專利名稱：一種編碼植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號(hào)因子的基因hrpN的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物基因工程領(lǐng)域，特別是涉及一種胡蘿卜軟腐歐氏桿菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)白菜軟腐菌變種CSDS001菌株hrpNEccs基因以及此基因通過(guò)生物技術(shù)方法提高植物多功能活性和廣譜抗性并改良植物品質(zhì)的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物在長(zhǎng)期的自然選擇和進(jìn)化過(guò)程中，逐漸形成了響應(yīng)各種環(huán)境脅迫影響的遺傳因子。植物病原物就是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要環(huán)境因子之一。研究表明，植物與病原物之間的相互作用受雙方基因型的組合調(diào)控。通常，在寄主植物抗病-感病等位基因與病原物無(wú)毒-毒性基因的相互作用中，寄主植物抗病基因和病原物無(wú)毒基因均表現(xiàn)為顯性。在自然界中，植物抗病表型是普遍的，而感病表型僅在特定情況下發(fā)生。一種病原物所能侵染并定殖的植物總是少數(shù)，多數(shù)植物對(duì)該病原物是非寄主性的，并對(duì)其侵染表現(xiàn)出抗性。
現(xiàn)代分子植物病理學(xué)揭示，植物病原細(xì)菌既有其致病性，也有誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性和促進(jìn)生長(zhǎng)的能力，而決定這種能力的基因是植物病原細(xì)菌的hrp(hypersensitive response and pathogenicity)基因簇。hrp基因決定著植物病原細(xì)菌在非寄主植物上激發(fā)過(guò)敏反應(yīng)(hypersensitive response onnon-host plants，HR)的能力和在寄主植物上的基本寄生性或致病性(parasitism or pathogenicity on host plants)。HR是植物一種局部的、快速的細(xì)胞編程死亡形式，是植物主動(dòng)抗性的結(jié)果，其抗性作用不僅表現(xiàn)在對(duì)病原細(xì)菌侵染擴(kuò)展的限制，而且能進(jìn)一步誘導(dǎo)植物體內(nèi)產(chǎn)生類(lèi)似免疫機(jī)制的系統(tǒng)獲得性抗性反應(yīng)。
20世紀(jì)90年代初，韋忠民等(Wei et al.1992)首先從E.amylovora的e.coliDH5α表達(dá)克隆中分離純化出一種由hrpNEa基因編碼的、能激發(fā)煙草過(guò)敏反應(yīng)的蛋白，定名為HarpinEa(44kda)。以后有人又相繼從E.carotovora subspcarotovora、E.chrysanthemi、P.s.syringae、P.s.pv.glycinea、、P.s.tomato、R.solanacearum中克隆到編碼Harpin類(lèi)蛋白的基因，并成功表達(dá)了這些蛋白，如HarpinEcc，36kda，Mukherjee A.1997；HarpinEch，36kda，Bauer D.W.1995；Harpinpss，34.7kda，Preston G.1995；HarpinPsg，35.3kda，Preston G.1995；HarpinPst，36.5kda，Preston G.1995；HarpinXoo，15.3kda，聞偉剛2001；HarpinXooc，15.6kda，聞偉剛2001等。
迄今為止，所有這些Harpin類(lèi)蛋白差不多都具有以下分子特征(1)親水性；(2)對(duì)熱穩(wěn)定，100℃處理10分鐘不會(huì)失活；(3)對(duì)蛋白酶K和紫外線敏感；(4)富含甘氨酸而缺少半胱氨酸；(5)水溶性酸性蛋白；(6)無(wú)四級(jí)結(jié)構(gòu)。
最近的研究表明，Harpin類(lèi)蛋白可能在植物的信號(hào)通路中起著重要作用。研究人員用Harpin處理擬南芥，發(fā)現(xiàn)擬南芥中Cl、Ca、K、H、Cu、Zn離子通道以及各種氧化酶被激活，這些氧化酶包括ACC合成酶、抗壞血酸氧化酶、Cu/Zn超氧化物歧化酶、Cu分子伴侶前體等等。現(xiàn)在通常認(rèn)為，植物細(xì)胞壁中廣泛存在Harpin蛋白的受體，即Harpin結(jié)合蛋白(Harpin-binding proteins，HrBP)，Harpin可以通過(guò)與這些受體蛋白HrBP結(jié)合激活植物中的多條信號(hào)通路。這些信號(hào)通路大致可以分為以下三類(lèi)(1)與植物抗病和驅(qū)蟲(chóng)相關(guān)的信號(hào)通路的激活，包括過(guò)敏反應(yīng)與細(xì)胞死亡、離子交換通道、水楊酸途徑、茉莉酸途徑、苯丙氨酸解氨酶介導(dǎo)的途徑以及其它一些抗性基因介導(dǎo)的途徑；(2)與促進(jìn)植物生長(zhǎng)相關(guān)的信號(hào)通路的激活，包括一般的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子、胚軸延伸轉(zhuǎn)錄因子、生長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄因子、乙烯反應(yīng)元件結(jié)合蛋白系以及蔗糖合成酶和其他胚胎形成酶等；(3)與植物抗逆相關(guān)的信號(hào)通路的激活，包括熱休克蛋白、COR基因和耐鹽鋅蛋白等。另外可能還存在一條比較特殊的不依賴于NPRl介導(dǎo)的植物對(duì)細(xì)菌抗性的信號(hào)通路。
最近的研究表明，Harpin類(lèi)蛋白可能在植物的信號(hào)通路中起著重要作用。研究人員用Harpin處理擬南芥，發(fā)現(xiàn)擬南芥中Cl、Ca、K、H、Cu、Zn離子通道以及各種氧化酶被激活，這些氧化酶包括ACC合成酶、抗壞血酸氧化酶、Cu/Zn超氧化物歧化酶、Cu分子伴侶前體等等。現(xiàn)在通常認(rèn)為，植物細(xì)胞壁中廣泛存在Harpin蛋白的受體，即Harpin結(jié)合蛋白(Harpin-binding proteins，HrBP)，Harpin可以通過(guò)與這些受體蛋白HrBP結(jié)合激活植物中的多條信號(hào)通路。這些信號(hào)通路大致可以分為以下三類(lèi)(1)與植物抗病和驅(qū)蟲(chóng)相關(guān)的信號(hào)通路的激活，包括過(guò)敏反應(yīng)與細(xì)胞死亡、離子交換通道、水楊酸途徑、茉莉酸途徑、苯丙氨酸解氨酶介導(dǎo)的途徑以及其它一些抗性基因介導(dǎo)的途徑；(2)與促進(jìn)植物生長(zhǎng)相關(guān)的信號(hào)通路的激活，包括一般的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子、胚軸延伸轉(zhuǎn)錄因子、生長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄因子、乙烯反應(yīng)元件結(jié)合蛋白系以及蔗糖合成酶和其他胚胎形成酶等；(3)與植物抗逆相關(guān)的信號(hào)通路的激活，包括熱休克蛋白、COR基因和耐鹽鋅蛋白等。另外可能還存在一條比較特殊的不依賴于NPR1介導(dǎo)的植物對(duì)細(xì)菌抗性的信號(hào)通路。更有趣的是，HarpinEa來(lái)自梨火疫病的病原菌E.amylovora，然而在轉(zhuǎn)hrpNEa基因的梨上，HarpinEa也表現(xiàn)出非常強(qiáng)的抗病性，包括梨火疫病本身。
Harpin蛋白雖然來(lái)源于病原菌，但作為一類(lèi)非特異性的激發(fā)蛋白因子，卻能引起非寄主植物發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)，并誘導(dǎo)其抗病性、驅(qū)蟲(chóng)性和抗逆性的增加，以及促進(jìn)生長(zhǎng)、提高產(chǎn)量等。

發(fā)明內(nèi)容
一種編碼植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號(hào)因子的基因hrpNEccs及其表達(dá)產(chǎn)物HarpinEccs蛋白質(zhì)，基因來(lái)自胡蘿卜軟腐歐氏桿菌(Erwinia carotovorasubsp.carotovora)白菜軟腐菌變種CSDS001菌株，該基因表達(dá)產(chǎn)物HarpinEccs蛋白具有多種功能活性，能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性、驅(qū)蟲(chóng)性和抗逆性，并促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育和提高產(chǎn)量；hrpNEccs基因的核甘酸序列特征(5′→3′)為1 atgcttaatt ctcttggtgg cggagcttct ctgcaaatca cgatcaaagc gggtggtaac61 ggcggtttat ttccatctca gtcttcacaa aatggcggat cgccatcgca gtcggcgttt121 ggtggccagc gtagcaacat cgcagaacag ctgtccgata tcatgacgac tatgatgttt181 atgggcagca tgatgggcgg cggcatgggc ggtgggctcg gtggtttagg cagtagcctg241 ggcggactcg gtggtggttt gctgggtggt ggcttgggtg gcggtctcgg cagtagcctt301 ggtagtggac tgggcagtgc gctcggcggc ggattaagcg gggtgctggg tgctggcatg361 aatgccatga atccatcggc catgatgggt agcctgctgt ttagcgcgct ggaagatctg421 ctgggcggtg gcatgtcgca gcagcagggt gggcttttcg gcaacaaaca gccgtcgtcg481 ccggaaattt ctgcctatac ccaaggcgtt aacgatgcgc tgtccgcaat tctgggcaac541 ggcctgagcc agacgaaagg gcaaacgtca ccgttgcaac tgggtaataa cggtctgcaa601 ggcttgagcg gtgcgggtgc gtttaatcaa ctgggtagca cgctggggat gagcgttggg661 caaaaagccg gtttgcagga gttgaacaac atcagcacgc acaatgatag cccgacgcgt721 tacttcgtgg ataaagaaga tcgggcgatg gcgaaagaaa ttggtcagtt tatggatcaa781 tatcctgaag tcttcggcaa ggcagaatac cagaaagata actggcagac ggcgaaacag841 gaggataaat cctgggctaa agcgctgagc aagccggatg acgacggcat gactaagggc901 agcatggata aattcatgaa ggcggtcggc atgatcaaga gtgcgatagc gggtgatact961 ggcaacacta acctgagcgc tcgtggcaac ggcggcgcat ctctgggcat tgatgcagcg
1021 atgatcggcg accgtatcgt caatatgggg ttgcagaagc tctccagcta ahrpNEccs基因(基因注冊(cè)號(hào)bankit698770 AY939927)具有以下屬性(1)編碼區(qū)共計(jì)有1071個(gè)核甘酸；(2)富含甘氨酸密碼子，缺少半胱氨酸密碼子；(3)與來(lái)自胡蘿卜軟腐歐氏桿菌褐腐致病菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)Ecc71和Eccl菌株的hrpNEcc基因分別享有93％和92％的同源性；(4)與來(lái)自胡蘿卜軟腐歐氏桿菌黑腐致病菌(Erwinia carotovora subsp.atrosepitica)SCR11043和SCR11039菌株的hrpNEcc基因分別享有89％和88％的同源性。hrpNEccs基因可作為基因資源，用于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)育種、轉(zhuǎn)基因植物和防治病蟲(chóng)害、調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育以及與其它有益基因包括hrpNEcc、hrpNEa、hrpNEch等重組構(gòu)建具有商業(yè)價(jià)值或潛在商業(yè)價(jià)值的遺傳重組體。
本發(fā)明的編碼植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號(hào)因子的hrpEccs基因來(lái)自胡蘿卜軟腐歐氏桿菌(E.carotovora subsp carotovora)白菜軟腐菌變種CSDS001菌株。其表達(dá)產(chǎn)物HarpinEccs蛋白(35.58kda)已證明也具有上述Harpin類(lèi)蛋白的分子屬性和生物活性。由于這類(lèi)Harpin蛋白在增強(qiáng)植物抗病、驅(qū)蟲(chóng)、抗逆以及促進(jìn)生長(zhǎng)和提高產(chǎn)量方面的良好表現(xiàn)，加之其對(duì)人、畜無(wú)毒性，不引起病蟲(chóng)害的抗藥性，不誘發(fā)植物遺傳結(jié)構(gòu)(基因組DNA)的改變，在環(huán)境中容易很快分解、沒(méi)有任何殘留的無(wú)公害性，可望成為未來(lái)逐步替代高毒、高殘留化學(xué)農(nóng)藥和有公害的化學(xué)調(diào)節(jié)劑的優(yōu)良環(huán)保型生物產(chǎn)品的首選。目前正在就其對(duì)各種作物、蔬菜、水果、花卉以及各種經(jīng)濟(jì)植物包括煙草、茶葉等數(shù)十種植物的抗病驅(qū)蟲(chóng)和促長(zhǎng)增產(chǎn)效果進(jìn)行廣泛的試驗(yàn)和品比。已有試驗(yàn)結(jié)果顯示，HarpinEccs蛋白對(duì)黃瓜、西紅柿、土豆、辣椒、煙草、玉米、草莓等的抗病驅(qū)蟲(chóng)和促長(zhǎng)增產(chǎn)效果明顯，同時(shí)對(duì)提高某些植物如煙草、茶葉的品質(zhì)亦有很好的效果，而且在同類(lèi)Harpin產(chǎn)品中對(duì)比效果也很顯著；如果對(duì)HarpinEccs蛋白進(jìn)行特殊的絡(luò)合處理(專利申請(qǐng)編號(hào)031350518)，其作用效果會(huì)更明顯，持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，更穩(wěn)定，作用譜更廣。
本發(fā)明關(guān)于一種編碼植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號(hào)因子的基因hrpNEccs及其表達(dá)產(chǎn)物HarpinEccs蛋白質(zhì)的系列特征，將按以下內(nèi)容進(jìn)行具體表述1、軟腐細(xì)菌的分離該細(xì)菌在分類(lèi)上屬于胡蘿卜軟腐歐氏桿菌(Erwiniacarotovora subsp carotovora)白菜(Chinese cabbage)軟腐菌(soft-rottingbacteria)變種，胡蘿卜、白菜、芹菜都是其寄主植物。白菜軟腐病多在白菜蓮座末期開(kāi)始發(fā)病。病株首先在短縮莖(俗稱“葫蘆”)處出現(xiàn)水浸狀微黃色病斑，開(kāi)始外觀癥狀不明顯，但隨病情發(fā)展，白天植株外部葉片開(kāi)始萎焉下垂，日落后可以恢復(fù)正常，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)，葉球基部“葫蘆”腐爛，呈褐色，散發(fā)出惡臭氣味，葉球脫落。病菌有時(shí)也能從葉柄基部或葉球頂部傷口侵入，引起單個(gè)葉片或葉球自上而下腐爛。白菜帶菌儲(chǔ)藏期間，病情仍可發(fā)展，引起腐爛。
本菌株采自四川什邡國(guó)家無(wú)公害蔬菜生產(chǎn)基地。取1克被軟腐菌(soft-rotting bacteria)嚴(yán)重感染的白菜(Chinese cabbage)組織置于1毫升磷酸緩沖液中，28℃溫育10分鐘；然后將懸液鋪在LB平板上，28℃溫育24小時(shí)；將單克隆菌落在無(wú)機(jī)平板上分別進(jìn)行4種胞外酶的活性檢測(cè)，這4種胞外酶分別是果膠酶(pectate lyase)、多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase)、蛋白酶(protease)和纖維素酶(cellulase)；選擇2個(gè)具有明顯胞外酶活性的單克隆菌落，分別接種進(jìn)未感染細(xì)菌的新鮮白菜和芹菜組織中，28℃溫育24小時(shí)。結(jié)果表明，所選擇的2個(gè)單克隆菌落都能引起白菜和芹菜組織軟腐和崩解。進(jìn)一步檢測(cè)表明，這2個(gè)單克隆菌落及其培養(yǎng)液能引起被注射接種的煙草葉片發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)。另外，所獲得的白菜軟腐病菌變種的菌落生長(zhǎng)迅速、光滑，色澤淡白到乳黃。顯微鏡鏡檢表明菌體呈短桿狀，兩端鈍圓；大小1.0-2.0×0.5-0.7μm；單生或雙生，少數(shù)串生；周?chē)斜廾?-5根；不產(chǎn)生芽孢和莢膜；革蘭氏染色陰性；兼性嫌氣性。
按上述程序分離的白菜軟腐細(xì)菌在分類(lèi)上屬于胡蘿卜軟腐歐氏桿菌(Erwinia carotovora subsp carotovora)是基于以下事實(shí)(1)該細(xì)菌適于生長(zhǎng)的溫度是25℃-34℃，而不是37℃；(2)該細(xì)菌大量分泌胞外酶的溫度是28℃，而不是34℃；(3)該細(xì)菌只有生長(zhǎng)在無(wú)機(jī)培養(yǎng)基上才大量產(chǎn)生胞外酶，而在像LB那樣的富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上則不產(chǎn)生；(4)該細(xì)菌引起白菜和芹菜大量軟腐或崩解的溫度是28℃，而不是34℃；(5)該細(xì)菌能激發(fā)煙草葉片發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)。所有這些都與已報(bào)道的胡蘿卜軟腐歐氏桿菌(Erwinia carotovora subspcarotovora)的資料相吻合。后來(lái)的事實(shí)進(jìn)一步證明，從白菜軟腐細(xì)菌中克隆的hrpNEccs基因與來(lái)自胡蘿卜軟腐歐氏桿菌(Erwinia carotovora subspcarotovora)的hrpNEcc基因具有90％以上的同源性，而其表達(dá)產(chǎn)物harpinEccs蛋白與來(lái)自胡蘿卜軟腐歐氏桿菌(Erwinia carotovora subsp carotovora)的harpinEcc蛋白也只有6個(gè)氨基酸的差別，同源性達(dá)98％以上。
鑒于所分離的細(xì)菌菌株的來(lái)源不同，包括寄主植物不同和地區(qū)差異性，以及hrpN基因和Harpin蛋白質(zhì)的同源性、遺傳多樣性和差異性，我們將所分離的白菜軟腐菌菌株定名為“Erwinia carotovora subsp.carotovora strain CSDS001”，而將從該菌株中克隆出的hrpN基因及其編碼產(chǎn)物Harpin蛋白分別定名為“hrpNEccs基因”和“HarpinEccs蛋白”。
2、hrpNEccs基因的克隆(1)根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的胡蘿卜軟腐歐氏桿菌(Erwiniacarotovora subsp carotoyora)的hrpNEcc基因的核甘酸序列設(shè)計(jì)2個(gè)PCR引物分子，hrpN 15′-GCCGTATGCTTAATTCTCTTGGTGGCG-3′；hrpN 25′-GCAAGCTTCCGTTTAGCTGGAGAGCTTCT-3′。(2)用分離的白菜軟腐細(xì)菌的染色體DNA作模板DNA，按如下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增94℃/2min1個(gè)循環(huán)；94℃/15sec+55℃/30sec+72℃/15sec24個(gè)循環(huán)；94℃/1min+55℃/2min+72℃/3min1個(gè)循環(huán)。(3)PCR產(chǎn)物經(jīng)限制酶Nde I和HindIII消化后，克隆進(jìn)高表達(dá)載體pET28a(+)的NdeI-HindIII位點(diǎn)。(4)將克隆到的帶有hrpNEccs基因的pET28a(+)質(zhì)粒轉(zhuǎn)進(jìn)大腸桿菌工程菌E.coli JM109(DE3)的菌株中。
3、hrpNEccs基因的核甘酸序列編碼區(qū)共計(jì)1071個(gè)核甘酸，其序列如SEQID.No1。
hrpNEccs基因具有以下屬性(1)富含甘氨酸密碼子，缺少半胱氨酸密碼子；(2)與來(lái)自胡蘿卜軟腐歐氏桿菌褐腐致病菌(Erwinia carotovora subsp.carotoyora)Ecc71和Ecc1菌株的hrpNEcc基因分別享有93％和92％的同源性；(3)與來(lái)自胡蘿卜軟腐歐氏桿菌黑腐致病菌(Erwinia carotovora subsp.atrosepitica)SCR11043和SCR11039菌株的hrpNEcc基因分別享有89％和88％的同源性。
4、HarpinEccs蛋白的高效表達(dá)將攜帶有hrpNEccs質(zhì)粒的E.coli JM109(DE3)在加有50ml/L Km的LB液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)生長(zhǎng)，待OD600達(dá)到0.7(即細(xì)菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)后，再加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度1mM，繼續(xù)培養(yǎng)6個(gè)小時(shí)后，離心(5,000rpm，10min)收集細(xì)菌細(xì)胞。細(xì)菌細(xì)胞經(jīng)超聲波破碎、離心、12％SDS-PAGE凝膠電泳，在電泳膠板的細(xì)菌樣品泳道上，會(huì)呈現(xiàn)一條顯著寬而濃的35.58kda條帶，它就是hrpNEccs基因的表達(dá)產(chǎn)物HarpinEccs蛋白，約占細(xì)菌蛋白總量的60％以上。進(jìn)一步將HarpinEccs蛋白分離純化，可用作HarpinEccs蛋白的Western blot分析和HR檢測(cè)。
5、HarpinEccs蛋白的氨基酸序列 由N→C端共計(jì)356個(gè)氨基酸殘基，其序列如SEQ ID.No2。
HarpinEccs蛋白具有以下屬性(1)356個(gè)氨基酸序列中各氨基酸組成分別為Met22、Asn20、Gly75、Leu40、Ser41、Ala28、Gln24、Ile13、Lys17、Thr13、Asp16、Phe10、Va17、Arg5、Glu9、Trp2、Tyr4、His1、Pro9；(2)分子量35.58kda；(3)等電點(diǎn)pI5.26；(4)與來(lái)自胡蘿卜軟腐歐氏桿菌(Erwinia carotovorasubsp carotovora)褐腐致病變種的HarpinEcc蛋白相比，分子中有6個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了氨基酸替換(序列中的紅色位點(diǎn))，分別為Ser70→Gly70、Gly113→Ser113、Ala115→Val115、Gly249→Ala249、Arg317→Ala317、Lys352→Gln352；(5)富含甘氨酸Gly和較多的疏水性氨基酸亮氨酸Leu，分別占氨基酸數(shù)目總量的21％和11％，尤其是在第1、2個(gè)突變氨基酸G70和S113之間，其豐度分別高達(dá)56％和28％；(6)缺乏半胱氨酸Cys；(7)對(duì)溫度特穩(wěn)定，在100℃沸水中耐受10-15分鐘仍有活性；(8)沒(méi)有四級(jí)結(jié)構(gòu)。
6、HarpinEccs蛋白的生物學(xué)活性及其應(yīng)用 目前公認(rèn)的Harpin類(lèi)蛋白的生物活性檢測(cè)方法主要有(1)過(guò)敏反應(yīng)(hypersensitive response，HR)，通常以煙草作被試植物，這也是Harpin類(lèi)蛋白生物活性檢測(cè)最快速、簡(jiǎn)便的方法；(2)血清學(xué)反應(yīng)，即用標(biāo)準(zhǔn)的Harpin蛋白純品制成血清抗體，然后用這種抗血清對(duì)未知樣品進(jìn)行Western blot分析，通過(guò)抗體-抗原識(shí)別反應(yīng)，可以準(zhǔn)確檢測(cè)出未知樣品中的Harpin類(lèi)蛋白。
HarpinEccs蛋白具有以下主要生物學(xué)功能(1)促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育、提高產(chǎn)量；(2)增強(qiáng)植物的廣譜抗病性，包括對(duì)多種細(xì)菌、真菌和病毒的抗性；(3)使植物獲得對(duì)某些有害昆蟲(chóng)的驅(qū)蟲(chóng)性；(4)增強(qiáng)植物的抗逆性；(5)延長(zhǎng)植物產(chǎn)品的儲(chǔ)存時(shí)間；(6)對(duì)盆花、苗木還有良好的塑型作用。
HarpinEccs蛋白可直接應(yīng)用于植物的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)和病蟲(chóng)害防治，包括糧食作物、經(jīng)濟(jì)植物、蔬菜、水果、花卉以及園林和草場(chǎng)的養(yǎng)護(hù)等；使用方法有浸種、拌種、蘸根、種子包衣、植株注射、葉面噴施、花果噴涂等；使用劑量因使用方法和品種而異，一般5μg/ml-80μg/ml均為有效濃度；施用后2-12小時(shí)內(nèi)即發(fā)生作用，藥效可持續(xù)20天左右，一個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)可用藥2-3次；本產(chǎn)品屬天然有機(jī)蛋白，對(duì)人、畜無(wú)毒性，不引起病蟲(chóng)害的抗藥性，不誘發(fā)植物遺傳結(jié)構(gòu)(基因組DNA)的改變，在自然界能很快被光分解或被微生物降解，對(duì)環(huán)境不會(huì)造成殘留或積累污染，在使用過(guò)程中也無(wú)須特殊防護(hù)措施，是未來(lái)替代高毒、高殘留化學(xué)農(nóng)藥和有公害的化學(xué)調(diào)節(jié)劑的理想的環(huán)保型生物產(chǎn)品。
本發(fā)明對(duì)HarpinEccs蛋白的功能及應(yīng)用正在嘗試作進(jìn)一步的擴(kuò)展。鑒于Harpin類(lèi)蛋白對(duì)寄主植物作用的限制，我們已將下列不同來(lái)源的Harpin蛋白的基因進(jìn)行融合(1)hrpNEccs基因+hrpNEcc基因；(2)hrpNEccs基因+hrpNEa基因；(3)hrpNEccs基因+hrpNEch基因；(4)hrpNEcc基因+hrpNEa基因；(5)hrpNEcc基因+hrpNEch基因；(6)hrpNEa基因+hrpNEch基因。目前正在進(jìn)行融合蛋白的表達(dá)、活性檢測(cè)、效果試驗(yàn)及效價(jià)評(píng)估，以期獲得功能互補(bǔ)、應(yīng)用范圍更廣、活性更強(qiáng)的Harpin融合蛋白。另外，將HarpinEccs蛋白在特定條件下與某些特殊金屬離子進(jìn)行絡(luò)合其過(guò)敏反應(yīng)強(qiáng)度及抗病增產(chǎn)效果較未經(jīng)絡(luò)合處理的HarpinEccs蛋白明顯增強(qiáng)。這種處理效果對(duì)其它Harpin類(lèi)蛋白也是一樣。
本發(fā)明中所使用的工程菌E.coli JM109(DE3)菌株及hrpNEccs基因的高效表達(dá)載體pET28a(+)質(zhì)粒在國(guó)內(nèi)外分子生物學(xué)研究及醫(yī)藥工業(yè)中已廣泛應(yīng)用，對(duì)環(huán)境是安全可靠的。
本發(fā)明中使用的縮略語(yǔ)LB(細(xì)菌培養(yǎng)基，酵母粉5g/L+蛋白胨10g/L+NaCl10g/L，pH7.0)；Km(卡那霉素)；IPTG(異丙基硫代-β-半乳糖苷)；PMSF(苯甲基磺酰氟)；Tris(三羥甲基氨基甲烷)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1菌種制備及大規(guī)模發(fā)酵(1)制備原種將帶有hrpNEccs基因高效表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)的工程菌E.coli JM109(DE3)菌株于甘油-LB+Km20μg/ml的斜面上劃線，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。(2)制備母種將原種斜面上生長(zhǎng)良好的單克隆菌落接種于加有100ml甘油-LB+Km20μg/ml的250ml搖瓶中，于37℃110rpm振蕩培養(yǎng)12h。(3)制備生產(chǎn)種將母種菌液按1％體積比接種于加有3L甘油-LB+Km25μg/ml的5L發(fā)酵罐中，37℃110rpm和0.5L/min通氣量條件下培養(yǎng)12h。(4)大規(guī)模發(fā)酵將50L以上的發(fā)酵罐加入70％體積的甘油-LB及終濃度40μg/ml的Km后，原位滅菌30min(120℃，1.1MPa)；然后按1％體積比接入生產(chǎn)種子菌，37℃200rpm和1L/min通氣量條件下發(fā)酵培養(yǎng)；待細(xì)菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600＝0.7)后，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和通氣量，以保證發(fā)酵環(huán)境有充足的供氧(DO＞30％)，并按特定程序進(jìn)行對(duì)數(shù)分期補(bǔ)料；在細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)束前1-2小時(shí)，通過(guò)微孔濾膜加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度1mM；繼續(xù)誘導(dǎo)發(fā)酵4-6小時(shí)，即可下罐。此法可實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的高密化培養(yǎng)。
實(shí)施例2 HarpinEccs蛋白的制備和純化HarpinEccs蛋白在大腸桿菌細(xì)胞中主要以包涵體(inclusion body)形式存在。工業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)HarpinEccs蛋白時(shí)，采用8M尿素破碎制備。實(shí)驗(yàn)室中為了得到更進(jìn)一步的HarpinEccs蛋白純品，可按下列程序操作離心(5,000rpm，10min)收集經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4-6小時(shí)的大腸桿菌細(xì)胞，以20mMTris緩沖液(pH9.0)充分懸浮后，加10μl/25ml的溶菌酶(100mg/ml)，冰浴10min，加0.5ml/25mlPMSF(20mg/ml)，超聲波(20KHz)破碎10min，再加0.5ml/25ml的PMSF，混勻后再超聲波破碎10min，10,000rpm離心10min，取上清液于100℃水浴10min，冷卻后12,000rpm離心10min，收集上清液。此上清液中即含有較高純度的HarpinEccs蛋白，濃度達(dá)3600μg/ml，可用來(lái)作生物活性檢測(cè)或進(jìn)一步濃縮成更高純度的晶體蛋白。
實(shí)施例3 HarpinEccs蛋白的使用方法HarpinEccs蛋白在使用上方法多樣，可因處理材料、處理部位、處理時(shí)間以及處理目的不同而有所差異。具體可按以下介紹的方法使用(1)浸種首先用水將HarpinEccs蛋白配成30-60μg/ml的濃度，然后將種子浸于其中8-12小時(shí)。此法適宜作催芽的作物或蔬菜種子。浸種結(jié)束后，將種子從HarpinEccs蛋白浸種液中取出，即可催芽或播種。出苗一周后，苗高比對(duì)照增長(zhǎng)10％以上，生長(zhǎng)量也提高10％以上，而且苗期抗猝倒病的能力也明顯增強(qiáng)。
(2)拌種將種子稍加濕潤(rùn)，加入種子量0.1％的HarpinEccs蛋白制劑，充分拌勻后播種。出苗后苗齊苗壯，增強(qiáng)苗期抗猝倒病的能力。
(3)蘸根適于移栽定殖的作物，如瓜果、蔬菜、棉花、玉米等。首先將HarpinEccs蛋白制劑配成30μg/ml的水溶液，然后將被移栽作物幼苗的根浸在該溶液中1-2小時(shí)。移栽后，植株恢復(fù)生長(zhǎng)快，緩苗時(shí)間縮短，植株長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)勁。
(4)葉面噴霧作物的整個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)均可進(jìn)行噴施。將HarpinEccs蛋白制劑配成15-20μg/ml的水溶液，在作物的苗期、分蘗期、初花期、初果期或灌漿期進(jìn)行噴霧使用。作物生長(zhǎng)季節(jié)一般可噴霧2-3次。噴霧后，可提高作物營(yíng)養(yǎng)體生長(zhǎng)量15-30％，提高產(chǎn)量10-20％，而且整個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)可省掉80％以上的化學(xué)農(nóng)藥。某些作物如黃瓜可抗住60％的灰霉病、煙草可抗住60-80％的花葉病毒病。另外還有一定的抗逆(抗旱、抗寒、耐鹽堿等)和驅(qū)蟲(chóng)效果。
實(shí)施例4 HarpinEccs蛋白的應(yīng)用舉例目前已對(duì)數(shù)十種作物、蔬菜、水果、花卉作了HarpinEccs蛋白的施用效果試驗(yàn)，雖然在不同作物品種上表現(xiàn)程度有所不同，但HarpinEccs蛋白的促長(zhǎng)增產(chǎn)、抗病驅(qū)蟲(chóng)、提高抗逆性以及盆花、苗木塑型等方面的作用是顯著的。下面舉幾例加以說(shuō)明(1)玉米選取兩塊5分地大小的4葉期玉米苗田，分別用作對(duì)照和處理樣塊。處理塊分別在4葉期和6葉期用15-20μg/ml的HarpinEccs蛋白溶液作了葉面噴霧，此外不使用任何農(nóng)藥，其它方面的管理與對(duì)照塊一樣。在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，用藥后一周，處理塊平均株高比對(duì)照塊高出10-15cm，玉米大小斑病發(fā)病率也比對(duì)照塊低20-30％；同時(shí)處理塊開(kāi)花比對(duì)照塊提前5-10天，灌漿期雙苞率明顯高于對(duì)照。收獲后比較產(chǎn)量，處理塊比對(duì)照塊增產(chǎn)12％以上。
(2)黃瓜選取三塊5分地大小的3葉期黃瓜苗田，分別用作對(duì)照、HarpinEccs蛋白處理、絡(luò)合HarpinEccs蛋白處理的樣塊。兩種蛋白處理液的濃度均為20μg/ml。兩個(gè)處理塊都分別在3葉期、5葉期和7葉期進(jìn)行過(guò)葉面噴霧，其它管理同對(duì)照。試驗(yàn)結(jié)果表明絡(luò)合HarpinEccs蛋白處理和HarpinEccs蛋白處理，開(kāi)花分別比對(duì)照提前10天和8天；花葉病分別比對(duì)照減少70％和65％；灰霉柄分別比對(duì)照減少40％和30％；產(chǎn)量分別比對(duì)照增加26％和23％以上。
(3)草莓選取約2分地大小的兩廂3葉期草莓苗棚，分別作對(duì)照和絡(luò)合HarpinEccs蛋白處理。處理苗棚的絡(luò)合HarpinEccs蛋白使用濃度為20μg/ml。3葉期開(kāi)始葉面噴霧，以后每間隔15天噴施一次，共計(jì)5次。結(jié)果顯示，處理棚比對(duì)照棚提早10左右開(kāi)花；單株花、果率平均比對(duì)照增加2-3個(gè)；灰霉病發(fā)生率明顯少于對(duì)照；鮮果呈色好、果型優(yōu)、畸形果率低，產(chǎn)量比對(duì)照增產(chǎn)25％以上。另外，通過(guò)對(duì)等量鮮果進(jìn)行烘干稱重，發(fā)現(xiàn)處理棚的干物質(zhì)積累也比對(duì)照增加1-2％。
(4)仙客來(lái)仙客來(lái)是深受大眾喜歡的盆花品種，但是由細(xì)菌性軟腐病引起的死亡率很高，高溫時(shí)休眠，而且因病毒病造成的畸形葉、花嚴(yán)重影響了其觀賞價(jià)值和商業(yè)價(jià)值。我們選區(qū)了400盆3-4月齡仙客來(lái)作供試材料，隨機(jī)分成兩組，分別作對(duì)照和絡(luò)合HarpinEccs蛋白處理。絡(luò)合HarpinEccs蛋白的使用濃度為20μg/ml。處理方法為葉面噴霧，每間隔10-15天噴施一次。結(jié)果表明，用藥一周以后，處理組的葉色變深、有光澤，株型也明顯變得挺拔、緊湊、活脫，并能打破高溫休眠；用藥一個(gè)月以后，以前因病毒病而畸形卷曲的幼葉開(kāi)始逐漸伸展成正常形態(tài)，而對(duì)照組的幼葉則變得越來(lái)越畸形，連開(kāi)出的花瓣也呈畸形扭曲。另外，絡(luò)合HarpinEccs蛋白似乎對(duì)仙客來(lái)葉片上的白粉虱也有一定的驅(qū)趕作用。
序列表<110>成都派潤(rùn)生物科技有限公司<120>一種編碼植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號(hào)因子的基因hrpNEccs及其表達(dá)產(chǎn)物HarpinEccs蛋白質(zhì)<160>2<170>PatentIn Version 2.1<210>1<211>1071
<212>DNA<213>胡蘿卜軟腐歐氏桿菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)<221>1-1071<400>11 atgcttaatt ctcttggtgg cggagcttct ctgcaaatca cgatcaaagc gggtggtaac61 ggcggtttat ttccatctca gtcttcacaa aatggcggat cgccatcgca gtcggcgttt121 ggtggccagc gtagcaacat cgcagaacag ctgtccgata tcgtgacgac tatgatgttt181 atgggcagca tgatgggcgg cggcatgggc ggtgggctcg gtggtttagg cagtagcctg241 ggcggactcg gtggtggttt gctgggtggt ggcttgggtg gcggtctcgg cagtagcctt301 ggtagtggac tgggcagtgc gctcggcggc ggattaagcg gggtgctggg tgctggcatg361 aatgccatga atccatcggc catgatgggt agcctgctgt ttagcgcgct ggaagatctg421 ctgggcggtg gcatgtcgca gcagcagggt gggcttttcg gcaacaaaca gccgtcgtcg481 ccggaaattt ctgcctatac ccaaggcgtt aacgatgcgc tgtccgcaat tctgggcaac541 ggcctgagcc agacgaaagg gcaaacgtca ccgttgcaac tgggtaataa cggtctgcaa601 ggcttgagcg gtgcgggtgc gtttaatcaa ctgggtagca cgctggggat gagcgttggg661 caaaaagccg gtttgcagga gttgaacaac atcagcacgc acaatgatag cccgacgcgt721 tacttcgtgg ataaagaaga tcgggcgatg gcgaaagaaa ttggtcagtt tatggatcaa781 tatcctgaag tcttcggcaa ggcagaatac cagaaagata actggcagac ggcgaaacag841 gaggataaat cctgggctaa agcgctgagc aagccggatg acgacggcat gactaagggc901 agcatggata aattcatgaa ggcggtcggc atgatcaaga gtgcgatagc gggtgatact961 ggcaacgcta acctgagcgc tcgtggcaac ggcggcgcat ctctgggcat tgatgcagcg1021 atgatcggcg accgtatcgt caatatgggg ttgcagaagc tctccagcta a<210>2<211>356<212>PRT<213>胡蘿卜軟腐歐氏桿菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)<400>2Met Leu Asn Ser Leu Gly Gly Gly Ala Ser Leu Gln Ile Thr Ile Lys1 5 10 15Ala Gly Gly Asn Gly Gly Leu Phe Pro Ser Gln Ser Ser Gln Asn Gly20 25 30Gly Ser Pro Ser Gln Ser Ala Phe Gly Gly Gln Arg Ser Asn Ile Ala35 40 45Glu Gln Leu Ser Asp Ile Met Thr Thr Met Met Phe Met Gly Ser Met50 55 60
Met Gly Gly Gly Met Gly Gly Gly Leu Gly Gly Leu Gly Ser Ser Leu65 70 75 80Gly Gly Leu Gly Gly Gly Leu Leu Gly Gly Gly Leu Gly Gly Gly Leu85 90 95Gly Ser Ser Leu Gly Ser Gly Leu Gly Ser Ala Leu Gly Gly Gly Leu100 105 110Ser Gly Val Leu Gly Ala Gly Met Asn Ala Met Asn Pro Ser Ala Met115 120 125Met Gly Ser Leu Leu Phe Ser Ala Leu Glu Asp Leu Leu Gly Gly Gly130 135 140Met Ser Gln Gln Gln Gly Gly Leu Phe Gly Asn Leu Gln Pro Ser Ser145 150 155 160Pro Glu Ile Ser Ala Tyr Thr Gln Gly Val Asn Asp Ala Leu Ser Ala165 170 175Ile Leu Gly Asn Gly Leu Ser Gln Thr Lys Gly Gln Thr Ser Pro Leu180 185 190Gln Leu Gly Asn Asn Gly Leu Gln Gly Leu Ser Gly Ala Gly Ala Phe195 200 205Asn Gln Leu Gly Ser Thr Leu Gly Met Ser Val Gly Gln Leu Ala Gly210 215 220Leu Gln Glu Leu Asn Asn Ile Ser Thr His Asn Asp Ser Pro Thr Arg225 230 235 240Tyr Phe Val Asp Lys Glu Asp Arg Ala Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln245 250 255Phe Met Asp Gln Tyr Pro Glu Val Phe Gly Lys Ala Glu Tyr Gln Lys260 265 270Asp Asn Trp Gln Thr Ala Lys Gln Glu Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala275 280 285Leu Ser Lys Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Lys Gly Ser Met Asp Lys290 295 300Phe Met Lys Ala Val Gly Met Ile Lys Ser Ala Ile Ala Gly Asp Thr305 310 315 320Gly Asn Thr Asn Leu Ser Ala Arg Gly Asn Gly Gly Ala Ser Leu Gly325 330 335Ile Asp Ala Ala Met Ile Gly Asp Arg Ile Val Asn Met Gly Leu Gln340 345 350Lys Leu Ser Ser35權(quán)利要求
1.一種編碼植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號(hào)因子的基因hrpNEccs及其表達(dá)產(chǎn)物HarpinEccs蛋白質(zhì)，其特征在于hrpNEccs基因來(lái)自胡蘿卜軟腐歐氏桿菌(Erwiniacarotovora subsp.carotovora)白菜軟腐菌變種CSDS001菌株，該基因表達(dá)產(chǎn)物HarpinEccs蛋白具有多種功能活性，能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性、驅(qū)蟲(chóng)性和抗逆性，并促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育和提高產(chǎn)量；hrpNEccs基因的核甘酸序列為1 atgcttaatt ctcttggtgg cggagcttct ctgcaaatca cgatcaaagc gggtggtaac61 ggcggtttat ttccatctca gtcttcacaa aatggcggat cgccatcgca gtcggcgttt121 ggtggccagc gtagcaacat cgcagaacag ctgtccgata tcatgacgac tatgatgttt181 atgggcagca tgatgggcgg cggcatgggc ggtgggctcg gtggtttagg cagtagcctg241 ggcggactcg gtggtggttt gctgggtggt ggcttgggtg gcggtctcgg cagtagcctt301 ggtagtggac tgggcagtgc gctcggcggc ggattaagcg gggtgctggg tgctggcatg361 aatgccatga atccatcggc catgatgggt agcctgctgt ttagcgcgct ggaagatctg421 ctgggcggtg gcatgtcgca gcagcagggt gggcttttcg gcaacaaaca gccgtcgtcg481 ccggaaattt ctgcctatac ccaaggcgtt aacgatgcgc tgtccgcaat tctgggcaac541 ggcctgagcc agacgaaagg gcaaacgtca ccgttgcaac tgggtaataa cggtctgcaa601 ggcttgagcg gtgcgggtgc gtttaatcaa ctgggtagca cgctggggat gagcgttggg661 caaaaagccg gtttgcagga gttgaacaac atcagcacgc acaatgatag cccgacgcgt721 tacttcgtgg ataaagaaga tcgggcgatg gcgaaagaaa ttggtcagtt tatggatcaa781 tatcctgaag tcttcggcaa ggcagaatac cagaaagata actggcagac ggcgaaacag841 gaggataaat cctgggctaa agcgctgagc aagccggatg acgacggcat gactaagggc901 agcatggata aattcatgaa ggcggtcggc atgatcaaga gtgcgatagc gggtgatact961 ggcaacacta acctgagcgc tcgtggcaac ggcggcgcat ctctgggcat tgatgcagcg1021 atgatcggcg accgtatcgt caatatgggg ttgcagaagc tctccagcta a
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述之編碼植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號(hào)因子的基因hrpNEccs及其表達(dá)產(chǎn)物HarpinEccs蛋白質(zhì)，其特征在于所述hrpNEccs基因具有以下屬性(1)編碼區(qū)共計(jì)有1071個(gè)核甘酸；(2)富含甘氨酸密碼子，缺少半胱氨酸密碼子；(3)與來(lái)自胡蘿卜軟腐歐氏桿菌褐腐致病菌(Erwinia carotovorasubsp.carotovora)Ecc71和Eccl菌株的hrpNEcc基因分別享有93％和92％的同源性；(4)與來(lái)自胡蘿卜軟腐歐氏桿菌黑腐致病菌(Erwinia carotovora subsp.atrosepitica)SCR11043和SCR11039菌株的hrpNEcc基因分別享有89％和88％的同源性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述之編碼植物功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號(hào)因子的基因hrpNEccs及其表達(dá)產(chǎn)物HarpinEccs蛋白質(zhì)，其特征在于所述HarpinE多ccs蛋白序列如SEQ ID.No2，具有以下屬性(1)356個(gè)氨基酸序列中各氨基酸組成分別為Met22、Asn20、Gly75、Leu40、Ser41、Ala28、Gln24、Ile13、Lys17、Thr13、Asp16、Phe10、Val7、Arg5、Glu9、Trp2、Tyr4、His1、Pro9；(2)分子量35.58kda；(3)等電點(diǎn)pI5.26；(4)與來(lái)自胡蘿卜軟腐歐氏桿菌(Erwinia carotovorasubsp carotovora)褐腐致病變種的HarpinEcc蛋白相比，分子中有6個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了氨基酸替換(序列中的紅色位點(diǎn))，分別為Ser70→Gly70、Gly113→Ser113、Ala115→Val115、Gly249→Ala249、Arg317→Ala317、Lys352→Gln352；(5)富含甘氨酸Gly和較多的疏水性氨基酸亮氨酸Leu，分別占氨基酸數(shù)目總量的21％和11％，尤其是在第1、2個(gè)突變氨基酸G70和S113之間，其豐度分別高達(dá)56％和28％；(6)缺乏半胱氨酸Cys；(7)對(duì)溫度特穩(wěn)定，在100℃沸水中耐受10-15分鐘仍有活性；(8)沒(méi)有四級(jí)結(jié)構(gòu)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1和3所述之編碼植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號(hào)因子的基因hrpNEccs及其表達(dá)產(chǎn)物HarpinEccs蛋白質(zhì)，其特征在于HarpinEccs蛋白及其相關(guān)活性復(fù)合體可直接應(yīng)用于植物的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)和病蟲(chóng)害防治。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種編碼植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號(hào)因子的基因hrpN
文檔編號(hào)C12N15/31GK1687420SQ20051002066
公開(kāi)日2005年10月26日 申請(qǐng)日期2005年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月5日
發(fā)明者吳伯驥, 湯承, 崔亞亞 申請(qǐng)人:成都派潤(rùn)生物科技有限公司