA片斷的分離克隆、功能驗證及其在轉基因水稻中的應用。所述的DNA片斷包含水稻逆境誘導的核蛋白基因OsSKIP1，它賦予植物在逆境和/或正常條件下的生長速度顯著提高的能力。將代表該基因的DNA片段與外源啟動子結合后直接轉入植物體，轉基因植物在正常和逆境條件下的生長速度比對照顯著提高。
文檔編號C12N15/82GK1952141SQ20051001959
公開日2007年4月25日 申請日期2005年10月17日 優(yōu)先權日2005年10月17日
發(fā)明者熊立仲, 侯昕 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學