專利名稱：基于蛋白相互作用的Ryanodine受體活性鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于蛋白相互作用的Ryanodine受體(RyR)活性的鑒定方法，將分離純化的RyR稀釋、加入RyR的激活劑，在溶液體系中測(cè)定處于不同功能狀態(tài)的RyR的聚集狀態(tài)，從而鑒定RyR的活性狀況。屬于生物化學(xué)/生物物理技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
RyR是位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的一種鈣釋放通道。RyR是由四個(gè)相同的亞基組成的寡聚蛋白，每個(gè)亞基的分子量大約為550-KDa，是目前已知的最大的離子通道。哺乳動(dòng)物的RyR有三種亞型，依次是RyR1，RyR2，RyR3，分別由三個(gè)基因編碼。RyR廣泛參與細(xì)胞的鈣釋放過程，其中RyR1和RyR2分別在骨骼肌和心肌細(xì)胞的興奮-收縮偶聯(lián)中發(fā)揮重要作用。
為了進(jìn)一步研究RyR的結(jié)構(gòu)和功能，人們通常需要將RyR分離純化(Lai FA，and Meissner G.Purification and reconstitution of the ryanodine-sensitive Ca2+release channel complex from muscle sarcoplasmic reticulum.Methods.Mol.Biol.，1992，13287-305)。由于RyR結(jié)構(gòu)龐大，極易水解，在分離純化的過程中容易失活。因此純化的RyR通常需要進(jìn)行活性鑒定后才能進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。目前，鑒定純化RyR活性的方法主要有兩種1.單通道記錄。這種方法是將純化的RyR重組到人工脂雙層中，記錄通過單個(gè)通道的微小的電流信號(hào)(pA級(jí))(Marx SO，Ondrias K，and Marks AR.Coupledgating between individual skeletal muscle Ca2+release channels(Ryanodinereceptors).Science，1998，281818-821)。在RyR激活劑存在的情況下，通道的開放時(shí)間和開放頻率都大大增加；而在RyR抑制劑存在的情況下，通道的開放時(shí)間和開放頻率大大降低。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是直觀和確定。缺點(diǎn)是設(shè)備昂貴，操作難度大，由于測(cè)定的是pA級(jí)的電流，出現(xiàn)假信號(hào)的幾率較大，需要經(jīng)過專門培訓(xùn)的專業(yè)技術(shù)人員才能完成測(cè)定；而且這種方法測(cè)定的是某一個(gè)/幾個(gè)RyR的活性，不能對(duì)純化的RyR的總體活性作出評(píng)價(jià)。
2.[3H]ryanodine結(jié)合實(shí)驗(yàn)。Ryanodine是一種植物堿。在極低的濃度時(shí)(nM)，ryanodine易于與開放狀態(tài)的RyR結(jié)合而不影響通道功能狀態(tài)，因此[3H]ryanodine和RyR的結(jié)合值是反映RyR功能狀態(tài)的一個(gè)很好的指標(biāo)(Pessah IN，Stambuk RA，and Casida JE.Ca2+-activated ryanodine bindingmechanisms of sensitivity andintensity modulation by Mg2+，caffeine，and adenine nucleotides.Mol.Pharmacol.，1987，31232-238)。在絕大多數(shù)情況下結(jié)合值的變化與單通道記錄的受體活性狀態(tài)變化是一致的。因而[3H]ryanodine結(jié)合已經(jīng)被廣泛用于RyR的功能研究。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是能對(duì)純化RyR的總體活性作出評(píng)價(jià)，缺點(diǎn)是需要使用同位素[3H]標(biāo)記的ryanodine進(jìn)行測(cè)定，不可避免地對(duì)操作人員造成一定的身體損害；實(shí)驗(yàn)過程長(zhǎng)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)通常需要1～2天；而且同位素定量測(cè)定需要昂貴的液閃計(jì)數(shù)儀。
總的說來，上述兩種方法雖然能鑒定純化RyR的活性，但是由于設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜，推廣具有一定的困難性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種基于蛋白相互作用的Ryanodine受體活性鑒定方法，步驟簡(jiǎn)單，能對(duì)RyR的總體活性作出評(píng)價(jià)，而且不需要專門的檢測(cè)設(shè)備，利用實(shí)驗(yàn)室多種常規(guī)儀器即能完成檢測(cè)，實(shí)用性強(qiáng)。
為實(shí)現(xiàn)這樣的目的，本發(fā)明在接近生理離子強(qiáng)度下，在含有一定量的純化RyR樣品中加入RyR的激活劑，通過調(diào)控RyR的功能狀態(tài)來調(diào)控RyR的不同構(gòu)象和RyR-RyR之間的相互作用。而在溶液體系中，RyR相互作用的差異可以通過RyR聚集狀態(tài)的改變靈敏地反映出來。因此將處于不同功能狀態(tài)的RyR樣品孵育一段時(shí)間后，可通過檢測(cè)不同功能狀態(tài)的RyR的聚集程度來檢測(cè)RyR的活性。
本發(fā)明的方法具體包括如下步驟1.稀釋純化RyR。通常純化的RyR原液中含有50～200μg/ml RyR，1M KCl，20mM K-pipes。應(yīng)用稀釋溶液(含28mM KCl-22mM NaCl，20mM Pipes，pH7.1)將RyR原液稀釋10倍，得到用于測(cè)定RyR活性的樣品。樣品中含有5～20μg/ml RyR，130mM KCl-20mM NaCl，20mM Pipes，pH7.1。
2.調(diào)控RyR活性。RyR原液稀釋后，立即在RyR樣品中加入1-100μM Ca2+，或/和1-10mM AMP的RyR激活劑，立即混勻，使RyR處于激活狀態(tài)。
3.孵育RyR樣品。經(jīng)步驟2處理的RyR樣品在20℃～25℃孵育30～60分鐘，促進(jìn)RyR聚集物的形成。
4.檢測(cè)RyR樣品的聚集狀態(tài)。孵育后的樣品，應(yīng)用一些實(shí)驗(yàn)室常規(guī)手段，如光子相關(guān)光譜法、原子力顯微鏡、電子顯微鏡等觀察不同活性狀態(tài)下RyR的聚集狀態(tài)。
本發(fā)明方法步驟簡(jiǎn)單，實(shí)用性強(qiáng)，能對(duì)RyR的總體活性作出評(píng)價(jià)，而且不需要專門的檢測(cè)設(shè)備，利用實(shí)驗(yàn)室多種常規(guī)儀器即能完成檢測(cè)，具有推廣價(jià)值。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例1制備的樣品利用光子相關(guān)光譜法(PCS，所用儀器為Zetasizer 3000HSA，Marlvern Co.Ltd，UK)對(duì)聚集狀態(tài)的檢測(cè)結(jié)果。
圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中制備的樣品利用原子力顯微鏡(AFM，所用儀器為Nanoscope IIIa-MultiMode AFM，Veeco Instruments，USA)的觀察結(jié)果。
圖3為對(duì)本發(fā)明實(shí)施例1制備的樣品利用原子力顯微鏡觀察的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
圖4為本發(fā)明實(shí)施例2制備的樣品利用光子相關(guān)光譜法對(duì)聚集狀態(tài)的檢測(cè)結(jié)果。
圖5為本發(fā)明實(shí)施例3制備的樣品利用光子相關(guān)光譜法對(duì)聚集狀態(tài)的檢測(cè)結(jié)果。
圖6為本發(fā)明實(shí)施例應(yīng)用光子相關(guān)光譜法的檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)的[3H]ryanodine結(jié)合實(shí)驗(yàn)對(duì)RyR活性的檢測(cè)結(jié)果的比較。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步描述。
實(shí)施例1RyR原液經(jīng)含28mM KCl-22mM NaCl，20mM Pipes，pH7.1的溶液稀釋10倍，樣品中RyR的終濃度為10μg/ml，加入激活劑50μM Ca2+，使RyR處于半激活狀態(tài)，隨后RyR樣品經(jīng)20℃孵育30分鐘后，利用光子相關(guān)光譜法和原子力顯微鏡分別對(duì)RyR樣品的聚集程度進(jìn)行檢測(cè)。
光子相關(guān)光譜法實(shí)驗(yàn)方法孵育后的RyR樣品0.5ml，倒入樣品測(cè)試杯中進(jìn)行PCS測(cè)定。所有的樣品都在20℃進(jìn)行PCS測(cè)定。溶劑和蛋白的散射系數(shù)分別設(shè)置為1.330和1.520。溶劑的粘度設(shè)置為1.00。選擇Auto-COTIN模式分析數(shù)據(jù)。每個(gè)樣品至少重復(fù)測(cè)定4次。根據(jù)PCS提供的參數(shù)(平均水化半徑)對(duì)樣品聚集程度進(jìn)行定量表征。平均水化半徑越大，說明樣品的聚集程度越高。光子相關(guān)光譜法的檢測(cè)結(jié)果見附圖1。當(dāng)RyR樣品中無激活劑(0Ca2+，0AMP)，RyR處于抑活狀態(tài)，RyR樣品檢測(cè)到的平均水化半徑為67.8±3.0nm(n＝12)，說明樣品的聚集程度高。當(dāng)RyR樣品中存在激活劑50μM Ca2+，RyR樣品的平均水化半徑為49.6±1.2nm(n＝10)，說明樣品的聚集程度隨著RyR被Ca2+的激活而下降。
原子力顯微鏡法實(shí)驗(yàn)方法取10μl孵育好的RyR樣品滴于Parafilm膜上，將新解理的云母片覆蓋在上面，吸附3-5分鐘，用大量去離子水沖洗云母表面，干燥后在空氣中應(yīng)用原子力顯微鏡觀察，并對(duì)RyR聚集物的大小和數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)施例2應(yīng)用原子力顯微鏡的檢測(cè)結(jié)果見附圖2和附圖3。如圖2a所示當(dāng)RyR樣品中沒有Ca2+存在的情況下，RyR處于關(guān)閉狀態(tài)，圖中可觀察到由20～50個(gè)RyR相連的大聚集物；如圖2b所示當(dāng)RyR樣品中存在50μM Ca2+的情況下，RyR處于激活狀態(tài)，RyR在溶液中形成的聚集物較小，通常由2～6個(gè)RyR連接而成。圖3是對(duì)0Ca2+或50μM Ca2+存在情況下得到的25個(gè)AFM成像區(qū)域(5μm×5μm)的聚集物的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。在0Ca2+或50μM Ca2+存在情況下，聚集物的總數(shù)分別是721個(gè)、531個(gè)。在0Ca2+情況下，由5～10個(gè)RyR和＞10個(gè)RyR形成的聚集物在總聚集物中的百分比分別是27％和8％；而在50μMCa2+存在情況下，由5～10個(gè)RyR和＞10個(gè)RyR形成的聚集物在總聚集物中的百分比分別是16％和4％。很明顯，在RyR激活的情況下，RyR的聚集程度顯著降低。因此，應(yīng)用原子力顯微鏡和光子相關(guān)光譜法檢測(cè)得到了一致的結(jié)果，即RyR的聚集程度會(huì)隨著RyR激活而下降。
實(shí)施例2RyR原液經(jīng)含28mM KCl-22mM NaCl，20mM Pipes，pH7.1的溶液稀釋10倍，樣品中RyR的終濃度為10μg/ml，加入激活劑5mM AMP，使RyR處于半激活狀態(tài)，隨后RyR樣品經(jīng)20℃孵育30分鐘后，利用光子相關(guān)光譜法對(duì)RyR樣品的聚集程度進(jìn)行檢測(cè)。光子相關(guān)光譜法的實(shí)驗(yàn)方法與實(shí)施例1相同。光子相關(guān)光譜法的檢測(cè)結(jié)果見附圖4。當(dāng)RyR樣品中無激活劑(0Ca2+，0AMP)，RyR處于抑活狀態(tài)，RyR樣品檢測(cè)到的平均水化半徑為67.8±3.0nm(n＝12)，說明樣品的聚集程度高。當(dāng)RyR樣品中存在激活劑5mM AMP時(shí)，RyR樣品的平均水化半徑為51.1±1.6nm(n＝8)，說明RyR樣品的聚集程度也隨著RyR被AMP激活而下降。
實(shí)施例3RyR原液經(jīng)含28mM KCl-22mM NaCl，20mM Pipes，pH7.1的溶液稀釋10倍，樣品中RyR的終濃度為10μg/ml，同時(shí)加入激活劑5mM AMP和50μM Ca2+，使RyR處于完全激活狀態(tài)，隨后RyR樣品經(jīng)20℃孵育30分鐘后，利用光子相關(guān)光譜法對(duì)RyR樣品的聚集程度進(jìn)行檢測(cè)。光子相關(guān)光譜法的實(shí)驗(yàn)方法與實(shí)施例1相同。光子相關(guān)光譜法的檢測(cè)結(jié)果見附圖5。當(dāng)RyR樣品中無激活劑(0Ca2+，0AMP)，RyR處于抑活狀態(tài)，RyR樣品檢測(cè)到的平均水化半徑為67.8±3.0nm(n＝12)，說明樣品的聚集程度高。當(dāng)RyR樣品中同時(shí)存在激活劑5mM AMP和50μM Ca2+時(shí)，RyR樣品的平均水化半徑下降到38.1±0.8nm(n＝12)，說明樣品的聚集程度隨著RyR的完全激活而下降到更低水平。
實(shí)施例1-3說明RyR樣品的聚集程度隨著RyR的激活而下降。因此通過檢測(cè)處于不同功能狀態(tài)的RyR的聚集程度就可以鑒定RyR樣品的活性。為了驗(yàn)證我們這種鑒定活性的方法的可靠性，我們將我們的光子相關(guān)光譜法的檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)的[3H]ryanodine結(jié)合實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。如圖6所示分別在無激活劑(0Ca2+，0AMP)、單一激活劑5mM AMP、單一激活劑50μM Ca2+、兩種激活劑5mM AMP和50μM Ca2+存在的情況下，傳統(tǒng)的[3H]ryanodine結(jié)合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到的Ryanodine結(jié)合值隨著RyR的激活逐漸升高，而PCS檢測(cè)到的平均水化半徑隨著RyR的激活逐漸下降，進(jìn)一步說明RyR的聚集程度與RyR的活性呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)性。因此通過檢測(cè)RyR聚集程度與RyR功能狀態(tài)的相關(guān)性就可以鑒定RyR的活性。
權(quán)利要求
1.一種基于蛋白相互作用的Ryanodine受體活性鑒定方法，其特征在于包括如下步驟1)稀釋純化RyR應(yīng)用含28mM KCl-22mM NaCl，20mM Pipes，pH7.1的稀釋溶液將RyR原液稀釋10倍，得到用于測(cè)定RyR活性的樣品，樣品中含有5～20μg/ml RyR，130mM KCl-20mM NaCl，20mM Pipes，pH7.1；2)調(diào)控RyR活性立即在稀釋后的RyR樣品中加入1-100μM Ca2+，或/和1-10mMAMP的RyR激活劑，立即混勻，使RyR處于激活狀態(tài)；3)孵育RyR樣品經(jīng)步驟2處理的RyR樣品在20℃～25℃孵育30～60分鐘，促進(jìn)RyR聚集物的形成；4)檢測(cè)RyR樣品的聚集狀態(tài)對(duì)孵育后的樣品，應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室常規(guī)手段觀察不同活性狀態(tài)下RyR的聚集狀態(tài)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的基于蛋白相互作用的Ryanodine受體活性鑒定方法，其特征在于所述觀察RyR聚集狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)室常規(guī)手段為光子相關(guān)光譜法、原子力顯微鏡或電子顯微鏡。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于蛋白相互作用的Ryanodine受體活性鑒定方法，在接近生理離子強(qiáng)度下，在含有一定量的純化RyR樣品中加入RyR的激活劑，通過調(diào)控RyR的功能狀態(tài)來調(diào)控RyR的不同構(gòu)象和RyR－RyR之間的相互作用。而在溶液體系中，RyR相互作用的差異可以通過RyR聚集狀態(tài)的改變靈敏地反映出來。因此將處于不同功能狀態(tài)的RyR樣品孵育一段時(shí)間后，可通過檢測(cè)不同功能狀態(tài)的RyR的聚集程度來檢測(cè)RyR的活性。本發(fā)明方法實(shí)用性強(qiáng)，步驟簡(jiǎn)單，能對(duì)RyR的總體活性作出評(píng)價(jià)，而且不需要專門的檢測(cè)設(shè)備，利用實(shí)驗(yàn)室多種常規(guī)儀器即能完成檢測(cè)，具有推廣價(jià)值。
文檔編號(hào)C12Q1/00GK1657937SQ20051002458
公開日2005年8月24日 申請(qǐng)日期2005年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月24日
發(fā)明者胡曉芳, 梁鑫, 陳克櫻, 李鑫輝, 徐宇虹, 胡鈞 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)