專利名稱：法醫(yī)昆蟲蠅類特異性擴增引物及鑒定方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物檢測及法醫(yī)鑒定技術領域，具體地說，是關于法醫(yī)昆蟲蠅類特異性擴增引物及鑒定方法。
背景技術：
法醫(yī)昆蟲學是近年來研究得較多的一門新興交叉學科，利用某些蠅類嗜尸性的特點，通過研究其發(fā)生規(guī)律、發(fā)育歷期及地理分布特點，為法醫(yī)鑒定提供必要的線索和依據(jù)。昆蟲在死亡尸體的物質循環(huán)中擔任重要的角色，根據(jù)它們在尸體上的生長發(fā)育和演替規(guī)律可以比較準確的推斷尸體死亡的時間。在破案的過程中，死亡時間是劃分嫌疑犯范圍的重要依據(jù)，此種方法將協(xié)助刑事偵察中法醫(yī)快速并精確鑒定死亡時間，從而縮小嫌疑者的范圍，提高破案的效率。近年國際上的法醫(yī)昆蟲學研究有很大發(fā)展，無論是在廣度還是在深度上都有廣泛的應用。
在法醫(yī)鑒定中，死亡時間(post-mortem interval，PMI)的推斷是首要解決的問題之一。死后間隔時間的準確推斷，取決于案發(fā)現(xiàn)場昆蟲標本采集及準確的種類鑒定，傳統(tǒng)的方法是通過形態(tài)特征來進行分類，這樣的工作只有少數(shù)專家在自己熟悉的領域中可以做到，一般的研究人員無法完成。而且許多案發(fā)現(xiàn)場采集的都是幼蟲標本，靠形態(tài)特征鑒定相對比較困難，有時采到的是蛹，鑒定的結果需待其發(fā)育為成蟲后進行確認，這樣無疑會延誤刑事案件的偵破，給實際工作帶來很大的困難。因此，迫切需要尋找一種快速，準確的鑒定方法來解決這個問題。如何將昆蟲學的知識直接、快速、有效應用到法醫(yī)檢驗工作中去，是法醫(yī)昆蟲學科發(fā)展更新的必然趨勢，在這門應運而起的交叉學科中，資源互補，優(yōu)勢共享將有助于提高偵查的科技含量。
Zietkiewicz等(Zietkiewicz，E.，Rafalski，A.，Genomics 20176-183.1994)提出了錨定SSR的新策略ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)，即簡單序列重復區(qū)間擴增多態(tài)性分子標記。這個方法是基于SSR(simlpe sequence repeat)微衛(wèi)星標記的一種簡便易行的操作方法，適合于對基因組背景沒有了解的物種，根據(jù)散布在真核生物基因組中的微衛(wèi)星本身設計通用引物，經(jīng)PCR擴增后檢測擴增片段長度多態(tài)性來區(qū)分鑒別不同的材料。由于引物具有通用性，所以在工作量和費用這兩個方面都有較大的優(yōu)勢。利用在基因組中常出現(xiàn)的SSR本身設計引物，通常為16-18個堿基序列，由1-4個堿基組成的串聯(lián)重復或是在串聯(lián)重復的3’或5’端加1-3個非重復的錨定堿基組成，從而保證引物與基因組DNA中SSR的5’或3’末端結合，擴增重復序列間間隔不太大的區(qū)段。SSR在DNA復制的過程中存在滑動和不均等交換現(xiàn)象，使得它們在不同品種或個體間的重復次數(shù)存在較大差異，從而易導致引物結合位點和兩結合位點間的片段長度產(chǎn)生差異。與其它的常規(guī)的分子標記RAPD、AFLP、SSR等相比，ISSR標記具有簡便、快捷、成本低、多態(tài)性高等特點，現(xiàn)已在種質資源鑒定、遺傳作圖、基因定位、遺傳多樣性、進化、系統(tǒng)發(fā)育、分子標記等研究方面被廣泛應用(Kebebew Assefa.Arnulf Merker and Hailu Tefera，Hereditas 139174-183.2003)。

發(fā)明內容
本發(fā)明的首要目的在于提供一類法醫(yī)昆蟲蠅類鑒定的特異性擴增引物。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種利用所述蠅類特異性擴增引物進行快速分子鑒定的方法。
本發(fā)明的又一個目的在于提供一種含有所述蠅類特異性擴增引物的鑒定用試劑盒。
為此，本發(fā)明立足昆蟲學研究的最新進展，采用錨定微衛(wèi)星方法ISSR(inter simplesequence repeat)，對上海地區(qū)經(jīng)常涉案的五種嗜尸性蠅類進行研究分析，并由此獲得可以鑒定相關蠅種的三對種特異性引物，其序列如下(1)SCAR標記C(大頭金蠅Chrysomya megacephala)正向引物5′-AATCGGTTACTTGCAATCTCA-3′反向引物5′-CGACAGTTGATGTTGTTTTCGTTTA-3′(2)SCAR標記D(肥須尻麻蠅Parasarcophaga crassipalpis)正向引物5′-CCACTGAACAAAGCGACG-3′反向引物5′-TTTTCTTCGCACGGCTTT-3′(3)SCAR標記E(家蠅Musca domestica)正向引物5′-AATGCTATCTGCCCCTCTTG-3′反向引物5′-CATTCCCACTTGTACTTTCGTT-3′本發(fā)明的法醫(yī)快速分子鑒定方法包括以下步驟A、對現(xiàn)場采集的標本進行常規(guī)的DNA抽提，得到的DNA為待鑒定樣品；B、利用以下三對蠅類特異性擴增引物對待鑒定樣品進行PCR擴增(1)SCAR標記C(大頭金蠅Chrysomya megacephala)正向引物5′-AATCGGTTACTTGCAATCTCA-3′
反向引物5′-CGACAGTTGATGTTGTTTTCGTTTA-3′(2)SCAR標記D (肥須尻麻蠅Parasarcophaga crassipalpis)正向引物5′-CCACTGAACAAAGCGACG-3′反向引物5′-TTTTCTTCGCACGGCTTT-3′(3)SCAR標記E (家蠅Musca domestica)正向引物5′-AATGCTATCTGCCCCTCTTG-3′反向引物5′-CATTCCCACTTGTACTTTCGTT-3′C、對擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳，根據(jù)200-500bp之間擴增條帶的有無判斷是否為相應種類。
其中，所述PCR擴增的條件為94℃預變性3分鐘，然后進入循環(huán)，94℃變性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環(huán)；最后72℃延伸5分鐘。
所述凝膠電泳采用1.0％Agarose凝膠，電壓為100V電泳30分鐘，在紫外光成像系統(tǒng)拍照檢測即可。
本發(fā)明的蠅類種特異性檢測試劑盒包括以下組分溶液AddH2O∶10×PCR buffer∶dNTPs＝40∶6∶1；溶液BTaq DNA聚合酶5U/μl；溶液C以下三對蠅類種特異性擴增引物中的任意一對、兩對或三對(1)SCAR標記C(大頭金蠅Chrysomya megacephala)正向引物5′-AATCGGTTACTTGCAATCTCA-3′反向引物5′-CGACAGTTGATGTTGTTTTCGTTTA-3′(2)SCAR標記D(肥須尻麻蠅Parasarcophaga crassipalpis)正向引物5′-CCACTGAACAAAGCGACG-3′反向引物5′-TTTTCTTCGCACGGCTTT-3′(3)SCAR標記E(家蠅Musca domestica)正向引物5′-AATGCTATCTGCCCCTCTTG-3′反向引物5′-CATTCCCACTTGTACTTTCGTT-3′檢測時，將溶液A與溶液B按照470∶6的比例混和均勻，取11μl然后加入2μl溶液C(稀釋至10pmol)和2μl待鑒定的DNA樣品(稀釋為10ng/μl)，組成15μl反應體系按照上述PCR熱循環(huán)程序進行擴增即可。
利用本發(fā)明的種特異性擴增引物可以在3小時內完成鑒定，因此可以用于特定蠅種的快速鑒定。
本發(fā)明的嗜尸性蠅類快速分子鑒定技術具有以下優(yōu)點1、能夠利用特異性引物對蠅類進行擴增并克服了其他方法如RAPD和RFLP等的穩(wěn)定性差的缺陷；在此之前尚沒有用錨定微衛(wèi)星篩選SCAR標記用于檢測鑒定的報道；2、篩選出的引物是嗜尸性蠅類種特異性引物，只有在相應種才能擴增出相應大小的片段，根據(jù)條帶的有無來作出鑒定；3、該方法可以對一頭蠅類幼蟲進行鑒定，單個幼蟲提取的DNA就可以達到很好的鑒定效果，大大克服了蠅類幼蟲形態(tài)鑒定的困難，縮短了法醫(yī)鑒定的周期；4、本發(fā)明的方法可以同時對多個樣本進行分析，提高工作效率；5、試劑盒產(chǎn)品將把不同種的特異性標記擴增產(chǎn)物轉化為大小不同的片段，做成像DNA Marker一樣的標準化產(chǎn)品。


圖1為一條ISSR引物(CA)6GT在五個種的成蟲及幼蟲材料中的PCR擴增圖譜，其中M為Marker，泳道1-6為一個種是絲光綠蠅，泳道7、8為巨尾阿麗蠅，泳道9-12為大頭金蠅，泳道13、14為大頭金蠅，泳道15、16為肥須尻麻蠅。
圖2為由ISSR引物篩選到的SCAR標記，即上面給出的三對引物進行PCR擴增的圖譜，其中M為Marker，泳道1、2為絲光綠蠅，泳道3、4為巨尾阿麗蠅，泳道5、6為大頭金蠅，泳道7、8為肥須尻麻蠅，泳道9、10為家蠅。
具體實施例方式
以下結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，應理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限定本發(fā)明的范圍。
上海地處我國東部，位于北亞熱帶東亞季風盛行的地區(qū)，屬亞熱帶海洋性季風氣候。氣候特點溫和、濕潤，雨量適中，已經(jīng)有記載的法醫(yī)昆蟲種類達到十幾種之多，并具有一定的地域性特點。其中，經(jīng)常涉案的嗜尸性蠅種有絲光綠蠅(Lucilia sericata)，巨尾阿麗蠅(Aldrichina grahami)，大頭金蠅(Chrysomya megacephala)，肥須尻麻蠅(Parasarcophagacrassipalpis)和家蠅(Musca domestica)等；這些昆蟲在案發(fā)現(xiàn)場經(jīng)常出現(xiàn)。結合國內外已有研究和本地區(qū)特點，我們選定以上五種蠅類為研究對象，采用ISSR方法對其DNA樣本進行分析。
實施例1、種特異性引物的獲得使用ISSR通用引物對絲光綠蠅(Lucilia sericata)，巨尾阿麗蠅(Aldrichina grahami)，大頭金蠅(Chrysomya megacephala)，肥須尻麻蠅(Parasarcophaga crassipalpis)和家蠅(Muscadomestica)五個蠅種的DNA樣品在PCR儀(Flexigene Thermal Cycler)上進行PCR擴增，其中DNA樣品的采集采用參考Zheng Z-M等的方法(Zheng Z-M，Huang G，Journal ofShanghai Normal University(Natural Science Edition).No.1，Vol.30，2002)引物1CACACACACACAGTPCR擴增的反應體系(15μl)如下10×PCR buffer 1.5μl引物 0.6μl(10pmol/μl)10mM dNTPs 0.25μlddH2O 10.0μlTaq DNA聚合酶0.15μl(5U/μl)模板DNA 2.0μl(10ng/μl)其中10×PCR反應緩沖液的組成如下200mM Tris-HCl；100mM (NH4)2SO4；100mM KCl；1％Triton X-100；20mM MgCl2；pH 9.0。
PCR反應按以下條件進行94℃預變性3分鐘，然后進入循環(huán)，94℃變性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環(huán)；最后72℃延伸5分鐘。
得到的擴增產(chǎn)物于2.0％Agarose凝膠上電泳，30分鐘后用EB染色，在紫外光下觀察并照相，其結果如圖1所示，引物在不同蠅種間擴增出不同的帶型模式，有的條帶只出現(xiàn)在大頭金蠅中擴增產(chǎn)物中(圖1中紅色框選定的片段)，而在其它蠅種中則無擴增結果。
切膠回收上述種特異性DNA片段，經(jīng)測序得到大頭金蠅種的一段DNA序列，根據(jù)這段種特異性DNA序列應用Primer Premier 5軟件(http://www.bioon.com/Soft/Class1/Class12/Index.html)設計大頭金蠅(Chrysomya megacephala)的特異性引物如下
SCAR標記C(大頭金蠅Chrysomya megacephala)正向引物5′-AATCGGTTACTTGCAATCTCA-3′反向引物5′-CGACAGTTGATGTTGTTTTCGTTTA-3′。
分別采用以下ISSR通用引物引物2AGAGAGAGAGAGAGAGTA引物3CACACACACACAGG以與上述相同的方法獲得肥須尻麻蠅Parasarcophaga crassipalpis和家蠅Muscadomestica的特異性擴增引物如下SCAR標記D(肥須尻麻蠅Parasarcophaga crassipailpis)正向引物5′-CCACTGAACAAAGCGACG-3′反向引物5′-TTTTCTTCGCACGGCTTT-3′SCAR標記E(家蠅Musca domestica)正向引物5′-AATGCTATCTGCCCCTCTTG-3′反向引物5′-CATTCCCACTTGTACTTTCGTT-3′。
由于這樣的引物來自于某個特異性的種，因此該引物理論上只能在相應的種內才能擴增出相應大小的片段，因此被稱為序列特異性擴增區(qū)域(SCAR，sequence-characterizedamplified region)標記。
實施例2、引物種特異性的驗證采用實施例1得到的三對嗜尸性蠅類特異性擴增引物，分別對大頭金蠅、肥須尻麻蠅和家蠅三個蠅種的DNA樣品(采集方法同實施例1)在PCR儀(Flexigene Thermal Cycler)上進行PCR擴增(擴增的具體條件同實施例1)。
得到的PCR擴增產(chǎn)物于1.0％Agarose凝膠上電泳檢測，在紫外光下觀察并照相，其結果如圖2所示。
從圖2的結果(圖中100bp以下的微弱條帶為引物二聚體，對鑒定結果無礙)可見，引物C只在大頭金蠅中擴增出相應大小的DNA片段，在其它蠅種中則沒有(A)；同樣，引物D只在肥須尻麻蠅中擴增出相應大小的DNA片段(B)，雖然B圖中在3、4及9、10泳道出現(xiàn)較大的微弱條帶，但由于我們的目的片段應該在200-500bp之間(本發(fā)明所涉及的三對SCAR標記的片段大小依次為247bp，227bp，366bp。由于我們選用的DNAMark為DL2000(Takara公司)，標記片段大小中500bp處有標志，而我們的目的片段又都大于200bp，所以就確定預期擴增片段的范圍為200-500bp)，所以這些弱帶視為非特異性擴增帶；而引物E則只在家蠅中擴增出相應大小的DNA片段(C)。
因此，本發(fā)明的三對種特異性擴增引物均可以用于特定蠅種的鑒定，且整個過程(擴增與電泳)的時間較短，在3個小時內即可完成，且經(jīng)過反復驗證，因而可以用于快速鑒定。
實施例3、檢測試劑盒的制備根據(jù)實施例2的結果，以實施例1得到的以下三對種特異性擴增引物SCAR標記C(大頭金蠅Chrysomya megacephala)正向引物5′-AATCGGTTACTTGCAATCTCA-3′反向引物5′-CGACAGTTGATGTTGTTTTCGTTTA-3′SCAR標記D(肥須尻麻蠅Parasarcophaga crassipalpis)正向引物5′-CCACTGAACAAAGCGACG-3′反向引物5′-TTTTCTTCGCACGGCTTT-3′SCAR標記E(家蠅Musca domestica)正向引物5′-AATGCTATCTGCCCCTCTTG-3′反向引物5′-CATTCCCACTTGTACTTTCGTT-3′制備針對大頭金蠅、肥須尻麻蠅和家蠅的快速檢測試劑盒。
制備試劑盒采用以下常規(guī)PCR中的常用試劑10×PCR bufferdNTPs(10mM)ddH2OTaq DNA聚合酶(5U/μl)其中，10×buffer的組成如下200mM Tris-HCl；100mM (NH4)2SO4；100mM KCl；1％Triton X-100；20mM MgCl2；pH 9.0。
試劑盒配方如下，將上述試劑按照一定的比例混和分別配制為A、B、C三種溶液，具體比例和濃度如下溶液AddH2O∶10×PCR buffer∶dNTPs＝40∶6∶1；溶液BTaq DNA聚合酶5U/μl；溶液C實施例1得到的三對種特異性擴增引物對中的任意一對、兩對或三對。
檢測時，以Zheng Z-M等的方法(Zheng Z-M，Huang G，Journal of Shanghai NormalUniversity(Natural Science Edition).No.1，Vol.30，2002)采集待檢測DNA樣品，制成10ng/μl的模板DNA；將溶液A與溶液B按照470∶6的比例混和均勻，取11μl，然后加入2μl溶液C(稀釋至10pmol)和2μl待鑒定的DNA樣品(稀釋為10ng/μl)，組成15μl PCR反應體系，接著按照實施例1的條件進行PCR擴增，最后將擴增產(chǎn)物于1.0％Agarose凝膠上電泳檢測，在紫外光下觀察，根據(jù)擴增片段的有無即可對特定蠅種進行鑒定。
權利要求
1.一種蠅類鑒定種特異性擴增引物，其特征在于，選自以下任意一對引物I、正向引物5′-AATCGGTTACTTGCAATCTCA-3′反向引物5′-CGACAGTTGATGTTGTTTTCGTTTA-3′；II、正向引物 5′-CCACTGAACAAAGCGACG-3′反向引物 5′-TTTTCTTCGCACGGCTTT-3′；III、正向引物 5′-AATGCTATCTGCCCCTCTTG-3′反向引物 5′-CATTCCCACTTGTACTTTCGTT-3′。
2.如權利要求1所述的蠅類鑒定特異性擴增引物，其特征在于，其中引物對I對應的特定蠅種為大頭金蠅。
3.如權利要求1所述的蠅類鑒定特異性擴增引物，其特征在于，其中引物對II對應的特定蠅種為肥須尻麻蠅。
4.如權利要求1所述的蠅類鑒定特異性擴增引物，其特征在于，其中引物對III對應的特定蠅種為家蠅。
5.一種蠅類快速分子鑒定的方法，其特征在于，包括以下步驟A、利用以下三對蠅類種特異性擴增引物中的任意一對、兩對或三對引物對待鑒定蠅種的DNA樣品進行PCR擴增I、正向引物5′-AATCGGTTACTTGCAATCTCA-3′反向引物5′-CGACAGTTGATGTTGTTTTCGTTTA-3′；II、正向引物 5′-CCACTGAACAAAGCGACG-3′反向引物 5′-TTTTCTTCGCACGGCTTT-3′；III、正向引物 5′-AATGCTATCTGCCCCTCTTG-3′反向引物 5′-CATTCCCACTTGTACTTTCGTT-3′；B、擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳，根據(jù)200-500bp之間擴增條帶的有無鑒定特定的蠅種。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述A步驟種PCR擴增的條件如下PCR擴增的反應體系(15μl)10×PCRbuffer1.5μl10pmol/μl引物對 各0.6μl10mM dNTPs 0.25μlddH2O 10.0μl5U/μl Taq DNA聚合酶 0.15μl10ng/μl模板DNA2.0μl其中10×buffer的組成如下200mM Tris-HCl；100mM(NH4)2SO4；100mM KCl；1％Triton X-100；20mM MgCl2；pH9.0；PCR反應按以下條件進行
94℃預變性3分鐘，然后進入循環(huán)，94℃變性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環(huán)；最后72℃延伸5分鐘。
7.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟B中凝膠電泳采用1.0％Agarose凝膠電泳。
8.如權利要求5所述的方法，其特征在于，其中引物對I對應的特定蠅種為大頭金蠅。
9.如權利要求5所述的方法，其特征在于，其中引物對II對應的特定蠅種為肥須尻麻蠅。
10.如權利要求5所述的方法，其特征在于，其中引物對III對應的特定蠅種為家蠅。
11.一種蠅類快速鑒定的檢測試劑盒，其特征在于，含有以下組分溶液AddH2O∶10×PCR buffer∶dNTPs＝40∶6∶1；溶液BTaq DNA聚合酶5U/μl；溶液C以下三對蠅類種特異性擴增引物中的任意一對、兩對或三對I、正向引物 5′-AATCGGTTACTTGCAATCTCA-3′反向引物 5′-CGACAGTTGATGTTGTTTTCGTTTA-3′；II、正向引物 5′-CCACTGAACAAAGCGACG-3′反向引物 5′-TTTTCTTCGCACGGCTTT-3′；III、正向引物 5′-AATGCTATCTGCCCCTCTTG-3′反向引物 5′-CATTCCCACTTGTACTTTCGTT-3′。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蠅類鑒定種特異性擴增引物，利用該引物對特定蠅種進行鑒定的方法以及含有該種特異性擴增引物的鑒定用檢測試劑盒。利用本發(fā)明的蠅類種特異性擴增引物可以在三小時內完成鑒定，因此可以用于特定蠅種的快速鑒定。
文檔編號C12Q1/68GK1687453SQ20051002447
公開日2005年10月26日 申請日期2005年3月18日 優(yōu)先權日2005年3月18日
發(fā)明者吳虹, 何琳, 苗雪霞, 黃勇平 申請人:中國科學院上海生命科學研究院