專利名稱：耐氯菌株3號及其篩選方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種耐氯微生物及其篩選方法。
背景技術：
普通微生物對氯離子的耐受能力有限，一般情況下氯離子濃度小于4000mg/L時，微生物可以生長，不會受到明顯的抑制作用。但是，如果氯離子濃度大于4000mg/L，則氯離子對微生物的抑制甚至毒害作用隨氯離子濃度的提高而急劇顯現(xiàn)，導致普通微生物不能生存。然而在自然界中，也存在著一些特種微生物，它們在含有高濃度氯離子，甚至是極端高濃度氯離子(5000-80000mg/L)的環(huán)境中可以正常生長，這類微生物可以稱其為耐氯微生物。
但是，并非所有的耐氯微生物都可以應用于含高濃度氯離子廢水的處理，必須經(jīng)過嚴格的篩選和馴化才能得到既可耐受高濃度氯離子環(huán)境、又可降解廢水中高濃度有機物的特種耐氯微生物。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一株可處理含高濃度氯離子廢水的耐氯菌株3號及其篩選方法。
本發(fā)明所提供的耐氯菌株3號，為松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)B723-3，已于2005年10月24日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏號CCTCCNO.M205121。
耐氯菌株3號的菌落形態(tài)菌落菌斑較大(5mm)、呈米黃色、規(guī)則圓形、緣齊、不透明、表面光滑、微凸，粘稠；生理特征球形，直徑0.5～1.5μm，單個、成對或不規(guī)則堆狀，革蘭氏陽性；主要生化特征兼性厭氧，化能異養(yǎng)菌，接觸酶陽性，氧化酶陰性，產(chǎn)生精氨酸雙水解酶和脲酶等，從D-纖維二糖、D-巖糖、D-甘露醇、D-核糖、果糖、蔗糖產(chǎn)酸，不運動，不生孢，最適生長溫度30～37℃。
一株耐氯菌株3號的篩選方法1)、初篩制備初篩菌懸液稱取皂素廢水調節(jié)池池底底泥樣1g或皂素廢水調節(jié)池內污水1mL接種于高壓滅菌的SM培養(yǎng)基中，30℃-37連續(xù)培養(yǎng)30天進行富集，得初篩菌懸液；取初篩菌懸液20μl涂布于固體SM培養(yǎng)基；在初篩平板上挑取不同形態(tài)的單菌落在液體SM培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，并進一步進行涂布分離，經(jīng)多次純化、分離，最后得到不同菌落形態(tài)的純平板；挑取純平板的單菌落于SM培養(yǎng)基中，30℃恒溫培養(yǎng)過夜，得分離菌懸液；2)、二次篩選制備復篩菌懸液在100ml濃度為9萬、8萬、7萬、6萬、5萬、4萬、3萬、2萬、1萬或0.5萬mg/L的氯離子的液體SM培養(yǎng)基內，加入初篩分離菌的分離菌懸液50μl，30℃恒溫振搖5-7天，得復篩菌懸液；取復篩菌懸液20μl涂于固體SM培養(yǎng)基，30℃恒溫培養(yǎng)1-2天，觀察并記錄細菌生長情況以及菌落形態(tài)；獲得一株編號為菌株B723-3的菌株，即耐氯菌株3號。
所述的SM培養(yǎng)基為蛋白胨10g；牛肉膏5g；蒸餾水1000ml；固狀瓊脂20g；CaCl215.6g/L，pH＝7.5。
本發(fā)明從皂素廢水池底污泥中篩選到一株在高濃度氯離子條件下具有一定生長能力的新菌株。并對其耐氯能力進行了研究，結果表明，在高濃度氯離子條件下，耐氯菌株3號的耐氯能力好，范圍廣，能在[Cl-]為5000-80000mg/L時具有較好的生長能力。一株耐氯菌株3號有良好的去除皂素廢水中COD的能力，能在72小時之內去除廢水中的COD 56.3％。本發(fā)明獲得的新菌株既可在含高濃度氯離子環(huán)境下生存、又可高效降解高濃度有機污染物，有效處理諸如黃姜皂素廢水等極難處理的特殊廢水。


圖1-1是菌株B723-3在液體SC培養(yǎng)基上生長情況2-1是菌株B723-3的PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖(1擴增產(chǎn)物，2核DNA，MMarker)圖3-1是菌株B723-3菌落形態(tài)3-2是菌株B723-3菌株電鏡圖片圖4-1是反應時間對COD去除率的影響4-2是接種量對COD去除率的影響4-3是反應pH值對COD去除率的影響4-4是搖床轉速對COD去除率的影響圖具體實施方式
一、一株耐氯菌株3號的篩選方法(一)、材料準備1、廢水和池底污泥取自湖北省十堰方坤置業(yè)有限公司皂素廢水調節(jié)池。
2、培養(yǎng)基SM培養(yǎng)基蛋白胨10g；牛肉膏5g；蒸餾水1000ml；瓊脂20g(固)；CaCl215.6g/L，pH＝7.5。
SC培養(yǎng)基在SM培養(yǎng)基中，根據(jù)實驗需要加入不同濃度(9萬、8萬、7萬、6萬、5萬、4萬、3萬、2萬、1萬、0.5萬mg/L)的氯離子。
3、實驗儀器和設備國華SHA-B恒溫振蕩器，SHH150G光照生物培養(yǎng)箱，臥式壓力蒸汽滅菌器-----上海醫(yī)用核子儀器廠，WMX-1型微波密封消解COD速測儀/-----汕頭市環(huán)海工程總公司，722S分光光度計-----上海棱光技術有限公司，光學顯微鏡-----Olympus有限公司，pH計等-----Hana有限公司，超凈工作臺，鼓風干燥箱，KYKY-1000B掃描電子顯微鏡，PTC200型PCR儀，電泳儀及電泳槽，凝膠紫外觀測儀，DDS-11型電導儀，(二)、菌株的篩選分離與純化1)、初篩制備初篩菌懸液稱取皂素廢水調節(jié)池池底底泥樣1g或皂素廢水調節(jié)池內污水1mL接種于高壓滅菌的SM培養(yǎng)基中，30℃-37連續(xù)培養(yǎng)30天進行富集，得初篩菌懸液；取初篩菌懸液20μl涂布于固體SM培養(yǎng)基；在初篩平板上挑取不同形態(tài)的單菌落在液體SM培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，并進一步進行涂布分離，經(jīng)多次(如10次)純化、分離，最后得到不同菌落形態(tài)的純平板；挑取純平板的單菌落于SM培養(yǎng)基中，30℃恒溫培養(yǎng)過夜，得分離菌懸液；2)、二次篩選制備復篩菌懸液在100ml濃度為9萬、8萬、7萬、6萬、5萬、4萬、3萬、2萬、1萬或0.5萬mg/L的氯離子的液體SM培養(yǎng)基內，加入初篩分離菌的分離菌懸液50μl，30℃恒溫振搖5-7天，得復篩菌懸液；取復篩菌懸液20μl涂于固體SM培養(yǎng)基，30℃恒溫培養(yǎng)1-2天，觀察并記錄細菌生長情況以及菌落形態(tài)；獲得一株編號為菌株B723-3的菌株，即耐氯菌株3號。
所述的SM培養(yǎng)基為蛋白胨10g；牛肉膏5g；蒸餾水1000ml；固狀瓊脂20g；CaCl215.6g/L，pH＝7.5。
經(jīng)過初步篩選和多次分離純化，最后得到一株菌株B723-3，即耐氯菌株3號。菌株B723-3在液體SC培養(yǎng)基上生長情況如圖1-1所示。
二、耐氯微生物菌株鑒定1、對耐氯性能較強的菌株B723-3的鑒定對耐氯性能較強的菌株B723-3進行了生理生化的鑒定以及16S rRNA分子的鑒定，從分子水平確定耐氯菌株的種屬。
16S rDNA序列分析主要按照以下步驟1)提取細菌核DNA，a)集菌用高壓滅菌的牙簽挑單菌落接種于LB液管內培養(yǎng)18小時，取其菌懸液1ml于1.5ml的離心管中8000rpm離心5min，棄上清液。
b)加STE 1ml洗一次，振蕩重懸細菌，8000rpm離心5min，棄上清液。
c)加600μlTE，劇烈振蕩重懸細菌，加入10％的SDS 65μl，65℃水浴5-10min。
d)加等體積酚氯仿抽提三次。
e)小心吸取上清液，加入等體積的異丙醇和1/10體積的3MNaAc，12000rpm離心10min。徹底棄上清。
f)DNA沉淀用70％乙醇洗一次，風干后溶于20μlTE備用。
TE緩沖液10mmol/L Tris-Cl(pH8.0)；1mmol/L EDTA-Na2(pH8.0)，STE緩沖液0.1mol/L NaCl 10mmol/L Tris-Cl(pH8.0) 1mmol/L EDTA(pH8.0)，2)16S rDNA基因的PCR擴增，PCR擴增引物參照Weisburg等人的方法合成。
P1正向引物5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’P2反向引物5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’在50μL反應體積中，加入1μL模板DNA(0.1μg)，0.5μL P1和P2(終濃度為0.5μM)，1μLdNTP(每種NTP0.2mM)，0.5μLTaq聚合酶(2U)和5μL 10×PCR緩沖液。PCR擴增條件為94℃預變性5min；在94℃變性30s，61-65℃退火30s，72℃延伸1min，循環(huán)30次；最后72℃終延伸10min。
3)PCR產(chǎn)物的回收將PCR產(chǎn)物以1％瓊脂糖凝膠進行電泳后，在紫外燈下切取含欲回收片段的凝膠，放入1.5ml離心管中加2倍體積TE，65℃水浴10分鐘后加等體積水飽和酚抽提一次離心后取上層水相再用酚-氯仿-異戊醇抽提一次，收集上清加0.1倍體積的10mol/L乙酸銨和2倍體積無水乙醇沉淀，離心，用70％乙醇洗沉淀一次，風干后溶于適量滅菌雙蒸水。
4)16S rDNA的全序列測定和分析PCR測序用正反向引物參照Hiraishi等人方法合成。
P-fCACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC；P-rGGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC。
加入1μL模板DNA(＜0.1μg)，PCR擴增30個循環(huán)(94℃1min，55℃30s，72℃2min)。采用ABI PRISM測序試劑盒中染料終止劑終止反應。然后，在Applied Biosystem 373A DNA測序儀上測序。測得的16S rDNA序列采用BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫比較分析，最終從分子水平上確定該菌的種屬。
2、16S rDNA序列測定本發(fā)明采用對16SrRNA序列測定和分析的方法對細菌進行分子水平的鑒定。以細菌的核DNA為模板，以16S rRNA基因的PCR擴增的通用引物為引物，進行PCR擴增，得到長度為1515bp的擴增帶(用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測)，如圖2-1所示。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，測定其全序列。
<110>中國地質大學(武漢)<120>耐氯菌株3號及其篩選方法<160>1515<170>
<210>1<211>1515bp<212>DNA<213>松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)<220>
<221>misc_feature<222>
<400>1agtttgatcc tggctcagga tgaacgctgg cggcgtgcct aatacatgca agtcgagcga60acagatgaga agcttgcttc tctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa120cctacctata agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat aatattttga180accgcatggt tcaatagtga aagacggttt cggctgtcac ttatagatgg acccgcgccg240tattagctag ttggtaaggt aacggcttac caaggcgacg atacgtagcc gacctgagag300ggtgatcggc cacactggaa ctgagacacg gtccagactc ctacgggagg cagcagtagg360gaatcttccg caatgggcga aagcctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtctt420cggatcgtaa aactctgttg ttagggaaga acaaatttgt tagtaactga acaagtcttg480cggtacctaa ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt540ggcaagcgtt atccggaatt attgggcgta aagcgcgcgt aggcggtttc ttaagtctga600tgtgaaagcc cacggctcaa ccgtgggagg gtcattggaa actggggaaa cttgagtgca660gaaaaaggag agtggaattc catgtgtagc ggtgaaatgc gcagaagata tggaggaacc720cccagtggcg aaagcggctc tctggtctgt aactgacgct gatgtgcgaa agcgtgggga780tcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgagtgct agtgttaggg840ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg gagtacgacc900gcaaggttga aactcaaagg aattgacggg gacccgcaca agcggtggag catgtggttt960aattcgaagc aacgcgaaga accttaccaa atcttgacat cctttgaccg ctctagagat1020agagtcttcc ccttcggggg acaaagtgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt1080cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct taagcttagt tgccatcatt1140aagttgggca ctctaggttg actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca1200aatcatcatg ccccttatga tttgggctac acacgtgcta caatggataa tacaaagggc1260agcgaatccg cgaggccaag caaatcccat aaaattattc tcagttcgga ttgtagtctg1320caactcgact acatgaagct ggaatcgcta gtaatcgtag atcagcatgc tacggtgaat1380acgttcccgg gtcttgtaca caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagc1440cggtggagta accttttagg agctagccgt cgaaggtggg acaaatgatt ggggtgaagt1500cgtaacaagg taacc 1515三、菌落形態(tài)特征以及生理生化特性
對菌株B723-3耐氯微生物菌株的菌落形態(tài)進行了仔細的觀察，結果見圖3-1。同時對菌表觀也做了掃描電鏡觀察，結果見圖3-2。
一株耐氯菌株3號的菌落形態(tài)菌落菌斑較大(5mm)、呈米黃色、規(guī)則圓形、緣齊、不透明、表面光滑、微凸，粘稠；生理特征球形，直徑0.5～1.5μm，單個、成對或不規(guī)則堆狀，革蘭氏陽性；主要生化特征兼性厭氧，化能異養(yǎng)菌，接觸酶陽性，氧化酶陰性，產(chǎn)生精氨酸雙水解酶和脲酶等，從D-纖維二糖、D-巖糖、D-甘露醇、D-核糖、果糖、蔗糖產(chǎn)酸，不運動，不生孢，最適生長溫度30～37℃。
四、菌株B723-3為新的菌株采用BLAST分析法對菌株B723-3的16S rRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫比較分析發(fā)現(xiàn)，菌株B723-3與松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)的同源性最高，為99.0％。
綜合菌株的生理生化以及分子鑒定結果，菌株B723-3命名為松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)B723-3。查閱有關資料，尚無葡萄球屬有關高濃度氯離子條件下難降解有機廢水以及對其耐氯能力研究的報道。松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)B723-3為新的菌株，已于2005年10月24日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏號CCTCC NO.M205121。
本發(fā)明從湖北省十堰皂素廢水池底污泥中篩選分離出這一株細菌，并發(fā)現(xiàn)其有較好降解高濃度氯離子難降解皂素廢水的功能。這拓寬了人們對松鼠葡萄球菌(Staphylococcussciuri)在其功能方面的應用研究思路，并為降解含高濃度氯離子皂素廢水提供了有用的菌源和技術，具有較強的實際應用價值。
五、耐氯菌株3號的應用(一)、挑取松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)B723-3單菌落，于SM培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，按培養(yǎng)后的松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)B723-3含高濃度氯離子廢水(如混合皂素廢水)的體積比為0.5-2∶100取松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)B723-3接種于含高濃度氯離子廢水(如混合皂素廢水)中，20-40℃恒溫培養(yǎng)(最佳溫度30～37℃)，振搖速度為100-180rpm，pH值為7-8，反應24-72小時；所述的SM培養(yǎng)基為蛋白胨10g；牛肉膏5g；蒸餾水1000ml；瓊脂20g(固)；CaCl215.6g/L，pH＝7.5。
(二)、降解因素試驗菌株B723-3的降解能力與接種量、振蕩時間、轉速、pH值等環(huán)境因素有關，改變反應時間、振蕩轉速、pH、接種量，來確定降解高濃度氯離子皂素廢水的降解最佳條件，為微生物法處理高濃度氯離子廢水的實際應用提供有用的工藝參數(shù)。以下的單因素多水平的實驗中，除改變所研究的因素外，其余都按以下條件進行挑取菌株B723-3單菌落，于LB培養(yǎng)基中前培養(yǎng)過夜，取1mL接種于100ml混合皂素廢水中([Cl-]2萬mg/L左右，初始COD5400mg/L)，30℃恒溫培養(yǎng)，振搖速度為150rpm，pH值為7.5，反應72小時測定廢水中的COD值。
1)反應時間的影響取廢水50ml加入250ml的錐形瓶中，加入經(jīng)前培養(yǎng)的菌株B723-3的菌懸液。每隔24小時檢測廢水的COD值，試驗結果圖4-1。
從圖4-1可以看出菌株B723-3對高濃度氯離子皂素廢水COD的去除率隨降解時間的增加而增加，當反應時間達到72h時，其COD去除率不再上升。此時的COD去除率為56.3％。
2)接種量的影響改變培養(yǎng)基的接種量分別為每100mL中廢水中接入0.5、1.0、1.5、2.0mL的前培養(yǎng)物，其余條件不變，檢測其COD去除率。結果如圖4-2。
從圖4-2可以看出，當接種量在0.5-2ml之間變化時，B723-3對COD的去除率無明顯變化(47.78-56.3％)，當接種量為1ml時，其去除率最好。當接種量大于1ml時，隨著接菌量的增加，降解率在72小時后并沒有提高。這是因為菌株的生長需要一定的營養(yǎng)物質，接種量過大會導致細菌生長因相互競爭而受到抑制，從而影響降解效率的提高。
3)pH影響改變培養(yǎng)基的pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，其余條件不變，檢測其COD去除率。結果如圖4-3。
從圖4-3可以看出，B723-3對COD的去除率隨pH的增加先增加后下降，其最高去除率在pH為7-8時，達到56％左右。離心處理后的廢水，發(fā)現(xiàn)pH為7-8時，濕菌體量明顯高于pH為5、6和9時，可見在pH在中性偏堿時，有利于菌株的生長。
4)搖床轉速的影響改變振搖速度分別為90、120、150、180rpm，檢測其COD值。結果如圖4-4。
從圖4-4可以看出，轉速對COD的去除有一定的影響，B723-3對COD的去除率隨轉速的增加先增加后下降，其最佳轉速為150rpm。這是因為當轉速增加時，提高了微生物與廢水的接觸率，致使COD的去除率會增加，但轉速增加到一定速度時，細胞受到剪切力的作用而使其活性降低。
(三)、菌株B723-3對皂素廢水降解能力取皂素生產(chǎn)混合廢水，稀釋一定倍數(shù)，使其COD為5400mg/L，[Cl-]為2萬mg/L。取皂素混合廢水50ml分別加入250ml的錐形瓶中，分別加入菌株的菌懸液1ml，30℃、150rpm、pH值＝7.1-7.5，搖床振蕩3d，計算菌株對廢水的COD和Cl-的去除情況，菌株B723-3去除COD的效率好，為56.3％。
菌株B723-3在高濃度氯離子(5000-80000mg/L)高COD(UASB-1反應器進水COD＝17000mg/L左右)條件下均有良好的去除皂素廢水中COD的能力，其COD的去除率為56.3％。
權利要求
1.一株耐氯菌株3號，其特征在于所述的菌株為松鼠葡萄球菌(Staphylococcussciuri)B723-3CCTCC NO.M205121。
2.根據(jù)權利要求1所述的一株耐氯菌株3號，其特征在于所述的松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)B723-3的菌落形態(tài)菌落菌斑較大、呈米黃色、規(guī)則圓形、緣齊、不透明、表面光滑、微凸，粘稠；生理特征球形，直徑0.5～1.5μm，單個、成對或不規(guī)則堆狀，革蘭氏陽性；主要生化特征兼性厭氧，化能異養(yǎng)菌，接觸酶陽性，氧化酶陰性，產(chǎn)生精氨酸雙水解酶和脲酶等，從D-纖維二糖、D-巖糖、D-甘露醇、D-核糖、果糖、蔗糖產(chǎn)酸，不運動，不生孢，最適生長溫度30～37℃。
3.如權利要求1所述的一株耐氯菌株3號的篩選方法，其特征在于1)、初篩制備初篩菌懸液稱取皂素廢水調節(jié)池池底底泥樣1g或皂素廢水調節(jié)池內污水1mL接種于高壓滅菌的SM培養(yǎng)基中，30℃-37連續(xù)培養(yǎng)30天進行富集，得初篩菌懸液；取初篩菌懸液20μl涂布于固體SM培養(yǎng)基；在初篩平板上挑取不同形態(tài)的單菌落在液體SM培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，并進一步進行涂布分離，經(jīng)多次純化、分離，最后得到不同菌落形態(tài)的純平板；挑取純平板的單菌落于SM培養(yǎng)基中，30℃恒溫培養(yǎng)過夜，得分離菌懸液；2)、二次篩選制備復篩菌懸液在100ml濃度為9萬、8萬、7萬、6萬、5萬、4萬、3萬、2萬、1萬或0.5萬mg/L的氯離子的液體SM培養(yǎng)基內，加入初篩分離菌的分離菌懸液50μl，30℃恒溫振搖5-7天，得復篩菌懸液；取復篩菌懸液20μl涂于固體SM培養(yǎng)基，30℃恒溫培養(yǎng)1-2天，觀察并記錄細菌生長情況以及菌落形態(tài)；獲得一株編號為菌株B723-3的菌株，即耐氯菌株3號。
4.根據(jù)權利要求3所述的一株耐氯菌株3號的篩選方法，其特征在于所述的SM培養(yǎng)基為蛋白胨10g；牛肉膏5g；蒸餾水1000ml；固狀瓊脂20g；CaCl215.6g/L，pH＝7.5。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種耐氯微生物。一株耐氯菌株3號，其特征在于所述的菌株為松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)B723－3 CCTCC NO.M205121。菌落形態(tài)菌落菌斑較大、呈米黃色、規(guī)則圓形、緣齊、不透明、表面光滑、微凸，粘稠；生理特征球形，直徑0.5～1.5μm，單個、成對或不規(guī)則堆狀，革蘭氏陽性；主要生化特征兼性厭氧，化能異養(yǎng)菌，接觸酶陽性，氧化酶陰性，產(chǎn)生精氨酸雙水解酶和脲酶等，從D－纖維二糖、D－巖糖、D－甘露醇、D－核糖、果糖、蔗糖產(chǎn)酸，不運動，不生孢，最適生長溫度30～37℃。它既可在含高濃度氯離子環(huán)境下生存、又可高效降解高濃度有機污染物。
文檔編號C12R1/44GK1793327SQ20051001975
公開日2006年6月28日 申請日期2005年11月4日 優(yōu)先權日2005年11月4日
發(fā)明者鮑建國, 王焰新, 劉慧 , 張彩香, 信欣, 李耀辰, 劉雙, 李平, 張莉君 申請人:中國地質大學(武漢)