專利名稱：耐氯菌株1號及其篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種耐氯微生物及其篩選方法。
背景技術(shù)：
普通微生物對氯離子的耐受能力有限，一般情況下氯離子濃度小于4000mg/L時(shí)，微生物可以生長，不會受到明顯的抑制作用。但是，如果氯離子濃度大于4000mg/L，則氯離子對微生物的抑制甚至毒害作用隨氯離子濃度的提高而急劇顯現(xiàn)，導(dǎo)致普通微生物不能生存。然而在自然界中，也存在著一些特種微生物，它們在含有高濃度氯離子，甚至是極端高濃度氯離子(5000-80000mg/L)的環(huán)境中可以正常生長，這類微生物可以稱其為耐氯微生物。
但是，并非所有的耐氯微生物都可以應(yīng)用于含高濃度氯離子廢水的處理，必須經(jīng)過嚴(yán)格的篩選和馴化才能得到既可耐受高濃度氯離子環(huán)境、又可降解廢水中高濃度有機(jī)物的特種耐氯微生物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一株可處理含高濃度氯離子廢水的耐氯菌株1號及其篩選方法。
本發(fā)明所提供的耐氯菌株1號，為擴(kuò)展短桿菌(Brevibacterium linens)B723-1 CCTCCNO.M205122，已于2005年10月24日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏號CCTCC NO.M205122。
所述的一株耐氯菌株1號的菌落形態(tài)菌落呈乳白色(老齡菌呈橙色)、規(guī)則圓形、緣齊、不透明、表面光滑、球狀凸起、粘稠狀，經(jīng)5M KOH處理后菌呈粉紅色；生理特征幼齡菌呈不規(guī)則的桿狀，0.6～1.2μm×1.5～6.0μm，單個(gè)或成對排列，常呈V形排列，老齡菌呈球狀，存在典型的球桿周期，革蘭氏陽性；主要生化特征嚴(yán)格好氧，化能異養(yǎng)菌，接觸酶陽性，氧化酶陰性，產(chǎn)生精氨酸雙水解酶、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶以及脲酶，從葡萄糖產(chǎn)少量酸，不運(yùn)動，不生孢子，最適生長溫度25～37℃。
一株耐氯菌株1號的篩選方法1)、初篩制備初篩菌懸液稱取皂素廢水調(diào)節(jié)池池底底泥樣1g或皂素廢水調(diào)節(jié)池內(nèi)污水1mL接種于高壓滅菌的SM培養(yǎng)基中，30℃-37連續(xù)培養(yǎng)30天進(jìn)行富集，得初篩菌懸液；取初篩菌懸液20μl涂布于固體SM培養(yǎng)基；在初篩平板上挑取不同形態(tài)的單菌落在液體SM培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，并進(jìn)一步進(jìn)行涂布分離，經(jīng)多次純化、分離，最后得到不同菌落形態(tài)的純平板；挑取純平板的單菌落于SM培養(yǎng)基中，30℃恒溫培養(yǎng)過夜，得分離菌懸液；2)、二次篩選制備復(fù)篩菌懸液在100ml濃度為9萬、8萬、7萬、6萬、5萬、4萬、3萬、2萬、1萬或0.5萬mg/L的氯離子的液體SM培養(yǎng)基內(nèi)，加入初篩分離菌的分離菌懸液50μl，30℃恒溫振搖5-7天，得復(fù)篩菌懸液；取復(fù)篩菌懸液20μl涂于固體SM培養(yǎng)基，30℃恒溫培養(yǎng)1-2天，觀察并記錄細(xì)菌生長情況以及菌落形態(tài)；獲得一株編號為菌株B723-1的菌株，即耐氯菌株1號。
所述的SM培養(yǎng)基為蛋白胨10g；牛肉膏5g；蒸餾水1000ml；固狀瓊脂20g；CaCl215.6g/L，pH＝7.5。
本發(fā)明從皂素廢水池底污泥中篩選到一株在高濃度氯離子條件下具有一定生長能力的新菌株。并對其耐氯能力進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，在高濃度氯離子條件下，耐氯菌株1號的耐氯能力好，范圍最廣，能在[Cl-]為5000-80000mg/L時(shí)具有較好的生長能力。一株耐氯菌株1號有良好的去除皂素廢水中COD的能力，能在72小時(shí)之內(nèi)去除廢水中的COD 51.85％。本發(fā)明獲得的新菌株既可在含高濃度氯離子環(huán)境下生存、又可高效降解高濃度有機(jī)污染物，有效處理諸如黃姜皂素廢水等極難處理的特殊廢水。


圖1-1是菌株B723-1在液體SC培養(yǎng)基上生長情況2-1是菌株B723-1的PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖(1核DNA，2擴(kuò)增產(chǎn)物，MMarker)圖3-1是菌株B723-1菌落形態(tài)3-2是菌株B723-1菌株電鏡圖片圖4-1是菌株B723-1在高COD不同[Cl-]條件下降解效率圖具體實(shí)施方式
一、一株耐氯菌株1號的篩選方法(一)、材料準(zhǔn)備1、實(shí)驗(yàn)廢水和池底污泥取自湖北省十堰方坤置業(yè)有限公司皂素廢水調(diào)節(jié)池。
2、培養(yǎng)基SM培養(yǎng)基蛋白胨10g；牛肉膏5g；蒸餾水1000ml；瓊脂20g(固)；CaCl215.6g/L，pH＝7.5。
SC培養(yǎng)基在SM培養(yǎng)基中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要加入不同濃度(9萬、8萬、7萬、6萬、5萬、4萬、3萬、2萬、1萬、0.5萬mg/L)的氯離子。
3、實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備國華SHA-B恒溫振蕩器，SHH150G光照生物培養(yǎng)箱，臥式壓力蒸汽滅菌器-----上海醫(yī)用核子儀器廠，WMX-1型微波密封消解COD速測儀/-----汕頭市環(huán)海工程總公司，722S分光光度計(jì)-----上海棱光技術(shù)有限公司，光學(xué)顯微鏡-----Olympus有限公司，pH計(jì)等-----Hana有限公司，超凈工作臺，鼓風(fēng)干燥箱，KYKY-1000B掃描電子顯微鏡，PTC200型PCR儀，電泳儀及電泳槽，凝膠紫外觀測儀，DDS-11型電導(dǎo)儀，(二)、菌株的篩選分離與純化1)、初篩制備初篩菌懸液稱取皂素廢水調(diào)節(jié)池池底底泥樣1g或皂素廢水調(diào)節(jié)池內(nèi)污水1mL接種于高壓滅菌的SM培養(yǎng)基中，30℃-37連續(xù)培養(yǎng)30天進(jìn)行富集，得初篩菌懸液；取初篩菌懸液20μl涂布于固體SM培養(yǎng)基；在初篩平板上挑取不同形態(tài)的單菌落在液體SM培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，并進(jìn)一步進(jìn)行涂布分離，經(jīng)多次(如10次)純化、分離，最后得到不同菌落形態(tài)的純平板；挑取純平板的單菌落于SM培養(yǎng)基中，30℃恒溫培養(yǎng)過夜，得分離菌懸液；2)、二次篩選制備復(fù)篩菌懸液在100ml濃度為9萬、8萬、7萬、6萬、5萬、4萬、3萬、2萬、1萬或0.5萬mg/L的氯離子的液體SM培養(yǎng)基內(nèi)，加入初篩分離菌的分離菌懸液50μl，30℃恒溫振搖5-7天，得復(fù)篩菌懸液；取復(fù)篩菌懸液20μl涂于固體SM培養(yǎng)基，30℃恒溫培養(yǎng)1-2天，觀察并記錄細(xì)菌生長情況以及菌落形態(tài)；獲得一株編號為菌株B723-1的菌株，即耐氯菌株1號。
所述的SM培養(yǎng)基為蛋白胨10g；牛肉膏5g；蒸餾水1000ml；固狀瓊脂20g；CaCl215.6g/L，pH＝7.5。
經(jīng)過初步篩選和多次分離純化，最后得到一株菌株B723-1，即耐氯菌株1號。耐氯菌株1號在加入不同濃度氯離子的液體SM培養(yǎng)基上生長情況如圖1-1所示。
二、耐氯微生物菌株鑒定1、對耐氯性能較強(qiáng)的菌株B723-1的鑒定對耐氯性能較強(qiáng)的菌株B723-1進(jìn)行了生理生化的鑒定以及16S rRNA分子的鑒定，從分子水平確定耐氯菌株的種屬。
16S rDNA序列分析主要按照以下步驟1)提取細(xì)菌核DNA，a)集菌用高壓滅菌的牙簽挑單菌落接種于LB液管內(nèi)培養(yǎng)18小時(shí)，取其菌懸液1ml于1.5ml的離心管中8000rpm離心5min，棄上清液。
b)加STE 1ml洗一次，振蕩重懸細(xì)菌，8000rpm離心5min，棄上清液。
c)加600μlTE，劇烈振蕩重懸細(xì)菌，加入10％的SDS 65μl，65℃水浴5-10min。
d)加等體積酚氯仿抽提三次。
e)小心吸取上清液，加入等體積的異丙醇和1/10體積的3MNaAc，12000rpm離心10min。徹底棄上清。
f)DNA沉淀用70％乙醇洗一次，風(fēng)干后溶于20μlTE備用。
TE緩沖液10mmol/L Tris-Cl(pH8.0)；1mmol/L EDTA-Na2(pH8.0)，STE緩沖液0.1mol/L NaCl 10mmol/L Tris-Cl(pH8.0)1mmol/L EDTA(pH8.0)，2)16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增引物參照Weisburg等人的方法合成。
P1正向引物5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’P2反向引物5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’在50μL反應(yīng)體積中，加入1μL模板DNA(0.1μg)，0.5μL P1和P2(終濃度為0.5μM)，1μLdNTP(每種NTP0.2mM)，0.5μLTaq聚合酶(2U)和5μL 10×PCR緩沖液。PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5min；在94℃變性30s，61-65℃退火30s，72℃延伸1min，循環(huán)30次；最后72℃終延伸10min。
3)PCR產(chǎn)物的回收將PCR產(chǎn)物以1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后，在紫外燈下切取含欲回收片段的凝膠，放入1.5ml離心管中加2倍體積TE，65℃水浴10分鐘后加等體積水飽和酚抽提一次離心后取上層水相再用酚-氯仿-異戊醇抽提一次，收集上清加0.1倍體積的10mol/L乙酸銨和2倍體積無水乙醇沉淀，離心，用70％乙醇洗沉淀一次，風(fēng)干后溶于適量滅菌雙蒸水。
4)16S rDNA的全序列測定和分析PCR測序用正反向引物參照Hiraishi等人方法合成。
P-fCACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC；P-rGGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC。
加入1μL模板DNA(＜0.1μg)，PCR擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)(94℃1min，55℃30s，72℃2min)。采用ABI PRISM測序試劑盒中染料終止劑終止反應(yīng)。然后，在Applied Biosystem 373A DNA測序儀上測序。測得的16S rDNA序列采用BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫比較分析，最終從分子水平上確定該菌的種屬。
2、16S rDNA序列測定本發(fā)明采用對16S rRNA序列測定和分析的方法對細(xì)菌進(jìn)行分子水平的鑒定。以細(xì)菌的核DNA為模板，以16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增的通用引物為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長度為1484bp的擴(kuò)增帶(用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測)，如圖2-1所示。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，測定其全序列。
<110>中國地質(zhì)大學(xué)(武漢)<120>耐氯菌株1號及其篩選方法<160>1484<210>1<211>1484bp<212>DNA<213>擴(kuò)展短桿菌(Brevibacterium linens)<220>
<221>misc_feature<222>
<400>1Taccttgtta cgacttagtc ccaatcacca gtcccaccct agacggcccc ctccacaagg60gttgggacac cggcttcggg tgttaccgac tttcgtgact tgacgggcgg tgtgtacaag120gcccgggaac gtattcaccg cagcgttgct gatctgcgat tactagcgac tccgacttca180cgtagtcgaa ttgcagacta cgatccgaac tgagactggc tttaagggat tcgcttaccc240tcacgggttc gcctctctct gtaccagcca ttgtagcatg cgtgaagccc aagacataaa300gggcatgatg atttgacgtc atccccacct tcctccgagt tgaccccggc agtctcctat360gagttcccac catcacgtgc tggcaacata gaacgagggt tgcgctcgtt gcgggactta420acccaacatc tcacgacacg agctgacgac aaccatgcac cacctgtaca ccagctccaa480agagaagaac tgtttccaga acggtccagt gtatgtcaag ccttggtaag gttcttcgcg540ttgcatcgaa ttaatccgca tgctccgccg cttgtgcggg cccccgtcaa ttcctttgag600ttttagcctt gcgaccgtac ttccccaggc ggggcactta atgcgttagc tacggcgcgg660aagaacgtgg aatgtccccc acacctagtg cccaacgttt acggcatgga ctaccagggt720atctaatcct gktcgctccc catgctttcg ctcctcagtg tcagttacag cccagagtcc780gcttcgccac cgggtgttct cctgatatct gcgcatttca ccgctacacc aggaattcca840gacttcccta ctgcactcta gtcagccgta cccactgcac gcgcaacgtt aagcgttgcg900tttccacagc agacgtgacc aaccactacg agctctttac gcccaataat tccggacaac960gctcgtaccc tacgtattac cgcggctgct ggcacgtagt tagccggtac ttcttctgca1020ggtaccgtca ctttcgcttc ttccctgctg aaagcggttt acaacccgaa ggccgtcatc1080ccgcacgctg cgtcgctgca tcagggtttc ccccattgtg caatattccc cactgctgcc1140tcccgtagga gtctgggccg tgtctcagtc ccagtgtggc cggtcgccct ctcaggccgg1200ctacccgtcg tcgccttggt aggccattac cccaccaaca agctgatagg ccgcgagccc1260atccccgatc gaaaaacttt ccaccaccca acatgcgtca ggaggtcata tccggtatta1320gacccagttt cccaggctta tcccgaaatc aggggcaggt tactcacgtg ttactcaccc1380gttcgccact catccaccaa cagcaagctg tcggcttcag cgttcgactt gcatgtgtta1440agcacgcagc cagcgttcgt cctgagccag gatcaaactc taat 1484三、菌落形態(tài)特征以及生理生化特性對菌株B723-1的菌落形態(tài)進(jìn)行了仔細(xì)的觀察，結(jié)果見圖3-1。同時(shí)對菌表觀也做了掃描電鏡觀察，結(jié)果見圖3-2。菌株B723-1的菌落形態(tài)菌落呈乳白色(老齡菌呈橙色)、規(guī)則圓形、緣齊、不透明、表面光滑、球狀凸起、粘稠狀，經(jīng)5M KOH處理后菌呈粉紅色；生理特征幼齡菌呈不規(guī)則的桿狀，0.6～1.2μm×1.5～6.0μm，單個(gè)或成對排列，常呈V形排列，老齡菌呈球狀，存在典型的球桿周期，革蘭氏陽性；主要生化特征嚴(yán)格好氧，化能異養(yǎng)菌，接觸酶陽性，氧化酶陰性，產(chǎn)生精氨酸雙水解酶、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶以及脲酶，從葡萄糖產(chǎn)少量酸，不運(yùn)動，不生孢，最適生長溫度25～37℃。
四、菌株B723-1為新的菌株采用BLAST分析法對菌株B723-1的16S rRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫比較分析發(fā)現(xiàn)，菌株B723-1與擴(kuò)展短桿菌(Brevibacterium linens)的同源性高達(dá)99.0％。
綜合菌株的生理生化以及分子鑒定結(jié)果，菌株B723-1命名為擴(kuò)展短桿菌(Brevibacterium linens)B723-1。查閱有關(guān)資料，尚無短桿菌屬有關(guān)高濃度氯離子條件下難降解有機(jī)廢水以及對其耐氯能力研究的報(bào)道。擴(kuò)展短桿菌(Brevibacterium linens)B723-1為新的菌株，已于2005年10月24日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏號CCTCC NO.M205122。
本發(fā)明從湖北省十堰皂素廢水池底污泥中篩選分離出這一株細(xì)菌，并發(fā)現(xiàn)其有較好降解高濃度氯離子難降解皂素廢水的功能。這拓寬了人們對擴(kuò)展短桿菌(Brevibacteriumlinens)在其功能方面的應(yīng)用研究思路，并為降解含高濃度氯離子皂素廢水提供了有用的菌源和技術(shù)，具有較強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
五、耐氯菌株1號的應(yīng)用(一)、挑取擴(kuò)展短桿菌(Brevibacterium linens)B723-1單菌落，于SM培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，按培養(yǎng)后的擴(kuò)展短桿菌(Brevibacterium linens)B723-1含高濃度氯離子廢水(如混合皂素廢水)的體積比為0.5-2∶100取擴(kuò)展短桿菌(Brevibacterium linens)B723-1接種于含高濃度氯離子(5000-80000mg/L)廢水(如混合皂素廢水)中，20-40℃恒溫培養(yǎng)，振搖速度為100-180rpm，pH值為7-8，反應(yīng)24-72小時(shí)；所述的SM培養(yǎng)基為蛋白胨10g；牛肉膏5g；蒸餾水1000ml；瓊脂20g(固)；CaCl215.6g/L，pH＝7.5。
(二)、菌株B723-1對皂素廢水降解能力取皂素生產(chǎn)混合廢水，稀釋一定倍數(shù)，使其COD為5400mg/L，[Cl-]為2萬mg/L。取皂素混合廢水50ml分別加入250ml的錐形瓶中，分別加入菌株B723-1的菌懸液1ml，30℃、150rpm、pH值＝7.1-7.5，搖床振蕩3d，計(jì)算菌株對廢水的COD和Cl-的去除情況，菌株B723-1去除COD的效率好，為51.8％。
(三)、氯離子濃度對B723-1降解皂素廢水能力的影響為了考察菌株在高濃度COD(17136mg/L)時(shí)，在不同氯離子濃度下，對COD的去除效果，在廢水中加CaCl2調(diào)節(jié)氯離子濃度分別為9240.2、17988.6、25734.2、35860.4、44803.1mg/L。耐氯菌株B723-1去除效果結(jié)果如圖4-1。
從圖4-1可以看出，當(dāng)[Cl-]＝9420mg/L時(shí)，反應(yīng)時(shí)間為24h，菌株B723-1對COD的去除率可達(dá)42.16％，但是隨著反應(yīng)時(shí)間延長，菌株B723-1對COD的去除率不會增加，這說明廢水中被生物利用的可降解物質(zhì)能在很短的時(shí)間內(nèi)被微生物利用，皂素廢水中存在不可生物降解的物質(zhì)；當(dāng)9240.2mg/L＜[Cl-]＜25734.2mg/L，反應(yīng)時(shí)間為24h時(shí)，菌株B723-1對COD的去除率較[Cl-]＝9420mg/L時(shí)略有下降，但隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，其最終的降解效率仍然較好。這說明氯離子濃度對耐氯菌株在皂素廢水中去除COD的能力在時(shí)間上存在一個(gè)延滯期。
權(quán)利要求
1.一株耐氯菌株1號，其特征在于所述的菌株為擴(kuò)展短桿菌(Brevibacterium linens)B723-1 CCTCC NO.M205122。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株耐氯菌株1號，其特征在于耐氯菌株1號的菌落形態(tài)菌落呈乳白色、規(guī)則圓形、緣齊、不透明、表面光滑、球狀凸起、粘稠狀，經(jīng)5M KOH處理后菌呈粉紅色；生理特征幼齡菌呈不規(guī)則的桿狀，0.6～1.2μm×1.5～6.0μm，單個(gè)或成對排列，常呈V形排列，老齡菌呈球狀，存在典型的球桿周期，革蘭氏陽性；主要生化特征嚴(yán)格好氧，化能異養(yǎng)菌，接觸酶陽性，氧化酶陰性，產(chǎn)生精氨酸雙水解酶、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶以及脲酶，從葡萄糖產(chǎn)少量酸，不運(yùn)動，不生孢，最適生長溫度25～37℃。
3.如權(quán)利要求1所述的一株耐氯菌株1號的篩選方法，其特征在于1)、初篩制備初篩菌懸液稱取皂素廢水調(diào)節(jié)池池底底泥樣1g或皂素廢水調(diào)節(jié)池內(nèi)污水1mL接種于高壓滅菌的SM培養(yǎng)基中，30℃-37連續(xù)培養(yǎng)30天進(jìn)行富集，得初篩菌懸液；取初篩菌懸液20μl涂布于固體SM培養(yǎng)基；在初篩平板上挑取不同形態(tài)的單菌落在液體SM培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，并進(jìn)一步進(jìn)行涂布分離，經(jīng)多次純化、分離，最后得到不同菌落形態(tài)的純平板；挑取純平板的單菌落于SM培養(yǎng)基中，30℃恒溫培養(yǎng)過夜，得分離菌懸液；2)、二次篩選制備復(fù)篩菌懸液在100ml濃度為9萬、8萬、7萬、6萬、5萬、4萬、3萬、2萬、1萬或0.5萬mg/L的氯離子的液體SM培養(yǎng)基內(nèi)，加入初篩分離菌的分離菌懸液50μl，30℃恒溫振搖5-7天，得復(fù)篩菌懸液；取復(fù)篩菌懸液20μl涂于固體SM培養(yǎng)基，30℃恒溫培養(yǎng)1-2天，觀察并記錄細(xì)菌生長情況以及菌落形態(tài)；獲得一株編號為菌株B723-1的菌株，即耐氯菌株1號。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一株耐氯菌株1號的篩選方法，其特征在于所述的SM培養(yǎng)基為蛋白胨10g；牛肉膏5g；蒸餾水1000ml；固狀瓊脂20g；CaCl215.6g/L，pH＝7.5。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種耐氯微生物。一株耐氯菌株1號，其特征在于所述的菌株為擴(kuò)展短桿菌(Brevibacterium linens)B723－1 CCTCC NO.M205122。菌落形態(tài)菌落呈乳白色、規(guī)則圓形、緣齊、不透明、表面光滑、球狀凸起、粘稠狀，經(jīng)5M KOH處理后菌呈粉紅色；生理特征幼齡菌呈不規(guī)則的桿狀，0.6～1.2μm×1.5～6.0μm，單個(gè)或成對排列，常呈V形排列，老齡菌呈球狀，存在典型的球桿周期，革蘭氏陽性；主要生化特征嚴(yán)格好氧，化能異養(yǎng)菌，接觸酶陽性，氧化酶陰性，產(chǎn)生精氨酸雙水解酶、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶以及脲酶，從葡萄糖產(chǎn)少量酸，不運(yùn)動，不生孢，最適生長溫度25～37℃。它既可在含高濃度氯離子環(huán)境下生存、又可高效降解高濃度有機(jī)污染物。
文檔編號C12R1/13GK1793326SQ20051001975
公開日2006年6月28日 申請日期2005年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月4日
發(fā)明者鮑建國, 王焰新, 劉慧 , 張彩香, 信欣, 李耀辰, 劉雙, 李平, 張莉君 申請人:中國地質(zhì)大學(xué)(武漢)