專利名稱：植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號(hào)因子Harpin的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物基因工程領(lǐng)域，特別是涉及一種胡蘿卜軟腐歐氏桿菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)白菜軟腐菌變種CSDS001菌株hrpNEccs基因以及此基因通過(guò)生物技術(shù)方法提高植物多功能活性和廣譜抗性并改良植物品質(zhì)的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
微生物蛋白農(nóng)藥是對(duì)多種農(nóng)作物具有很強(qiáng)生物活性的一類(lèi)蛋白質(zhì)藥物。按作用機(jī)理不同又可分為傳統(tǒng)微生物蛋白農(nóng)藥和新型微生物蛋白農(nóng)藥。傳統(tǒng)微生物蛋白農(nóng)藥主要是來(lái)自蘇云金芽孢桿菌(Bt)的殺蟲(chóng)晶體蛋白(ICP)，新型微生物蛋白農(nóng)藥主要是蛋白激發(fā)子類(lèi)物質(zhì)，它與傳統(tǒng)微生物蛋白農(nóng)藥最大的區(qū)別在于其不直接殺滅害蟲(chóng)和病原物，而是激發(fā)植物自身的抗病防蟲(chóng)基因的表達(dá)，并促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育。目前研究報(bào)道的具有代表性的新型微生物蛋白農(nóng)藥主要有過(guò)敏蛋白(Harpin)、隱地蛋白(Cryptogein)和激活蛋白(Activator)等，其中最受關(guān)注、最有應(yīng)用前景的是Harpin類(lèi)蛋白激發(fā)子。
Harpin蛋白主要是由歐文氏桿菌屬(Erwinia)細(xì)菌產(chǎn)生的一類(lèi)能激發(fā)植物過(guò)敏反應(yīng)的蛋白質(zhì)(30-40kda)，可誘導(dǎo)植物體內(nèi)一系列基因的表達(dá)，激活植物自身的生長(zhǎng)系統(tǒng)和防衛(wèi)系統(tǒng)，從而使植物能抵御多種病害的侵染和逆境的脅迫，并獲得促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育和提高增產(chǎn)的效果。1992年，美國(guó)康乃爾大學(xué)的韋忠民等首先從梨火疫歐文氏桿菌(E.amylovora)中克隆出這類(lèi)過(guò)敏蛋白基因，并首次提出Harpin蛋白誘導(dǎo)植物的過(guò)敏反應(yīng)可能與其抗病性作用有關(guān)，由此推動(dòng)了新型微生物蛋白農(nóng)藥研究的興起。經(jīng)過(guò)約10年的努力，以此為背景的美國(guó)Eden生物科技公司成功開(kāi)發(fā)和研制出具有廣譜抗病防蟲(chóng)功能的新型微生物蛋白農(nóng)藥Messenger，該產(chǎn)品以其對(duì)大田作物和經(jīng)濟(jì)作物抗病增產(chǎn)方面良好的效果以及對(duì)綠色無(wú)公害農(nóng)業(yè)卓越的貢獻(xiàn)，曾兩度獲美國(guó)環(huán)境保護(hù)委員會(huì)頒發(fā)的總統(tǒng)綠色化學(xué)挑戰(zhàn)獎(jiǎng)。
現(xiàn)代分子植物病理學(xué)揭示，植物病原細(xì)菌既有其致病性，也有誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性和促進(jìn)生長(zhǎng)的能力，而決定這種能力的基因是植物病原細(xì)菌的hrp(hypersensitive response and pathogenicity)基因簇。hrp基因決定著植物病原細(xì)菌在非寄主植物上激發(fā)過(guò)敏反應(yīng)(hypersensitive response onnon-host plants，HR)的能力和在寄主植物上的基本寄生性或致病性(parasitism or pathogenicity on host plants)。HR是植物一種局部的、快速的細(xì)胞編程死亡形式，是植物主動(dòng)抗性的結(jié)果，其抗性作用不僅表現(xiàn)在對(duì)病原細(xì)菌侵染擴(kuò)展的限制，而且能進(jìn)一步誘導(dǎo)植物體內(nèi)產(chǎn)生類(lèi)似免疫機(jī)制的系統(tǒng)獲得性抗性反應(yīng)。
繼韋忠民等(Wei et al.1992)成功克隆和表達(dá)hrpNEa基因之后，近10多年來(lái)人們又相繼從E.carotovora subsp carotovora、E.chrysanthemi、P.s.syringae、P.s.pv.glycinea、、P.s.tomato、R.solanacearum中克隆到編碼Harpin類(lèi)蛋白的基因，并成功表達(dá)了這些蛋白，如HarpinEcc，36kda，MukherjeeA.1997；HarpinEch，36kda，Bauer D.W.1995；HarpinPss，34.7kda，Preston G.1995；HarpinPsg，35.3kda，Preston G.1995；HarpinPst，36.5kda，Preston G.1995；HarpinXoo，15.3kda，聞偉剛2001；HarpinXooc，15.6kda，聞偉剛2001等。
最近的研究表明，Harpin類(lèi)蛋白可能在植物的信號(hào)通路中起著重要作用。研究人員用Harpin處理擬南芥，發(fā)現(xiàn)擬南芥中Cl、Ca、K、H、Cu、Zn離子通道以及各種氧化酶被激活，這些氧化酶包括ACC合成酶、抗壞血酸氧化酶、Cu/Zn超氧化物歧化酶、Cu分子伴侶前體等等。現(xiàn)在通常認(rèn)為，植物細(xì)胞壁中廣泛存在Harpin蛋白的受體，即Harpin結(jié)合蛋白(Harpin-binding proteins，HrBP)，Harpin可以通過(guò)與這些受體蛋白HrBP結(jié)合激活植物中的多條信號(hào)通路。
Harpin蛋白雖然來(lái)源于病原菌，但作為一類(lèi)非特異性的激發(fā)蛋白因子，卻能引起非寄主植物發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)，并誘導(dǎo)其抗病性、驅(qū)蟲(chóng)性和抗逆性的增加，以及促進(jìn)生長(zhǎng)、提高產(chǎn)量等。為達(dá)此目的，獲取HarpinEccs的高效分泌表達(dá)就具有明顯的現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容
植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號(hào)因子HarpinEccs的高效分泌表達(dá)克隆hrpNEccs基因，其特征在于，構(gòu)建融合分泌表達(dá)載體pMAL(p2)-hrpNEccs，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(DE3)和DH5α菌株，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，使可溶性的融合分泌表達(dá)蛋白MBP-HarpinEccs占細(xì)菌周質(zhì)總蛋白的66％以上，實(shí)現(xiàn)HarpinEccs蛋白的高效分泌表達(dá)。
具體實(shí)施例方式
現(xiàn)將有關(guān)內(nèi)容表述如下1、白菜軟腐菌染色體DNA的制備從LB平板上挑取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的菌落，于37℃下在LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，離心收集菌體，按分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Sambrook J等，1989)的方法提取、純化細(xì)菌染色體DNA。
2、hrpNEccs基因的PCR擴(kuò)增與純化據(jù)GeneBank中已報(bào)道的胡蘿卜軟腐歐氏桿菌(Erwinia carotovora subsp carotovora)的hrpNEcc基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)PCR擴(kuò)增引物，即P15′-TGTGGATCCATGCTTAATTCTCTTGGTGGCGGAG-3′和P25′-TGTAAGCTTTAGCTGGAGAGCTTCTTCAACCC-3′。其中P1為HarpinEcc蛋白的N端編碼序列，并在起始密碼子ATG前引入了新的限制酶切位點(diǎn)BamH I(G/GATCC)，P2為HarpinEcc蛋白的C端編碼序列的互補(bǔ)序列，引入了新的限制酶切位點(diǎn)HindIII(A/AGCTT)。用上面分離的白菜軟腐菌的染色體DNA作模板，按如下擴(kuò)增參數(shù)進(jìn)行PCR反應(yīng)先95℃預(yù)變性5min，然后94℃/2min 1個(gè)循環(huán)；94℃/15sec+55℃/30sec+72℃/15sec 24個(gè)循環(huán)；94℃/1min+55℃/2min+72℃/3min 1個(gè)循環(huán)。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳鑒定，得到了長(zhǎng)度約1.1kb左右的DNA擴(kuò)增帶。擴(kuò)增產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化。
3、hrpNEccs基因的克隆與測(cè)序純化后的PCR目的產(chǎn)物用限制酶BamH I和HindIII雙酶切，同時(shí)對(duì)克隆載體pET28a(+)也進(jìn)行BamH I和HindIII雙酶切，酶切產(chǎn)物分別用瓊脂糖凝膠電泳回收，在T4DNA連接酶作用下12℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(DE3)，挑選陽(yáng)性克隆，經(jīng)鑒定后進(jìn)行全自動(dòng)序列分析。結(jié)果表明，hrpNEccs基因共計(jì)1071個(gè)核苷酸，序列如SEQ ID.No1。
與相關(guān)基因序列進(jìn)行比較分析表明，hrpNEccs基因富含甘氨酸密碼子，缺少半胱氨酸密碼子；與來(lái)自胡蘿卜軟腐歐氏桿菌褐腐致病菌(Erwinia carotovorasubsp.carotovora)Ecc71和Ecc1菌株的hrpNEcc基因分別享有93％和92％的同源性；與來(lái)自胡蘿卜軟腐歐氏桿菌黑腐致病菌(Erwinia carotovora subsp.atrosepitica)SCR11043和SCR11039菌株的hrpNEcc基因分別享有89％和88％的同源性。
根據(jù)以上hrpNEccs基因的核苷酸序列，推出HarpinEccs蛋白的N→C氨基酸序列為SEQ ID.No2。
該蛋白具有以下分子屬性(1)356個(gè)氨基酸序列中各氨基酸組成分別為Met22、Asn20、Gly75、Leu40、Ser41、Ala28、Gln24、Ile13、Lys17、Thr13、Asp16、Phe10、Val7、Arg5、Glu9、Trp2、Tyr4、His1、Pro9；(2)分子量35.58kda；(3)等電點(diǎn)pI5.26；(4)與來(lái)自胡蘿卜軟腐歐氏桿菌(Erwinia carotovorasubsp carotovora)褐腐致病變種的HarpinEcc蛋白相比，分子中有6個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了氨基酸替換，分別為Ser70→Gly70、Gly113→Ser113、Ala115→Val115、Gly249→Ala249、Arg317→Ala317、Lys352→Gln352；(5)富含甘氨酸Gly和較多的疏水性氨基酸亮氨酸Leu，分別占氨基酸數(shù)目總量的21％和11％，尤其是在第1、2個(gè)突變氨基酸G70和S113之間，其豐度分別高達(dá)56％和28％；(6)缺乏半胱氨酸Cys；(7)對(duì)溫度特穩(wěn)定，在100℃沸水中耐受10-15分鐘仍有活性；(8)沒(méi)有四級(jí)結(jié)構(gòu)。
4、hrpNEccs基因的融合基因克隆從上面pET28a(+)-hrpNEccs克隆載體中經(jīng)BamH I和HindIII雙酶切回收hrpNEccs基因片段，并與經(jīng)同樣限制酶雙酶切的分泌表達(dá)載體pMAL(p2)相連接，構(gòu)建融合分泌表達(dá)載體pMAL(p2)-hrpNEccs。
pMAL(p2)載體具有以下特征(1)大小6.7kb；(2)有7個(gè)多克隆位點(diǎn)Xmn I，EcoR I，BamH I，Xba I，Sal I，Pst I，HindIII；(3)選擇標(biāo)記Amp；(4)藍(lán)白斑篩選；(5)單鏈復(fù)制子M13；(6)測(cè)序引物M13。
克隆后的融合分泌表達(dá)載體pMAL(p2)-hrpNEccs具有以下特征(1)hrpNEccs基因被克隆進(jìn)載體pMAL(p2)的BamH I-HindIII位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于基因malE的下游序列中，因而形成malE-hrpNEccs融合基因；(2)malE基因的信號(hào)序列可指導(dǎo)融合蛋白分泌至細(xì)胞外；(3)malE基因編碼麥芽糖結(jié)合蛋白2-β-半乳糖片段(maltose-binding protein，MBP2-β-gal，50.843kda)；(4)由強(qiáng)啟動(dòng)子tac啟動(dòng)和IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。
5、hrpNEccs基因在大腸桿菌中的可溶性分泌表達(dá) 將克隆的融合分泌表達(dá)載體pMAL(p2)-hrpNEccs轉(zhuǎn)化宿主大腸桿菌JM109(DE3)和DH5α菌株，經(jīng)質(zhì)粒提取、酶切鑒定和PCR擴(kuò)增篩選陽(yáng)性表達(dá)克隆菌株JM109(DE3)-hrpNEccs和DH5α-hrpNEccs。選取含有表達(dá)質(zhì)粒的單克隆菌落在LB培養(yǎng)基(含100μg/ml氨芐西林)中37℃過(guò)夜培養(yǎng)，然后按1％轉(zhuǎn)接至新的LB搖瓶(含0.2％葡萄糖，100μg/ml氨芐西林)中，繼續(xù)培養(yǎng)至0D600值為0.4-0.6，加誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度1mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)3-5小時(shí)，離心收集菌體，取其周質(zhì)的滲透休克液進(jìn)行10％SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果表明，經(jīng)誘導(dǎo)后細(xì)菌周質(zhì)有大約86kda的外源蛋白表達(dá)帶，與預(yù)期的MBP-HarpinEccs融合蛋白大小一致。進(jìn)一步優(yōu)化大腸桿菌的分泌表達(dá)條件，可使融合蛋白的表達(dá)量占細(xì)菌周質(zhì)總蛋白的66％以上，從而實(shí)現(xiàn)了目的融合蛋白的高效分泌表達(dá)。
6、hrpNEccs基因融合表達(dá)蛋白的純化和檢測(cè) 利用MBP純化模塊可直接對(duì)hrpNEccs基因融合表達(dá)蛋白MBP-HarpinEccs進(jìn)行純化。
除酶切、電泳及HR等分析手段以外，最可靠的檢測(cè)手段是免疫印跡分析。將hrpNEccs基因融合表達(dá)蛋白和高分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白一起電泳，分子量標(biāo)準(zhǔn)凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，而制備的目的蛋白直接電轉(zhuǎn)移后進(jìn)行免疫印跡分析，用兔抗MBP或兔抗Harpin做一抗，結(jié)果在約86kda處出現(xiàn)一條陽(yáng)性反應(yīng)帶。
另外，Xa因子可識(shí)別融合蛋白的蛋白酶切位點(diǎn)并將MBP從融合蛋白中切下。
7、HarpinEccs蛋白的功能和應(yīng)用 目前的研究結(jié)果表明，Harpin類(lèi)蛋白的主要功能有以下幾個(gè)方面(1)促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育、提高產(chǎn)量；(2)增強(qiáng)植物的廣譜抗病性，包括對(duì)多種細(xì)菌、真菌和病毒的抗性；(3)使植物獲得對(duì)某些有害昆蟲(chóng)的驅(qū)蟲(chóng)性；(4)增強(qiáng)植物的抗逆性；(5)延長(zhǎng)植物產(chǎn)品的儲(chǔ)存時(shí)間；(6)對(duì)盆花、苗木還有良好的塑型作用。
由此可見(jiàn)，HarpinEccs蛋白可直接應(yīng)用于植物的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)和病蟲(chóng)害防治，包括糧食作物、經(jīng)濟(jì)植物、蔬菜、水果、花卉以及園林和草場(chǎng)的養(yǎng)護(hù)等；使用方法有浸種、拌種、蘸根、種子包衣、植株注射、葉面噴施、花果噴涂等；使用劑量因使用方法和品種而異，一般5μg/ml-80μg/ml均為有效濃度；施用后2-12小時(shí)內(nèi)即發(fā)生作用，藥效可持續(xù)20天左右，一個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)可用藥2-3次；本產(chǎn)品屬天然有機(jī)蛋白，對(duì)人畜無(wú)毒性，既不會(huì)引起病蟲(chóng)害的抗藥性，也不會(huì)誘發(fā)植物遺傳結(jié)構(gòu)(基因組DNA)的改變，在自然界能很快被光分解或被微生物降解，對(duì)環(huán)境不會(huì)造成殘留或積累污染，在使用過(guò)程中無(wú)需特殊防護(hù)措施，是未來(lái)替代高毒、高殘留化學(xué)農(nóng)藥和有公害的化學(xué)調(diào)節(jié)劑的理想的環(huán)保型生物產(chǎn)品。
本發(fā)明中所使用的工程菌E.coli JM109(DE3)和DH5α菌株及hrpNEccs基因的克隆和融合表達(dá)載體pET28a(+)和pMAL(p2)質(zhì)粒在國(guó)內(nèi)外分子生物學(xué)研究及醫(yī)藥工業(yè)中已廣泛應(yīng)用，對(duì)環(huán)境安全可靠。
本發(fā)明中使用的縮略語(yǔ)LB(細(xì)菌培養(yǎng)基，酵母粉5g/L+蛋白胨10g/L+NaC110g/L，pH7.0)；Amp(氨芐西林)；IPTG(異丙基硫代-β-半乳糖苷)。
下面通過(guò)應(yīng)用實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明實(shí)施例1 HarpinEccs蛋白的適用植物HarpinEccs蛋白適用的植物包括各種自然條件和栽培條件下的所有被子植物和裸子植物，以及某些觀賞性蕨類(lèi)植物。其中，適用的糧食作物、蔬菜作物、經(jīng)濟(jì)作物和果樹(shù)包括水稻、小麥、大麥、玉米、高粱、青稞、大豆、蠶豆、豌豆、綠豆、甘薯、馬鈴薯、萵苣、蕃茄、甘藍(lán)、菠菜、蘿卜、胡蘿卜、洋蔥、茄子、芹菜、白菜、大蒜、小白菜、花椰菜、南瓜、冬瓜、西瓜、絲瓜、黃瓜、瓠瓜、空心菜、青菜、韭菜、辣椒、姜、蔥、菜花、豇豆、四季豆、菜豆、甜菜、苜蓿、向日葵、花生、芝麻、蓖麻、油菜、棉花、亞麻、桑、甘蔗、煙草、胡椒、花椒、蘋(píng)果、梨、柑桔、柚、橘、葡萄、草莓、桃、杏、李、枇杷、荔枝、桂圓、波蘿、香蕉等；適用的觀賞性花卉植物和藤蔓植物包括蘭花、牽牛、郁金香、風(fēng)信子、百合、月季、玫瑰、菊花、牡丹、康乃馨、薔薇等；適用的各種藥用植物包括川芎、天麻、當(dāng)歸、芍藥、紫蘇、薄荷、板蘭根、連翹、金銀花、薯蕷、山藥、杜仲、丁香、人參、三七、貝母、枸杞子等；此外還適用于各種經(jīng)濟(jì)用林木或苗木、綠化用林木或苗木以及各種牧草和綠化用草皮等。
實(shí)施例2 HarpinEccs蛋白對(duì)細(xì)菌類(lèi)病害的防治HarpinEccs蛋白能有效防治植物的細(xì)菌性病害包括各種蔬菜、糧食和經(jīng)濟(jì)作物的軟腐病、環(huán)腐病、黑腐病、黑斑病、黑脛病、黑星病、黑粉病、葉枯病、青枯病、斑枯病、蔓枯病、紋枯病、枯萎病、炭疽病、角斑病、褐斑病、褐紋病、紫斑病、瘡痂病、菌核病、白葉枯病、白粉病、白斑病、白銹病、銹病等。
實(shí)施例3 HarpinEccs蛋白對(duì)真菌類(lèi)病害的防治HarpinEccs蛋白能有效防治植物的真菌性病害包括各種蔬菜、糧食和經(jīng)濟(jì)作物的霜霉病、灰霉病、葉霉病、煤霉病、疫霉病、早疫病、晚疫病、綿疫病等。
實(shí)施例4 HarpinEccs蛋白對(duì)病毒類(lèi)病害的防治HarpinEccs蛋白能有效防治植物的病毒性病害包括白菜孤丁病、蕃茄花葉病、煙草花葉病、白菜褪綠斑駁病毒病、白菜花葉斑駁病毒病以及由X-和Y-病毒復(fù)合感染引起的馬鈴薯病毒病等。
實(shí)施例5 HarpinEccs蛋白對(duì)有害昆蟲(chóng)類(lèi)病害的防治HarpinEccs蛋白能有效防治植物的有害昆蟲(chóng)包括蚜蟲(chóng)、菜蛾、菜粉蝶、棉鈴蟲(chóng)、煙青蟲(chóng)、玉米鉆孔蟲(chóng)、馬鈴薯瓢蟲(chóng)、甜菜甲蟲(chóng)、粉螨、金針蟲(chóng)、螻蛄、蠅、粉虱等。
實(shí)施例6 HarpinEccs蛋白的使用方法HarpinEccs蛋白在使用上方法多樣，可因處理材料、處理部位、處理時(shí)間以及處理目的不同而有所差異。具體可按以下方法使用(1)浸種首先用水將HarpinEccs蛋白配成30-60μg/ml的濃度，然后將種子浸于其中8-12小時(shí)。此法適宜作催芽的作物或蔬菜種子。浸種結(jié)束后，將種子從HarpinEccs蛋白浸種液中取出，即可催芽或播種。出苗一周后，苗高比對(duì)照增長(zhǎng)10％以上，生長(zhǎng)量也提高10％以上，而且苗期抗猝倒病的能力也明顯增強(qiáng)。
(2)拌種將種子稍加濕潤(rùn)，加入種子量0.1％的HarpinEccs蛋白制劑，充分拌勻后播種。出苗后苗齊苗壯，增強(qiáng)苗期抗猝倒病的能力。
(3)蘸根適于移栽定殖的作物，如瓜果、蔬菜、棉花、玉米等。首先將HarpinEccs蛋白制劑配成30μg/ml的水溶液，然后將被移栽作物幼苗的根浸在該溶液中1-2小時(shí)。移栽后，植株恢復(fù)生長(zhǎng)快，緩苗時(shí)間縮短，植株長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)勁。
(4)葉面噴霧作物的整個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)均可進(jìn)行噴施。將HarpinEccs蛋白制劑配成15-20μg/ml的水溶液，在作物的苗期、分蘗期、初花期、初果期或灌漿期進(jìn)行噴霧使用。作物生長(zhǎng)季節(jié)一般可噴霧2-3次。噴霧后，可提高作物營(yíng)養(yǎng)體生長(zhǎng)量15-30％，提高產(chǎn)量10-20％，而且整個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)可省掉80％以上的化學(xué)農(nóng)藥。某些作物如黃瓜可抗住60％的灰霉病、煙草可抗住60-80％的花葉病毒病。另外還有一定的抗逆(抗旱、抗寒、耐鹽堿等)和驅(qū)蟲(chóng)效果。
實(shí)施例7 HarpinEccs蛋白的應(yīng)用舉例目前已對(duì)數(shù)十種作物、蔬菜、水果、花卉作了HarpinEccs蛋白的施用效果試驗(yàn)，雖然在不同作物品種上表現(xiàn)程度有所不同，但HarpinEccs蛋白的促長(zhǎng)增產(chǎn)、抗病驅(qū)蟲(chóng)、提高抗逆性以及盆花、苗木塑型等方面的作用是顯著的。下面舉幾例加以說(shuō)明
(1)玉米選取兩塊5分地大小的4葉期玉米苗田，分別用作對(duì)照和處理樣塊。處理塊分別在4葉期和6葉期用15-20μg/ml的HarpinEccs蛋白溶液作了葉面噴霧，此外不使用任何農(nóng)藥，其它方面的管理與對(duì)照塊一樣。在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，用藥后一周，處理塊平均株高比對(duì)照塊高出10-15cm，玉米大小斑病發(fā)病率也比對(duì)照塊低20-30％；同時(shí)處理塊開(kāi)花比對(duì)照塊提前5-10天，灌漿期雙苞率明顯高于對(duì)照。收獲后比較產(chǎn)量，處理塊比對(duì)照塊增產(chǎn)12％以上。
(2)黃瓜選取三塊5分地大小的3葉期黃瓜苗田，分別用作對(duì)照、HarpinEccs蛋白處理、絡(luò)合HarpinEccs蛋白處理的樣塊。兩種蛋白處理液的濃度均為20μg/ml。兩個(gè)處理塊都分別在3葉期、5葉期和7葉期進(jìn)行過(guò)葉面噴霧，其它管理同對(duì)照。試驗(yàn)結(jié)果表明絡(luò)合HarpinEccs蛋白處理和HarpinEccs蛋白處理，開(kāi)花分別比對(duì)照提前10天和8天；花葉病分別比對(duì)照減少70％和65％；灰霉柄分別比對(duì)照減少40％和30％；產(chǎn)量分別比對(duì)照增加26％和23％以上。
(3)草莓選取約2分地大小的兩廂3葉期草莓苗棚，分別作對(duì)照和HarpinEccs蛋白處理。處理苗棚的HarpinEccs蛋白使用濃度為20μg/ml。3葉期開(kāi)始葉面噴霧，以后每間隔15天噴施一次，共計(jì)5次。結(jié)果顯示，處理棚比對(duì)照棚提早10左右開(kāi)花；單株花、果率平均比對(duì)照增加2-3個(gè)；灰霉病發(fā)生率明顯少于對(duì)照；鮮果呈色好、果型優(yōu)、畸形果率低，產(chǎn)量比對(duì)照增產(chǎn)25％以上。另外，通過(guò)對(duì)等量鮮果進(jìn)行烘干稱重，發(fā)現(xiàn)處理棚的干物質(zhì)積累也比對(duì)照增加1-2％。(4)仙客來(lái)仙客來(lái)是深受大眾喜歡的盆花品種，但是由細(xì)菌性軟腐病引起的死亡率很高，高溫時(shí)休眠，而且因病毒病造成的畸形葉、花嚴(yán)重影響了其觀賞價(jià)值和商業(yè)價(jià)值。我們選區(qū)了400盆3-4月齡仙客來(lái)作供試材料，隨機(jī)分成兩組，分別作對(duì)照和HarpinEccs蛋白處理。、HarpinEccs蛋白的使用濃度為20μg/ml。處理方法為葉面噴霧，每間隔10-15天噴施一次。結(jié)果表明，用藥一周以后，處理組的葉色變深、有光澤，株型也明顯變得挺拔、緊湊、活脫，并能打破高溫休眠；用藥一個(gè)月以后，以前因病毒病而畸形卷曲的幼葉開(kāi)始逐漸伸展成正常形態(tài)，而對(duì)照組的幼葉則變得越來(lái)越畸形，連開(kāi)出的花瓣也呈畸形扭曲。另外，HarpinEccs蛋白似乎對(duì)仙客來(lái)葉片上的白粉虱也有一定的驅(qū)趕作用。
序列表
<110>成都派潤(rùn)生物科技有限責(zé)任公司<120>植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號(hào)因子HarpinEccs的高效分泌表達(dá)克隆hrpNEccs基因<160>2<170>PatentIn Version 2.1<210>1<211>1071<212>DNA<213>胡蘿卜軟腐歐氏桿菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)<221>1-1071<400>11atgcttaatt ctcttggtgg cggagcttct ctgcaaatca cgatcaaagc gggtggtaac61 ggcggtttat ttccatctca gtcttcacaa aatggcggat cgccatcgca gtcggcgttt121 ggtggccagc gtagcaacat cgcagaacag ctgtccgata tcatgacgac tatgatgttt181 atgggcagca tgatgggcgg cggcatgggc ggtgggctcg gtggtttagg cagtagcctg241 ggcggactcg gtggtggttt gctgggtggt ggcttgggtg gcggtctcgg cagtagcctt301 ggtagtggac tgggcagtgc gctcggcggc ggattaagcg gggtgctggg tgctggcatg361 aatgccatga atccatcggc catgatgggt agcctgctgt ttagcgcgct ggaagatctg421 ctgggcggtg gcatgtcgca gcagcagggt gggcttttcg gcaacaaaca gccgtcgtcg481 ccggaaattt ctgcctatac ccaaggcgtt aacgatgcgc tgtccgcaat tctgggcaac541 ggcctgagcc agacgaaagg gcaaacgtca ccgttgcaac tgggtaataa cggtctgcaa601 ggcttgagcg gtgcgggtgc gtttaatcaa ctgggtagca cgctggggat gagcgttggg661 caaaaagccg gtttgcagga gttgaacaac atcagcacgc acaatgatag cccgacgcgt721 tacttcgtgg ataaagaaga tcgggcgatg gcgaaagaaa ttggtcagtt tatggatcaa781 tatcctgaag tcttcggcaa ggcagaatac cagaaagata actggcagac ggcgaaacag841 gaggataaat cctgggctaa agcgctgagc aagccggatg acgacggcat gactaagggc901 agcatggata aattcatgaa ggcggtcggc atgatcaaga gtgcgatagc gggtgatact961 ggcaacacta acctgagcgc tcgtggcaac ggcggcgcat ctctgggcat tgatgcagcg1021 atgatcggcg accgtatcgt caatatgggg ttgcagaagc tctccagcta a<210>2<211>356
<212>PRT<213>胡蘿卜軟腐歐氏桿菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)<400>2Met Leu Asn Ser Leu Gly Gly Gly Ala Ser Leu Gln Ile Thr Ile Lys1 5 10 15Ala Gly Gly Asn Gly Gly Leu Phe Pro Ser Gln Ser Ser Gln Asn Gly20 25 30Gly Ser Pro Ser Gln Ser Ala Phe Gly Gly Gln Arg Ser Asn Ile Ala35 40 45Glu Gln Leu Ser Asp Ile Met Thr Thr Met Met Phe Met Gly Ser Met50 55 60Met Gly Gly Gly Met Gly Gly Gly Leu Gly Gly Leu Gly Ser Ser Leu65 70 75 80Gly Gly Leu Gly Gly Gly Leu Leu Gly Gly Gly Leu Gly Gly Gly Leu85 90 95Gly Ser Ser Leu Gly Ser Gly Leu Gly Ser Ala Leu Gly Gly Gly Leu100 105 110Ser Gly Val Leu Gly Ala Gly Met Asn Ala Met Asn Pro Ser Ala Met115 120 125Met Gly Ser Leu Leu Phe Ser Ala Leu Glu Asp Leu Leu Gly Gly Gly130 135 140Met Ser Gln Gln Gln Gly Gly Leu Phe Gly Asn Leu Gln Pro Ser Ser145 150 155 160Pro Glu Ile Ser Ala Tyr Thr Gln Gly Val Asn Asp Ala Leu Ser Ala165 170 175Ile Leu Gly Asn Gly Leu Ser Gln Thr Lys Gly Gln Thr Ser Pro Leu180 185 190Gln Leu Gly Asn Asn Gly Leu Gln Gly Leu Ser Gly Ala Gly Ala Phe195 200 205Asn Gln Leu Gly Ser Thr Leu Gly Met Ser Val Gly Gln Leu Ala Gly210 215 220Leu Gln Glu Leu Asn Asn Ile Ser Thr His Asn Asp Ser Pro Thr Arg225 230 235 240Tyr Phe Val Asp Lys Glu Asp Arg Ala Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln245 250 255Phe Met Asp Gln Tyr Pro Glu Val Phe Gly Lys Ala Glu Tyr Gln Lys260 265 270Asp Asn Trp Gln Thr Ala Lys Gln Glu Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala275 280 285Leu Ser Lys Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Lys Gly Ser Met Asp Lys290 295 300Phe Met Lys Ala Val Gly Met Ile Lys Ser Ala Ile Ala Gly Asp Thr305 310 315 320Gly Asn Thr Asn Leu Ser Ala Arg Gly Asn Gly Gly Ala Ser Leu Gly325 330 335Ile Asp Ala Ala Met Ile Gly Asp Arg Ile Val Asn Met Gly Leu Gln340 345 350Lys Leu Ser Ser35權(quán)利要求
1.植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號(hào)因子HarpinEccs的高效分泌表達(dá)，其特征在于，構(gòu)建融合分泌表達(dá)載體pMAL(p2)-hrpNEccs，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(DE3)和DH5α菌株，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，使可溶性的融合分泌表達(dá)蛋白MBP-HarpinEccs占細(xì)菌周質(zhì)總蛋白的66％以上，實(shí)現(xiàn)HarpinEccs蛋白的高效分泌表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述之植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號(hào)因子HarpinEccs的高效分泌表達(dá)，其特征在于，克隆基因hrpNEccs的宿主菌是白菜軟腐菌變種CSDS001菌株，該細(xì)菌在分類(lèi)上屬于胡蘿卜軟腐歐文氏桿菌，核甘酸序列為SEQID.No1
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述之植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號(hào)因子HarpinEccs的高效分泌表達(dá)，其特征在于，HarpinEccs蛋白的氨基酸序列特征(N→C)為SEQID.No2，且(1)序列中共356個(gè)氨基酸殘基，其中各氨基酸組成分別為Met22、Asn20、Gly75、Leu40、Ser41、Ala28、Gln24、Ile13、Lys17、Thr13、Asp16、Phe10、Val7、Arg5、Glu9、Trp2、Tyr4、His1、Pro9；(2)分子量35.58kda；(3)等電點(diǎn)pI5.26；(4)與來(lái)自胡蘿卜軟腐歐氏桿菌(Erwinia carotovorasubsp.carotovora)褐腐致病變種的HarpinEcc蛋白相比，分子中有6個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了氨基酸替換，分別為Ser70→Gly70、Gly112→Ser113、Ala115→Val115、Gly249→Ala249、Arg317→Ala317、Lys352→Gln352；(5)富含甘氨酸Gly和較多的疏水性氨基酸亮氨酸Leu，分別占氨基酸數(shù)目總量的21％和11％，尤其是在第1、2個(gè)突變氨基酸G70和S113之間，其豐度分別高達(dá)56％和28％；(6)缺乏半胱氨酸Cys；(7)對(duì)溫度特穩(wěn)定，在100℃沸水中耐受10-15分鐘仍有生物學(xué)活性；(8)沒(méi)有四級(jí)結(jié)構(gòu)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述之植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號(hào)因子HarpinEccs的高效分泌表達(dá)，其特征在于，克隆的融合分泌表達(dá)載體為pMAL(p2)-hrpNEccs，hrpNEccs基因被克隆進(jìn)載體pMAL(p2)的BamH I-HindIII位點(diǎn)，即基因malE的下游序列中，形成malE-hrpNEccs融合基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述之植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號(hào)因子HarpinEccs的高效分泌表達(dá)，其特征在于，轉(zhuǎn)化宿主菌大腸桿菌JM109(DE3)和DH5α菌株，獲得的陽(yáng)性表達(dá)工程菌為JM109(DE3)-pMAL(p2)-hrpNEccs和DH5α-pMAL(p2)-hrpNEccs。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述之植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號(hào)因子HarpinEccs的高效分泌表達(dá)，其特征在于，融合分泌表達(dá)產(chǎn)物為MBP-HarpinEccs融合蛋白，(1)分子量約86kda；(2)水溶性；(3)利用MBP純化模塊對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化和檢測(cè)；(4)用Xa因子識(shí)別融合蛋白的蛋白酶切位點(diǎn)并切開(kāi)融合蛋白。
7.由權(quán)利要求1或2或3或4或5所得之植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號(hào)因子HarpinEccs的應(yīng)用，其特征在于，HarpinEccs蛋白的主要功能特征表現(xiàn)在(1)促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育、提高產(chǎn)量；(2)增強(qiáng)植物的廣譜抗病性，包括對(duì)多種細(xì)菌、真菌和病毒的抗性；(3)使植物獲得對(duì)某些有害昆蟲(chóng)的驅(qū)蟲(chóng)性；(4)增強(qiáng)植物的抗逆性，提高植物對(duì)包括干旱、嚴(yán)寒、鹽堿等不良環(huán)境的耐受性；(5)延長(zhǎng)作物產(chǎn)品的儲(chǔ)存時(shí)間；(6)對(duì)盆花、苗木有良好的塑型作用。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物多功能活性和廣譜抗性細(xì)胞信號(hào)因子Harpin
文檔編號(hào)C12N15/67GK1693468SQ20051002066
公開(kāi)日2005年11月9日 申請(qǐng)日期2005年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月5日
發(fā)明者吳伯驥, 湯承, 崔亞亞 申請(qǐng)人:成都派潤(rùn)生物科技有限公司