專利名稱：一種快速測(cè)定廢水處理系統(tǒng)中功能菌含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種廢水處理系統(tǒng)中功能菌的快速測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
廢水生物處理系統(tǒng)中活性污泥的微生物種群組成，很大程度決定該系統(tǒng)的處理效果高平平，趙立平.TGGE分析焦化廢水處理系統(tǒng)活性污泥細(xì)菌種群動(dòng)態(tài)變化及多樣性.生態(tài)學(xué)報(bào)，2003，23(10)1963-1969.。研究微生物群落組成的傳統(tǒng)方法是以純培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)，但此方法鑒定的微生物只占群落總數(shù)的0.1％～10％Torsvik V，Ovreas L.Microbial Diversity and CommunityStructure in Two Different Agricultural Soil Communities.Microb.Ecol，1998，36303-315.，而容易培養(yǎng)的分離物并不總是生態(tài)學(xué)上的優(yōu)勢(shì)種余利巖，姚天爵.微生物生態(tài)學(xué)研究方法的新進(jìn)展.微生物學(xué)通報(bào)，2001，28(1)89-93.，造成對(duì)許多重要的微生物生態(tài)系統(tǒng)中種群結(jié)構(gòu)認(rèn)識(shí)很不全面。
近年來(lái)，一些漸為成熟的分子生物學(xué)技術(shù)在環(huán)境微生物學(xué)得到應(yīng)用Bernard L，Courties C，Duperray C，et al.A new approach to determine thegenetic diversity of viabale and active bacteria in aquatic ecosystems.Cytometry，2001；43(4)314-321，如分子標(biāo)記技術(shù)、凝膠電泳技術(shù)、克隆技術(shù)、原位雜交技術(shù)等，使人們可以避開(kāi)傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)過(guò)程而直接探討自然界中微生物的種群結(jié)構(gòu)及其與環(huán)境的關(guān)系，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)的微生物生態(tài)學(xué)方法的不足。
但是應(yīng)用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)這一分子生物學(xué)方法對(duì)廢水生物處理系統(tǒng)中功能菌的定量檢測(cè)，還未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于以廢水處理系統(tǒng)中功能菌的DNA特異片段作為檢測(cè)的靶序列，應(yīng)用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)體外擴(kuò)增，建立一種操作簡(jiǎn)單，能夠快速、準(zhǔn)確檢測(cè)廢水處理系統(tǒng)中功能菌含量的技術(shù)，其具體檢測(cè)步驟如下第一步，特異DNA片段的選擇。根據(jù)處理不同廢水的功能菌株，選擇適合的DNA特異片段。
第二步，提取總DNA。提取廢水生物處理系統(tǒng)中微生物的總DNA，并用核酸測(cè)定儀測(cè)定其含量(μg/mL)。
第三步，引物和探針的設(shè)計(jì)合成。根據(jù)選定的功能菌的DNA特異序列和引物探針設(shè)計(jì)合成原則，設(shè)計(jì)合成一對(duì)功能菌特異的引物和一條Taqman探針。
第四步，標(biāo)準(zhǔn)曲線制定。用已知初始拷貝數(shù)的靶DNA模板按10倍梯度進(jìn)行稀釋，制成標(biāo)準(zhǔn)模板系列，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。將引物、探針、耐熱DNA聚合酶、dNTP底物、模板DNA、鎂離子、PCR緩沖液、超純水等混勻成反應(yīng)體系，在定量熱循環(huán)儀上進(jìn)行高溫、低溫、中溫的反復(fù)熱循環(huán)和熒光檢測(cè)，進(jìn)行25-45個(gè)熱循環(huán)。在此過(guò)程中，熒光定量PCR儀與含控制分析軟件的計(jì)算機(jī)連接，進(jìn)行自動(dòng)讀取各個(gè)反應(yīng)管的每個(gè)循環(huán)后的熒光值和繪制熒光變化曲線，讀取每個(gè)反應(yīng)的Ct值(樣品管中熒光強(qiáng)度增加到某一特定閾值(threshold)時(shí)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù))。以Ct值為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)模板起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)作圖，得到該樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果其相關(guān)系數(shù)大于0.96，則作為檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)應(yīng)的反應(yīng)體系作為檢測(cè)樣品用的反應(yīng)體系。
第五步，功能菌樣品的熒光定量PCR測(cè)定。采用與獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的反應(yīng)體系，對(duì)各個(gè)樣品分別進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，測(cè)定樣品的Ct值。
第六步，功能菌含量計(jì)算。根據(jù)樣品的Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算功能菌含量。利用以下公式計(jì)算Nx＝N0×YCto-Ctx其中Nx為擴(kuò)增管x的靶基因的起始拷貝數(shù)，即被檢測(cè)的功能菌個(gè)數(shù)。
N0為標(biāo)準(zhǔn)曲線上的一點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的拷貝數(shù)。
Y為擴(kuò)增效率，由公式Y(jié)＝101/ΔCt(ΔCt＝靶DNA每稀釋10倍，平均增加的Ct值數(shù))計(jì)算獲得；相當(dāng)于Ct值減少1個(gè)循環(huán)對(duì)應(yīng)的模板DNA的增加的倍數(shù)。
Ctx為擴(kuò)增管x的靶基因的Ct值。
Ct0為標(biāo)準(zhǔn)曲線上靶基因拷貝數(shù)為N0時(shí)的Ct值。
廢水生物處理系統(tǒng)中功能菌數(shù)(個(gè)/mL)＝被檢測(cè)靶基因拷貝數(shù)(個(gè)/mL)。
由此可以反映功能菌在廢水生物處理系統(tǒng)中的生態(tài)地位。
第七步，試劑盒的裝配。依據(jù)上述方法步驟，將引物、探針、制定標(biāo)準(zhǔn)曲線用的功能菌不同稀釋倍數(shù)的DNA系列模板、耐熱DNA聚合酶、dNTP底物、模板DNA、鎂離子、PCR緩沖液、超純水，以及操作步驟說(shuō)明書、計(jì)算公式等裝配成廢水處理系統(tǒng)功能菌檢測(cè)試劑盒，可以方便應(yīng)用于實(shí)際檢測(cè)中。


下面結(jié)合

和具體實(shí)施方式
，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
圖1為QX-5基因梯度稀釋模板熒光定量PCR動(dòng)力學(xué)曲線。
圖2為QX-5基因熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線R2＝1。
具體實(shí)施例方式
有機(jī)工業(yè)廢水生物處理系統(tǒng)中，功能菌QX-5含量的測(cè)定。
1、材料菌株大腸桿菌菌株E.coli JM109和QX-5。
活性污泥樣本A，B，C，D，E，F(xiàn)，G；其中A、B、C、D、E樣品中投加有QX-5，對(duì)照F，G樣品中沒(méi)有投加QX-5。
2、樣本總DNA的提取和檢測(cè)取不同的活性污泥1mL，采用賽百盛公司“SBS樹脂基因組DNA快速提取試劑盒”提取，分別提取其DNA，得活性污泥DNA樣本A，B，C，D，E，F(xiàn)，G。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定每個(gè)樣本的DNA濃度，0.7％的瓊脂糖凝膠電泳、染色、觀察其純度并根據(jù)DNAMaker判別DNA分子的大小及一致性。
3、引物設(shè)計(jì)根據(jù)申請(qǐng)者已克隆的QX-5的特異DNA序列(已申請(qǐng)發(fā)明專利)分別設(shè)計(jì)其特異引物和探針，序列如下上游引物5′CCTGTTAATCGCCATTTCAT 3′下游引物5′GAAACGCTTTATCAAACGGTT 3′探針5′FAM-CAAGCCCCTTTGACCGTCACGAG-TAMRA 3′序列如下5 ′-ACCATGTATCTGC CCTTACGCATCCTTTACGACGAATTTATAGCC AAATTCTGGTGTAGATGGGGGAATGTTCTATTTTTCCCCGCAGTCTTCGTATATGAACCATTACCGTATTATCAGAACCGAAGAAATCCTCTCCCCA TTTACTGATGACGCGATTCGGATGCTGCAAGAAATAAGTCATCAACATAAGTTCTTTCGGAGTGAGCTCAATCGCCGCTCCGTTTTTCGTCAGCTCGGCA-3′4、標(biāo)準(zhǔn)曲線制作首先制備標(biāo)準(zhǔn)品DNA將經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證過(guò)的含有靶DNA的質(zhì)粒經(jīng)過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定濃度，并根據(jù)其分子量換算成質(zhì)?？截?μL。用TE稀釋成5×105拷貝/μL，5×104拷貝/μL，5×103拷貝/μL，5×102拷貝/μL，5×10拷貝/μL等5個(gè)濃度梯度，制成標(biāo)準(zhǔn)品DNA。
然后自每個(gè)稀釋模板中取樣2μl樣品，分別加入總體積30μL的反應(yīng)體系中，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。擴(kuò)增體系為1U TaqDNA聚合酶，1×Buffer，0.3mmol/L MgCl2，200μmol/L d NTPS，0.3μmol/L引物，0.3μmol/L探針和2μL模板DNA。擴(kuò)增程序預(yù)變性94℃3min；94℃變性20s，52℃退火30s，60℃延伸40s；于60℃時(shí)檢測(cè)收集熒光；共40個(gè)循環(huán)。分析每個(gè)標(biāo)本的擴(kuò)增曲線，獲得其Ct值。40循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，系統(tǒng)將采集到的每一循環(huán)反應(yīng)時(shí)的各反應(yīng)管的熒光強(qiáng)度增長(zhǎng)指數(shù)(DRn)進(jìn)行分析，繪制每一反應(yīng)管的擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線。根據(jù)動(dòng)力學(xué)曲線確定每個(gè)樣品管中熒光強(qiáng)度增加到某一特定閾值(threshold)時(shí)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(Ct值)。并根據(jù)各稀釋度的Ct值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。若相關(guān)系數(shù)大于0.96，認(rèn)為擬合滿意。
5、熒光定量PCR擴(kuò)增檢測(cè)分別用QX-5特異引物對(duì)上述提取獲得的DNA標(biāo)本進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，30μL擴(kuò)增體系組分如下1U TaqDNA聚合酶，1×Buffer，0.3mmol/LMgCl2，200μmol/L d NTPS，0.3μmol/L引物，0.3μmol/L探針和2μL模板DNA。擴(kuò)增程序預(yù)變性94℃3min；94℃變性20s，52℃退火30s，60℃延伸40s；于60℃時(shí)檢測(cè)收集熒光；共40個(gè)循環(huán)。分析每個(gè)標(biāo)本的擴(kuò)增曲線，獲得其Ct值。
6、測(cè)定結(jié)果本試驗(yàn)獲得的QX-5基因熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線R2＝1。見(jiàn)圖1、圖2。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，由公式Y(jié)＝101/ΔCt計(jì)算出Y＝1.78。
采用公式Nx＝N0×YCto-Ctx，根據(jù)每一個(gè)反應(yīng)的Ct值計(jì)算出每個(gè)擴(kuò)增管中功能菌特異基因的拷貝數(shù)，即獲得單位體積活性污泥中功能菌QX-5的個(gè)數(shù)為活性污泥A每毫升含8.4×108個(gè)QX-5，活性污泥B每毫升含3.6×108個(gè)QX-5，活性污泥C每毫升含3.0×106個(gè)QX-5，活性污泥D每毫升含1.3×108個(gè)QX-5，活性污泥E每毫升含1.7×107個(gè)QX-5，活性污泥F和G不含QX-5。結(jié)果見(jiàn)表1。
再根據(jù)每個(gè)標(biāo)本的DNA濃度計(jì)算出每μg混合DNA中功能菌特異基因的拷貝數(shù)，即獲知廢水處理生物系統(tǒng)中功能菌的相對(duì)含量，從而反映功能菌QX-5在廢水生物處理系統(tǒng)中的生態(tài)地位。
結(jié)果表明，通過(guò)對(duì)功能菌特異片段進(jìn)行熒光定量PCR測(cè)定，可以快速、準(zhǔn)確、有效地檢測(cè)廢水處理系統(tǒng)中功能菌的含量。
依據(jù)上述方法步驟，將QX-5引物、探針、制定標(biāo)準(zhǔn)曲線用的不同稀釋倍數(shù)的DNA系列模板、耐熱DNA聚合酶、dNTP底物、模板DNA、鎂離子、PCR緩沖液、超純水，以及操作步驟說(shuō)明書、計(jì)算公式等裝配成試劑盒，命名為有機(jī)工業(yè)廢水處理系統(tǒng)功能菌QX-5檢測(cè)試劑盒，應(yīng)用于實(shí)際投放了功能菌QX-5的廢水生物處理系統(tǒng)中QX-5的檢測(cè)中。
表1.不同活性污泥樣本Ct值和QX-5拷貝數(shù)

權(quán)利要求
1.一種快速測(cè)定廢水處理系統(tǒng)中功能菌含量的方法，包括功能菌特異DNA片段的選擇，微生物總DNA的提取，引物和探針的設(shè)計(jì)合成，標(biāo)準(zhǔn)曲線制定，功能菌樣品的熒光定量PCR測(cè)定，功能菌含量計(jì)算、試劑盒的裝配等步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速測(cè)定廢水處理系統(tǒng)中功能菌含量的方法，其特征是所述熒光定量PCR測(cè)定是將含有功能菌特異引物和探針、耐熱DNA聚合酶、dNTP底物、待檢測(cè)模板DNA、鎂離子、PCR緩沖液、超純水等的反應(yīng)體系在熒光定量PCR儀上進(jìn)行反復(fù)的高溫、低溫、中溫?zé)嵫h(huán)和熒光檢測(cè)而達(dá)到目的DNA片段大量擴(kuò)增和熒光信號(hào)的檢測(cè)記錄與分析，獲得待檢測(cè)模板DNA序列的定量結(jié)果。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速測(cè)定廢水處理系統(tǒng)中功能菌含量的方法，其特征是所述引物和探針的設(shè)計(jì)是依據(jù)不同功能菌特異DNA序列進(jìn)行設(shè)計(jì)和合成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速測(cè)定廢水處理系統(tǒng)中功能菌含量的方法，其特征是所述功能菌含量的計(jì)算是根據(jù)被測(cè)樣品中功能菌個(gè)數(shù)等于被檢測(cè)靶基因拷貝數(shù)進(jìn)行的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速測(cè)定廢水處理系統(tǒng)中功能菌含量的方法，其特征是所述試劑盒是依據(jù)本發(fā)明所述功能菌特異DNA體外擴(kuò)增技術(shù)，將引物、探針、制定標(biāo)準(zhǔn)曲線用的功能菌不同稀釋倍數(shù)的DNA系列模板、耐熱DNA聚合酶、dNTP底物、模板DNA、鎂離子、PCR緩沖液、超純水，以及操作步驟說(shuō)明書、計(jì)算公式等裝配而成，用于廢水處理系統(tǒng)功能菌的快速檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種快速測(cè)定廢水處理系統(tǒng)中功能菌含量的方法，包括功能菌特異DNA片段的選擇，微生物總DNA的提取，引物和探針的設(shè)計(jì)合成，標(biāo)準(zhǔn)曲線制定，功能菌樣品的熒光定量PCR測(cè)定，功能菌含量計(jì)算、試劑盒的裝配等步驟。該方法操作簡(jiǎn)單，能夠快速準(zhǔn)確檢測(cè)廢水中功能菌的含量。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK1987428SQ200510022360
公開(kāi)日2007年6月27日 申請(qǐng)日期2005年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月23日
發(fā)明者黃鈞, 馬欣榮, 李毅軍 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所