專利名稱：單鏈抗體a1－甲基對硫磷水解酶融合蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖生物病毒抗體，更具體涉及對蝦白斑綜合癥病毒單鏈抗體和甲基對硫磷水解酶融合蛋白。
背景技術(shù)：
1993年以來，我國蝦病爆發(fā)性流行，引起養(yǎng)殖的對蝦大面積死亡，經(jīng)濟損失慘重。研究表明，其主要是由一種新的對蝦白斑綜合癥病毒所致。該病毒可以感染我國所有人工養(yǎng)殖的對蝦種類，感染性強，發(fā)病快，死亡率高，給對蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來極大的危害。目前，對對蝦病毒病尚無有效的治療方法，避免與病毒病源接觸被認為是最有效的預(yù)防措施，而這主要依賴于早期的快速診斷。目前的診斷方法主要有核酸探針技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)。核酸探針技術(shù)對技術(shù)條件要求高，廣大蝦農(nóng)掌握此技術(shù)難度很大，難以推廣；酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)雖可在養(yǎng)蝦場應(yīng)用，但由于此法所需的多克隆抗體和單克隆抗體制備麻煩、費用高，限制了該技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。為此我們利用目前最先進的制備抗體的方法——噬菌體展示技術(shù)，制備了特異識別對蝦白斑綜合癥病毒的單鏈抗體A1。
“一種識別對蝦白斑桿狀病毒的單鏈抗體A1極其用途”，專利號ZL00131231.6。該專利是用噬菌體抗體展示的新技術(shù)，制備出識別對蝦白斑桿狀病毒的單鏈抗體A1。關(guān)于“對蝦白斑桿狀病毒”的名稱現(xiàn)在由國際病毒命名委員會統(tǒng)一命名為“對蝦白斑綜合癥病毒”(www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/Ictv/index.htm)。因此，本發(fā)明所述的“對蝦白斑綜合癥病毒”即為專利號ZL00131231.6中的“對蝦白斑桿狀病毒”。
用對蝦白斑綜合癥病毒的單鏈抗體A1檢測對蝦白斑綜合癥病毒的過程為先將對蝦血淋巴液點在硝酸纖維素膜上，然后與單鏈抗體A1相互作用，然后再用識別單鏈抗體上的E-tag的抗體作為二抗，與A1結(jié)合，最后通過測定與二抗偶聯(lián)的辣根過氧化物酶的活力確定病毒的含量。雖然該檢測方法所用抗體的制備，比傳統(tǒng)的多克隆抗體和單克隆抗體更簡便，成本更低，但在檢測程序上還是需要二抗及其偶聯(lián)其上的辣根過氧化物酶用于顏色反應(yīng)。
甲基對硫磷水解酶是由楚曉娜、張先恩等于2003年篩選出的一株甲基對硫磷降解菌(Pseudomonas sp.WBC-3)中分離確定的(“假單胞菌WBC-3甲基對硫磷水解酶性質(zhì)的初步研究”《微生物學(xué)報》2003，43(4)453-459)。該論文介紹了甲基對硫磷水解酶可以甲基對硫磷為唯一碳源、氮源，將其徹底降解為生長基質(zhì)。定位于大質(zhì)粒上的甲基對硫磷水解酶基因是一個新的基因，命名為mph。甲基對硫磷水解酶作為標記酶具有以下優(yōu)點1)甲基對硫磷水解酶(MPH)的分子量較小適合與其它蛋白進行融合；2)其檢測底物范圍較廣，相對于堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、葡萄糖氧化酶標記酶，其底物價格低廉，其產(chǎn)物在405nm處有特定的吸收峰，可以方便地進行檢測；3)此外，它可以在大腸桿菌表達系統(tǒng)中進行表達，生長周期相對于酵母短，更適合于大規(guī)模的生產(chǎn)；4)其最大的優(yōu)點在于其與底物反應(yīng)速度快、反應(yīng)靈敏，能夠在短時間內(nèi)檢測到酶的存在。此外，對蝦血淋巴液中具有較強的與堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶底物反應(yīng)的活力，卻沒有與甲基對硫磷水解酶底物反應(yīng)的活力。因此，用甲基對硫磷水解酶作為標記酶，可以使樣品中的干擾信號大大降低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種單鏈抗體A1-甲基對硫磷水解酶的融合蛋白。本發(fā)明的另一目的是提供該融合蛋白的制備方法。該方法將特異識別對蝦白斑綜合癥病毒的單鏈抗體A1與甲基對硫磷水解酶通過基因融合，用該融合蛋白可直接與病毒結(jié)合，并通過酶學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生顏色反應(yīng)，由此可以省去用識別對蝦白斑綜合癥病毒的單鏈抗體A1檢測病毒時必須的二抗操作步驟，簡化了操作程序，并降低了檢測成本。
本發(fā)明所述單鏈抗體A1是指“一種識別對蝦白斑桿狀病毒的單鏈抗體A1及其用途”專利號ZL00131231.6中所述的識別對蝦白斑桿狀病毒的單鏈抗體A1。由于“對蝦白斑桿狀病毒”的名稱已由國際病毒命名委員會統(tǒng)一命名為“對蝦白斑綜合癥病毒”，其英文名稱為“White Spot Syndrome Virus”，網(wǎng)站www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/Ictv/index.htm可查到此內(nèi)容。因此，本發(fā)明所述的“對蝦白斑綜合癥病毒”即為專利號ZL00131231.6中的“對蝦白斑桿狀病毒”。
為了達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
單鏈抗體A1-甲基對硫磷水解酶融合蛋白的DNA序列為ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGGTACAGCCGCACCGCAGGTGCGCACCTCGGCCCCCGGCTACTACCGGATGCTGCTGGGCGACTTCGAAATCACCGCGCTGTCGGACGGCACGGTGGCGCTGCCGGTCGACAAGCGGCTGAACCAGCCGGCCCCGAAGACGCAGAGCGCGCTGGCCAAGTCCTTCCAGAAAGCGCCGCTCGAAACCTCGGTCACCGGTTACCTCGTCAACACCGGCTCCAAGCTGGTGCTGGTGGACACCGGCGCGGCCGGCCTGTTCGGCCCCACCCTGGGCCGGCTGGCGGCCAACCTCAAGGCCGCAGGCTATCAGCCCGAGCAGGTCGACGAGATCTACATCACCCACATGCACCCCGACCACGTGGGCGGCTTGATGGTGGGTGAGCAACTGGCGTTCCCGAACGCGGTGGTGCGTGCGGACCAGAAAGAAGCCGATTTCTGGCTCAGCCAGACCAACCTCGACAAGGCCCCGGACGACGAGAGCAAAGGCTTCTTCAAAGGCGCCATGGCCTCGCTGAACCCCTATGTGAAGGCCGGCAAGTTCAAGCCTTTCTCGGGGAACACCGACCTGGTGCCCGGCATCAAAGCGCTGGCCAGCCACGGCCACACCCCGGGCCACACCACCTACGTGGTCGAAAGCCAGGGGCAAAAGCTCGCCCTGCTCGGCGACCTGATACTCGTCGCCGCGGTGCAGTTCGACGACCCCAGCGTCACGACCCAGCTCGACAGCGACAGCAAGTCCGTCGCGGTGGAGCGCAAGAAGGCCTTCGCGGATGCCGCCAAGGGCGGCTACCTGATCGCGGCGTCCCACCTGTCGTTCCCCGGCATCGGCCACATCCGCGCCGAAGGCAAGGGCTACCGTTTCGTGCCGGTGAACTACTCGGTCGTCAACCCCAAGTCTAGAAGCGGCTCTGGTTCCGGTAGCGGTTCCGGCACTAGTATGGCCGAGGTGAAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGCGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAAGTTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTATATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAATGGATTGGATGGATTTATCCTGACAATGGTAATACTATATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCAGAATAACAGCAGATACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGTTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGTGGTGGTAACCCCTGGTACTGGGGTCAAGGCACCACTCTCTCCGTGTCGACAGGTGGAGGCGGCTCTGGTGGCGGTGGCAGTGGCGGCGGAGGTTCTGACGTCGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCGATCTCCTAAAACACTGATTTACTCGGCATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGTCAGCAATATAGCAGCTATCCTCTCACATTCGGTGGTGGGACCAAGTTGGAAATCAAGCGCGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATAG用單鏈抗體A1與甲基對硫磷水解酶制備單鏈抗體A1-甲基對硫磷水解酶融合蛋白的方法按下列步驟進行1、用帶有Spe I內(nèi)切酶位點的上游引物5’-CCCCGACTAGTATGGCCGAGGTGAAGCT-3’和帶有HindIII內(nèi)切酶位點的下游引物5’-CACCAAGCTTTTAGCGCTTGATTTCCAAC-3’，通過PCR，將單鏈抗體A1-E-tag的基因從原噬菌粒載體pCANTAB5E-A1E中擴增下來。將PCR擴增的片段首先克隆到pGEM-T載體上。將連接的A1基因用Spe I和HindIII內(nèi)切酶酶切下來，用Gel Extraction Kit(Sigma公司)進行純化和回收。
2、用帶有SnaB I內(nèi)切酶位點的上游引物5’-TATTACGTACAGCCGCACCGCAGGT-3’，和帶有Xba I內(nèi)切酶位點的下游引物5’-TGGGCTCTAGACTTGGGGTTGACGA-3’，通過PCR，將甲基對硫磷水解酶基因從原載體pET5a-MPH中擴增下來。將PCR擴增的片段首先克隆到pGEM-T載體上。將連接的MPH基因用SnaB I和Xba I內(nèi)切酶酶切下來，用Gel Extraction Kit(Sigma公司)進行純化和回收。
3、將人工合成的、N端具有Xba I內(nèi)切酶切口和C端具有Spe I內(nèi)切酶切口序列的、編碼[-(Gly-Ser)5-]小肽的寡核苷酸片段互補鏈，在65℃中保溫5分鐘退火使其形成互補的雙鏈DNA小片段5’-CTAGAAGCGGCTCTGGTTCCGGTAGCGGTTCCGGCA-3’3’-TTCGCCGAGACCAAGGCCATCGCCAAGGCCGTGATC-5’4、將這個DNA小片段作為連接物(L)與上述已用相應(yīng)的內(nèi)切酶進行酶切后的A1E基因片段和MPH基因片段進行連接，形成MPH-L-A1E的融合基因，并克隆到具有Stu l/HindIII內(nèi)切酶切口的pASK75載體上(SnaB I和Stu I均為平端酶，二者所切出的切口可以連接)得到連接產(chǎn)物pASK75-MPH-L-A1E。
5、將上述連接產(chǎn)物pASK75-MPH-L-A1E電轉(zhuǎn)移到大腸桿菌SM547中。
6、將具有融合蛋白基因的大腸桿菌在LB broth培養(yǎng)液中生長至對數(shù)期，然后用200μg/ml的四環(huán)素誘導(dǎo)融合蛋白的表達。通過離心收集菌體，利用滲透休克法制備融和蛋白的周質(zhì)空間提取物。
7、將融和蛋白的周質(zhì)空間提取物用RPAS Purification Module(Pharmacia公司)進行純化，得到單鏈抗體A1-甲基對硫磷水解酶融合蛋白。
本發(fā)明所述的“引物”和“DNA小片段”只要設(shè)計好其序列，均有公司可商業(yè)化生產(chǎn)。
用單鏈抗體A1-甲基對硫磷水解酶融合蛋白檢測對蝦白斑綜合癥病毒的方法為用2倍PBS稀釋剃度6.25～100納克蛋白量的對蝦白斑綜合癥病毒包被96孔酶標板，4℃過夜，然后用4％脫脂牛奶/PBS封閉，37℃2小時。用PBS和PBST溶液各洗3次后，每孔加入100μl的單鏈抗體A1-甲基對硫磷水解酶融合蛋白，在37℃保溫1.5小時。用PBS和PBST溶液各洗3次后，每孔加入100μl含有0.25mM底物O，O-Dimethyl-O-(4-Nitrophenylmethyl)phosphorothioate(pH9.0)的溶液，在室溫下反應(yīng)60分鐘。通過在405nm波段的光吸收值，按照陽性樣品吸收值為陰性對照吸收值的2倍，來確定單鏈抗體A1-甲基對硫磷水解酶融合蛋白所能檢測出的最小病毒量。
本發(fā)明的優(yōu)點與效果本發(fā)明結(jié)合了單鏈抗體易于基因操作的優(yōu)點，和甲基對硫磷水解酶分子量小，酶活力易于檢測的優(yōu)點，通過基因融合的方法，將特異識別對蝦白斑綜合癥病毒的單鏈抗體A1與甲基對硫磷水解酶進行了融合。用該融合蛋白可直接與病毒結(jié)合，并產(chǎn)生顏色反應(yīng)，由此可以省去用識別對蝦白斑綜合癥病毒的單鏈抗體A1檢測病毒時必須的二抗操作步驟，簡化了操作程序，并降低了檢測成本。


圖1是重組質(zhì)粒pASK75-MPH-L-A1E質(zhì)粒圖譜。
圖2是融和蛋白檢測2倍稀釋對蝦白斑綜合癥病毒的ELISA結(jié)果。
具體實施例方式用單鏈抗體A1與甲基對硫磷水解酶制備單鏈抗體A1-甲基對硫磷水解酶融合蛋白的方法按下列步驟進行1、用帶有Spe I內(nèi)切酶位點的上游引物5’-CCCCGACTAGTATGGCCGAGGTGAAGCT-3’和帶有HindIII內(nèi)切酶位點的下游引物5’-CACCAAGCTTTTAGCGCTTGATTTCCAAC-3’，通過PCR，將單鏈抗體A1的基因從噬菌粒載體pCANTAB5E-A1E中擴增下來。PCR的條件為94℃5分鐘；94℃45秒，44℃1分鐘，72℃2分鐘，5個循環(huán)；94℃45秒，62℃1分鐘，72℃2分鐘，25個循環(huán)；72℃7分鐘；4℃10分鐘。將PCR擴增的片段首先克隆到pGEM-T載體上，通過PCR和內(nèi)切酶分析，挑選出連接有A1基因的克隆子。將連接的A1基因用Spe I和HindIII內(nèi)切酶酶切下來，酶切條件為Spe I和HindIII雙酶切37℃4小時，然后用Gel Extraction Kit(Sigma公司)進行純化和回收。
2、用帶有SnaB I內(nèi)切酶位點的上游引物5’-TATTACGTACAGCCGCACCGCAGGT-3’，和帶有Xba I內(nèi)切酶位點的下游引物5’-TGGGCTCTAGACTTGGGGTTGACGA-3’，通過PCR，將甲基對硫磷水解酶(MPH)基因從原由載體pET5a-MPH中擴增下來。PCR的條件是94℃5分鐘；94℃45秒，44℃1分鐘，72℃2分鐘，5個循環(huán)；94℃45秒，62℃1分鐘，72℃2分鐘，25個循環(huán)；72℃7分鐘；4℃10分鐘。將PCR擴增的片段首先克隆到pGEM-T載體上，通過PCR和內(nèi)切酶分析，挑選出連接有MPH基因的克隆子。將連接的MPH基因用SnaB I和Xba I內(nèi)切酶酶切下來，酶切條件為首先用SnaB I 37℃酶切2小時，將酶切產(chǎn)物用PCR回收試劑盒(Sigma公司)純化回收；Xba I 37℃酶切純化產(chǎn)物2小時，然后用GelExtraction Kit(Sigma公司)進行純化和回收。
3、將人工合成的、N端具有Xba I內(nèi)切酶切口和C端具有Spe I內(nèi)切酶切口序列的、編碼[-(Gly-Ser)5-]小肽的寡核苷酸片段互補鏈，在65℃中保溫5分鐘退火使其形成互補的雙鏈DNA小片段5’-CTAGAAGCGGCTCTGGTTCCGGTAGCGGTTCCGGCA-3’3’-TTCGCCGAGACCAAGGCCATCGCCAAGGCCGTGATC-5’4、將這個DNA小片段作為連接物(L)與上述已用相應(yīng)的內(nèi)切酶進行酶切后的A1E基因片段和MPH基因片段進行連接，形成MPH-L-A1E的融合基因，并克隆到具有Stu I/HindIII內(nèi)切酶切口的pASK75載體上(SnaB I和Stu I均為平端酶，二者所切出的切口可以連接)得到連接產(chǎn)物pASK75-MPH-L-A1E(該重組質(zhì)粒圖譜如圖1所示)。
5、將上述連接產(chǎn)物pASK75-MPH-L-A1E電轉(zhuǎn)移到大腸桿菌SM547中。
6、將具有融合蛋白基因載體的大腸桿菌在LB broth培養(yǎng)液中，37℃下生長至對數(shù)期，然后用200μg/ml的四環(huán)素在28℃中誘導(dǎo)表達16小時。通過6000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘收集細菌，用French滲透休克方法制備融和蛋白的周質(zhì)空間提取物。
7、將融和蛋白的周質(zhì)空間提取物用RPAS Purification Module(Pharmacia公司)進行純化，得到單鏈抗體A1-甲基對硫磷水解酶融合蛋白。
用單鏈抗體A1-甲基對硫磷水解酶融合蛋白檢測對蝦白斑綜合癥病毒的方法為用2倍PBS稀釋剃度6.25～100納克蛋白量的對蝦白斑綜合癥病毒包被96孔酶標板，4℃過夜，然后用4％脫脂牛奶/PBS封閉，37℃2小時。用PBS和PBST溶液各洗3次后，每孔加入100μl的單鏈抗體A1-甲基對硫磷水解酶融合蛋白，在37℃保溫1.5小時。用PBS和PBST溶液各洗3次后，每孔加入100μl含有0.25mM底物O，O-Dimethyl-O-(4-Nitrophenylmethyl)phosphorothioate(pH9.0)的溶液，在室溫下反應(yīng)60分鐘。通過在405nm波段的光吸收值，按照陽性樣品吸收值為陰性對照吸收值的2倍，來確定單鏈抗體A1-甲基對硫磷水解酶融合蛋白所能檢測出的最小病毒量(結(jié)果如圖2所示)。
權(quán)利要求
1.一種單鏈抗體A1-甲基對硫磷水解酶融合蛋白，其特征在于，該融合蛋白的DNA序列為ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGGTACAGCCGCACCGCAGGTGCGCACCTCGGCCCCCGGCTACTACCGGATGCTGCTGGGCGACTTCGAAATCACCGCGCTGTCGGACGGCACGGTGGCGCTGCCGGTCGACAAGCGGCTGAACCAGCCGGCCCCGAAGACGCAGAGCGCGCTGGCCAAGTCCTTCCAGAAAGCGCCGCTCGAAACCTCGGTCACCGGTTACCTCGTCAACACCGGCTCCAAGCTGGTGCTGGTGGACACCGGCGCGGCCGGCCTGTTCGGCCCCACCCTGGGCCGGCTGGCGGCCAACCTCAAGGCCGCAGGCTATCAGCCCGAGCAGGTCGACGAGATCTACATCACCCACATGCACCCCGACCACGTGGGCGGCTTGATGGTGGGTGAGCAACTGGCGTTCCCGAACGCGGTGGTGCGTGCGGACCAGAAAGAAGCCGATTTCTGGCTCAGCCAGACCAACCTCGACAAGGCCCCGGACGACGAGAGCAAAGGCTTCTTCAAAGGCGCCATGGCCTCGCTGAACCCCTATGTGAAGGCCGGCAAGTTCAAGCCTTTCTCGGGGAACACCGACCTGGTGCCCGGCATCAAAGCGCTGGCCAGCCACGGCCACACCCCGGGCCACACCACCTACGTGGTCGAAAGCCAGGGGCAAAAGCTCGCCCTGCTCGGCGACCTGATACTCGTCGCCGCGGTGCAGTTCGACGACCCCAGCGTCACGACCCAGCTCGACAGCGACAGCAAGTCCGTCGCGGTGGAGCGCAAGAAGGCCTTCGCGGATGCCGCCAAGGGCGGCTACCTGATCGCGGCGTCCCACCTGTCGTTCCCCGGCATCGGCCACATCCGCGCCGAAGGCAAGGGCTACCGTTTCGTGCCGGTGAACTACTCGGTCGTCAACCCCAAGTCTAGAAGCGGCTCTGGTTCCGGTAGCGGTTCCGGCACTAGTATGGCCGAGGTGAAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGCGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAAGTTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTATATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAATGGATTGGATGGATTTATCCTGACAATGGTAATACTATATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCAGAATAACAGCAGATACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGTTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGTGGTGGTAACCCCTGGTACTGGGGTCAAGGCACCACTCTCTCCGTGTCGACAGGTGGAGGCGGCTCTGGTGGCGGTGGCAGTGGCGGCGGAGGTTCTGACGTCGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCGATCTCCTAAAACACTGATTTACTCGGCATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGTCAGCAATATAGCAGCTATCCTCTCACATTCGGTGGTGGGACCAAGTTGGAAATCAAGCGCGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATAG
2.實現(xiàn)權(quán)利要求1所述的單鏈抗體A1-甲基對硫磷水解酶融合蛋白，其特征在于，該融合蛋白的制備方法按下列步驟進行a、用帶有Spe I內(nèi)切酶位點的上游引物5’-CCCCGACTAGTATGGCCGAGGTGAAGCT-3’和帶有HindIII內(nèi)切酶位點的下游引物5’-CACCAAGCTTTTAGCGCTTGATTTCCAAC-3’，通過PCR，將單鏈抗體A1的基因從噬菌粒載體pCANTAB5E-A1E中擴增下來，PCR的條件為94℃5分鐘；94℃45秒，44℃1分鐘，72℃2分鐘，5個循環(huán)；94℃45秒，62℃1分鐘，72℃2分鐘，25個循環(huán)；72℃7分鐘；4℃10分鐘；將PCR擴增的片段首先克隆到pGEM-T載體上，通過PCR和內(nèi)切酶分析，挑選出連接有A1基因的克隆子。將連接的A1基因用Spe I和HindIII內(nèi)切酶酶切下來，酶切條件為Spe I和HindIII雙酶切37℃4小時，然后用Gel Extraction Kit進行純化和回收；b、用帶有SnaB I內(nèi)切酶位點的上游引物5’-TATTACGTACAGCCGCACCGCAGGT-3’，和帶有Xba I內(nèi)切酶位點的下游引物5’-TGGGCTCTAGACTTGGGGTTGACGA-3’，通過PCR，將甲基對硫磷水解酶基因從原由載體pET5a-MPH中擴增下來；PCR的條件是94℃5分鐘，94℃45秒，44℃1分鐘，72℃2分鐘，5個循環(huán)；94℃45秒，62℃1分鐘，72℃2分鐘，25個循環(huán)；72℃7分鐘；4℃10分鐘；將PCR擴增的片段首先克隆到pGEM-T載體上，通過PCR和內(nèi)切酶分析，挑選出連接有MPH基因的克隆子；將連接的MPH基因用SnaB I和Xba I內(nèi)切酶酶切下來，酶切條件為首先用SnaB I 37℃酶切2小時，將酶切產(chǎn)物用PCR回收試劑盒純化回收；Xba I 37℃酶切純化產(chǎn)物2小時，然后用Gel Extraction Kit進行純化和回收；c、將人工合成的、N端具有Xba I內(nèi)切酶切口和C端具有Spe I內(nèi)切酶切口序列的、編碼[-(Gly-Ser)5-]小肽的寡核苷酸片段互補鏈，在65℃中保溫5分鐘退火使其形成互補的雙鏈DNA小片段5’-CTAGAAGCGGCTCTGGTTCCGGTAGCGGTTCCGGCA-3’3’-TTCGCCGAGACCAAGGCCATCGCCAAGGCCGTGATC-5’；d、將上述DNA小片段作為連接物與上述已用相應(yīng)的內(nèi)切酶進行酶切后的A1E基因片段和MPH基因片段進行連接，形成MPH-L-A1E的融合基因，并克隆到具有Stu I/HindIII內(nèi)切酶切口的pASK75載體上，得到連接產(chǎn)物pASK75-MPH-L-A1E；e、將上述連接產(chǎn)物pASK75-MPH-L-A1E電轉(zhuǎn)移到大腸桿菌SM547中；f、將具有融合蛋白基因載體的大腸桿菌在LB broth培養(yǎng)液中，37℃下生長至對數(shù)期，然后用200μg/ml的四環(huán)素在28℃中誘導(dǎo)表達16小時。通過6000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘收集細菌，用French滲透休克方法制備融和蛋白的周質(zhì)空間提取物；g、將融和蛋白的周質(zhì)空間提取物用RPAS Purification Module進行純化，得到單鏈抗體A1-甲基對硫磷水解酶融合蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種識別對蝦白斑桿狀病毒單鏈抗體Al－甲基對硫磷水解酶融合蛋白及其制備方法，涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖生物病毒抗體。單鏈抗體基因與甲基對硫磷水解酶基因通過與一編碼[－(Gly－Ser)
文檔編號C12N15/09GK1800402SQ20051002001
公開日2006年7月12日 申請日期2005年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月16日
發(fā)明者戴和平, 張先恩, 周亞鳳, 楊薇, 張曉華, 戴玲芬, 張治平 申請人:中國科學(xué)院水生生物研究所, 中國科學(xué)院武漢病毒研究所