專利名稱：涅氏短狀桿菌新菌株及其所產(chǎn)酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種涅氏短狀桿菌(Brachybacterium nesterenkovii)新菌株及其培養(yǎng)條件、生理生化特性和所產(chǎn)酶的制備方法。該新菌株已于2005年7月20日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NOM 205113。
背景技術(shù)：
涅氏短狀桿菌(Brachybacterium)屬首次發(fā)現(xiàn)于1988年(Collins M.D，Brown J，Jones D，et al.Brachybacterium faecium gene.Nov.，sp.nov.，a coryneform bacterium from poultry deep litter.Int.J.Syst.Bacteriol.，1988，3845～48.)，目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)報(bào)道。Brachybacterium屬目前發(fā)現(xiàn)并且已經(jīng)定種的有11種，未定種的26種。定種的11種分別是B.alimentarium，B.conglomeratum，B.faecium，B.fresconis，B.nesterenkovii，B.paraconglomeratum，B.rhamnosum，B.sacelli，B.Tyrofermentans，Brachybacterium arcticum和B.muris，。其中最早發(fā)現(xiàn)的是B.faecium和于1992年首次報(bào)道B.nesterenkovii相比，B.nesterenkovii的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)缺少肽聚糖，因此B.nesterenkovii具有更好的基因序列。另外，兩者DNA-DNA雜交結(jié)果表明它們的同源性只有22％。國(guó)外B.nesterenkovii菌株是從奶酪中分離得到的(Gvozdyak O.R，Nogina T.M，Schumann P.，et al.Taxonmic study of the genus BrachybacteriumBrachybacterium nesterenkovii sp.nov.Int.J.Syst.Bacteriol.，1992，4274～78.)。目前對(duì)于這種菌種的研究大多集中在基因和氨基酸序列的測(cè)定分析方面(Manabu Muto，Yoshiaki Hitomi.Acetaldehyde production by non-pathogenic Neisseria in human oral microfloraImplications for carcinogenesis in upper aerodigestive tract[J].International Journal of Cancer.2000，88(3)342～350.)，而對(duì)于它的功能和應(yīng)用尚未有過(guò)研究報(bào)道。
另一方面，乙醇在人體內(nèi)的代謝主要靠體內(nèi)的兩種酶一種是乙醇脫氫酶(AlcoholDehydrogenase，ADH)；另一種是乙醛脫氫酶(Aldehyde Dehydrogenase，ALDH)。前者使乙醇轉(zhuǎn)化為乙醛，而后者則使乙醛轉(zhuǎn)化為乙酸，最終分解為二氧化碳和水。一般來(lái)說(shuō)，人體中都存在前一種酶，而且數(shù)量基本是相等的，但缺少后一種酶的人就比較多。ALDH的缺少，使乙醇不能被完全分解為水和二氧化碳，而是以乙醛的形式繼續(xù)留在體內(nèi)。目前，大量國(guó)內(nèi)外的研究表明，乙醛在體內(nèi)過(guò)度積累是醉酒的最主要原因。因此利用上述乙醛脫氫酶、乙醇脫氫酶的特性和功效開發(fā)有效的解酒藥物具有較高的應(yīng)用價(jià)值和市場(chǎng)前景。乙醇脫氫酶、乙醛脫氫酶雖可從一些動(dòng)物的肝臟、胰腺等內(nèi)臟進(jìn)行提取，但提取過(guò)程較為復(fù)雜，成本高，不易規(guī)模化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是要培養(yǎng)篩選出一種涅氏短狀桿菌(Brachybacteriumnesterenkovii)新菌株，并且應(yīng)用該菌株產(chǎn)生和制備乙醛脫氫酶的方法。
本發(fā)明是從土壤中篩選得到一種涅氏短狀桿菌(Brachybacterium nesterenkovii 1#)新菌株，它具有保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NOM205113的樣品特征。
該培養(yǎng)物已于2005年7月20日由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心收到，并登記入冊(cè)。該培養(yǎng)物的存活性于2005年10月18日檢測(cè)完畢，結(jié)果為存活。
本發(fā)明的涅氏短狀桿菌新菌株其形態(tài)為短桿狀，菌體呈淺黃色，大小為0.5～0.75×1.0～2.5μm，革蘭氏染色呈陽(yáng)性(見圖1)，其透射電鏡圖(TEM)見圖2、3；不產(chǎn)內(nèi)生孢子也無(wú)運(yùn)動(dòng)性；同時(shí)該菌株能產(chǎn)過(guò)氧化氫酶、酯化酶；能夠利用L-乳酸、乙酸、丙酮酸、α-酮基-戊二酸、D-半乳糖、龍膽二糖、α-D-葡萄糖，D-木糖等多種糖類物質(zhì)能作為碳源，而苦杏仁苷、D-阿拉伯醇、纖維二糖、果糖海藻糖、D-半乳糖醛酸、m-肌醇、尿苷、D-阿洛酮糖、肌腺、腺苷和甘油等不能作為它的碳源；另外，L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-天冬酰胺和丁二胺能作為它的氮源，而L-絲氨酸和N-乙酰-D-葡萄糖胺不能作為它的氮源。
本發(fā)明應(yīng)用該菌株產(chǎn)生和制備乙醛脫氫酶的方法為配制土壤溶液，梯度稀釋，取稀釋的土壤溶液200μl涂布到30μl牛肉膏培養(yǎng)基中，同時(shí)加入100μl～800μl乙醇誘導(dǎo)劑，然后置于30℃～40℃的溫度下培養(yǎng)16h～48h(小時(shí))，多次分離純化培養(yǎng)；經(jīng)鏡檢為單一菌株；然后經(jīng)液體發(fā)酵，再對(duì)該發(fā)酵液超聲波破碎，離心分離提純后測(cè)其活性即成。
在上述培養(yǎng)條件下得到菌株產(chǎn)乙醛脫氫酶的活性最高可達(dá)到12.5U/ml。
上述方案中，超聲波破碎的破碎功率p＝200w～800w，破碎時(shí)間t＝5min～25min；離心分離的轉(zhuǎn)速N＝4000rpm，時(shí)間t＝5min～15min。稀釋的土壤溶液濃度為10-5g/ml～10-3g/ml。分離純化培養(yǎng)為3～6次。
本發(fā)明得到的菌株和國(guó)外已經(jīng)報(bào)道過(guò)的B.nesterenkovii菌株在培養(yǎng)條件和來(lái)源上都不同，國(guó)外B.nesterenkovii菌株是從奶酪中分離得到的。而我們得到的菌株來(lái)源于微生物多樣性很高的土壤，培養(yǎng)的工藝條件也較為簡(jiǎn)單易行。通過(guò)對(duì)本發(fā)明菌株生理生化特性的研究，該菌株還能產(chǎn)過(guò)氧化氫酶、酯化酶、乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶，它們都是具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的酶且活性較高，因此該菌株具有較高的應(yīng)用價(jià)值和市場(chǎng)前景，可以利用它開發(fā)解酒的藥物或保健品。
本發(fā)明的有益效果在于1、該菌株是一種能夠產(chǎn)乙醛脫氫酶以及乙醇脫氫酶等多種酶的菌株。2、采用土壤微生物為原料培養(yǎng)菌株，培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單易行，成本低廉，更有利于工業(yè)化生產(chǎn)。3、該菌株在37℃時(shí)活性較高，和人的體溫相吻合，更有利于促使乙醇在人體內(nèi)的代謝。


圖1為本發(fā)明革蘭氏染色后菌株菌體形態(tài)放大圖。
圖2為本發(fā)明菌株放大17×1000倍的細(xì)胞結(jié)構(gòu)透射電鏡掃描圖(TEM)。
圖3為本發(fā)明菌株放大7.5×1000倍的內(nèi)部結(jié)構(gòu)透射電鏡掃描圖(TEM)。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
實(shí)施例1稱取5g NaCl，10g蛋白胨，3g牛肉膏，1000ml蒸餾水，16g～20g瓊脂配制牛肉膏培養(yǎng)基；
配制1％(按重量計(jì)為0.01g土壤/ml水)的土壤溶液，梯度稀釋，制取濃度為10-5g/ml的土壤溶液，取200μl稀釋的土壤溶液加入到30ml牛肉膏培養(yǎng)基中，同時(shí)加入200μl～400μl的乙醇誘導(dǎo)劑，然后將此培養(yǎng)基于35℃～37℃溫度下培養(yǎng)16h～36h；4～5次分離純化培養(yǎng)，經(jīng)鏡檢為單一菌株后于4℃斜面保藏。該菌株的生理生化特征請(qǐng)?jiān)斠姳?。
將篩選得到的菌種由斜面接到30ml(250ml三角瓶)含有5gNaCl，10g蛋白胨，3g牛肉膏，1000ml蒸餾水的發(fā)酵液中，加入200μl～400μl乙醇誘導(dǎo)劑，于35℃～37℃、150r/min下培養(yǎng)4d～6d(天)，得到我們所需要的乙醛脫氫酶，再對(duì)該發(fā)酵液破碎(p＝600w，t＝10min)、離心分離(N＝4000rpm，t＝5min～8min)提純，測(cè)其活性，達(dá)12.5U/ml。
實(shí)施例2稱取5g NaCl，10g蛋白胨，3g牛肉膏，1000ml蒸餾水，16g～20g瓊脂配制牛肉膏培養(yǎng)基發(fā)酵液。
配制濃度為10-4g/ml的土壤溶液，取200μl加入到30ml牛肉膏培養(yǎng)基中，同時(shí)加入200μl～400μl的乙醇誘導(dǎo)劑，然后將此培養(yǎng)基于30℃～37℃培養(yǎng)16h～36h。按實(shí)施例1的方法進(jìn)行液體發(fā)酵，再對(duì)該發(fā)酵液超聲波破碎，離心分離提純后測(cè)其活性。經(jīng)鏡檢為單一菌株后測(cè)其菌株的產(chǎn)乙醛脫氫酶活性達(dá)8.3333U/ml。
實(shí)施例3稱取5g NaCl，10g蛋白胨，3g牛肉膏，1000ml蒸餾水，16g～20g瓊脂配制牛肉膏培養(yǎng)基發(fā)酵液。
配制濃度為10-4g/ml的土壤溶液，取200μl加入到30ml牛肉膏培養(yǎng)基中，同時(shí)加入200μl～400μl的乙醇誘導(dǎo)劑，然后將此培養(yǎng)基于30℃～37℃培養(yǎng)16h～36h。按實(shí)施例1的方法進(jìn)行液體發(fā)酵，再對(duì)該發(fā)酵液超聲波破碎，離心分離提純后測(cè)其活性。經(jīng)鏡檢為單一菌株后測(cè)其菌株的產(chǎn)乙醛脫氫酶活性達(dá)6.5789U/ml。
表1涅氏短狀桿菌生理生化特性

權(quán)利要求
1.一種涅氏短狀桿菌(Brachybacterium nesterenkovi)新菌株，其特征在于它具有保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NOM205113的樣品特征。
2.按權(quán)利要求1所述的涅氏短狀桿菌新菌株，其特征在于所述的涅氏短狀桿菌新菌株其形態(tài)為短桿狀，菌體呈淺黃色，大小為0.5～0.75×1.0～2.5μm，革蘭氏染色呈陽(yáng)性，不產(chǎn)內(nèi)生孢子也無(wú)運(yùn)動(dòng)性；同時(shí)該菌株能產(chǎn)過(guò)氧化氫酶、酯化酶；能夠利用L-乳酸、乙酸、丙酮酸、α-酮基-戊二酸、D-半乳糖、龍膽二糖、α-D-葡萄糖，D-木糖等多種糖類物質(zhì)能作為碳源，而苦杏仁苷、D-阿拉伯醇、纖維二糖、果糖海藻糖、D-半乳糖醛酸、m-肌醇、尿苷、D-阿洛酮糖、肌腺、腺苷和甘油等不能作為它的碳源；另外，L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-天冬酰胺和丁二胺能作為它的氮源，而L-絲氨酸和N-乙酰-D-葡萄糖胺不能作為它的氮源。
3.一種應(yīng)用權(quán)利要求1所述的菌株產(chǎn)生和制備乙醛脫氫酶的方法，其特征在于配制土壤溶液，梯度稀釋，取稀釋的土壤溶液200μl涂布到30μl牛肉膏培養(yǎng)基中，同時(shí)加入100μl～800μl乙醇誘導(dǎo)劑，然后置于30℃～40℃的溫度下培養(yǎng)16h～48h，多次分離純化培養(yǎng)；經(jīng)鏡檢為單一菌株；然后經(jīng)液體發(fā)酵，再對(duì)該發(fā)酵液超聲波破碎，離心分離提純后測(cè)其活性即成。
4.按權(quán)利要求3所述的產(chǎn)生和制備乙醛脫氫酶的方法，其特征在于稀釋的土壤溶液濃度為10-5g/ml～10-3g/ml，分離純化培養(yǎng)為3～6次。
5.按權(quán)利要求3或4所述的產(chǎn)生和制備乙醛脫氫酶的方法，其特征在于超聲波破碎的破碎功率p＝200w～800w，破碎時(shí)間t＝5min～25min；離心分離的轉(zhuǎn)速N＝4000rpm，時(shí)間t＝5min～15min。
6.按權(quán)利要求3或4所述的產(chǎn)生和制備乙醛脫氫酶的方法，其特征在于配制1％的土壤溶液，取濃度為10-5g/ml的土壤溶液，加入200μl～400μl的乙醇誘導(dǎo)劑，將此培養(yǎng)基于35℃～37℃下培養(yǎng)16h～36h。
7.按權(quán)利要求3或4所述的產(chǎn)生和制備乙醛脫氫酶的方法，其特征在于將篩選得到的菌種由斜面接到30ml含有5g NaCl，10g蛋白胨，3g牛肉膏，1000ml蒸餾水的發(fā)酵液中，加入200μl～400μl乙醇誘導(dǎo)劑，于35℃～37℃、150r/min下培養(yǎng)4d～6d，得到所需要的乙醛脫氫酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種涅氏短狀桿菌(Brachybacterium nesterenkovi)新菌株及其培養(yǎng)條件、生理生化特性和所產(chǎn)酶的制備方法。該方法為配制土壤溶液，梯度稀釋，取特定梯度的溶液200μl涂布到30μl牛肉膏培養(yǎng)基中，同時(shí)加入100μl～800μl乙醇誘導(dǎo)劑
文檔編號(hào)C12R1/13GK1793328SQ20051001978
公開日2006年6月28日 申請(qǐng)日期2005年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月11日
發(fā)明者吳元欣, 薛永萍, 趙玉鳳, 王存文, 池汝安, 朱圣東 申請(qǐng)人:武漢化工學(xué)院