專利名稱：檢測飼料中牛羊成分的方法和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及檢測領域，更具體地涉及可用于檢測飼料中的牛源性/羊源性成分的核苷酸序列和以此序列為基礎檢測飼料中的牛源性/羊源性成分的方法。
背景技術：
近年來，國際上對動物源食品的安全性問題日益重視。我國農業(yè)部也先后發(fā)布了一些規(guī)定明令禁止從英國等瘋牛病病源國進口反芻動物肉食品和肉骨粉，以及禁止使用反芻類動物源性蛋白飼料的規(guī)定。
目前國內外主要采用酶鏈免疫吸附(ELISA)、普通PCR、巢式PCR、免疫-PCR等方法檢測飼料中牛羊源性成分(Multiplex polymerase chain reactionmethod for detection of bovine materials in foodstuffs，Gao HW，ZhangDB，Pan AH，Liang WQ，Liang CZ.J AOAC Int.2003 Jul-Aug；86(4)764-7；Development of a PCR assay for the detection of animal tissues inruminant feeds.Bottero MT，Dalmasso IA，Nucera D，Turi RM，Rosati S，Squadrone S，Goria M，Civera T.J Food Prot.2003 Dec；66(12)2307-12.)，這類方法，后續(xù)分析過程繁瑣；靈敏度不夠高；容易產生假陽性結果，造成誤讀；且定量誤差大。例如，普通PCR法檢測牛羊成分不僅耗時長，而且還需采用電泳、染色、酶切、測序等方法進行后續(xù)分析，無法滿足日常的快速、高靈敏度等的檢測要求。
為了進一步加強對飼料加工企業(yè)、畜牧養(yǎng)殖業(yè)中加工和使用的飼料中牛羊成分的管理和監(jiān)測，確保廣大市民食用“放心肉”，促進飼料加工業(yè)健康發(fā)展，本領域迫切需要開發(fā)靈敏度更高、特異性更好、操作更簡便地檢測飼料中的牛源性/羊源性成分的方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的就是提供一種快速定性和定量檢測飼料中的牛源性/羊源性成分的方法和試劑盒。
本發(fā)明的另一目的是提供快速定性和定量檢測飼料中的牛源性/羊源性成分的遺傳標記。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種用于檢測飼料中的牛源性和/或羊源性成分的遺傳標記物，其特征在于，它具有SEQ ID NO1和/或2中連續(xù)的300-900個核苷酸。
在另一優(yōu)選例中，所述的遺傳標記物具有SEQ ID NO1或2中連續(xù)的500-800核苷酸。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于檢測飼料中的牛源性和/或羊源性成分的寡核苷酸，其長度為14-35個核苷酸，且其序列與SEQ ID NO1或2所示的序列相同或互補。
在另一優(yōu)選例中，所述的寡核苷酸的長度為20-30個核苷酸。
在另一優(yōu)選例中，所述的寡核苷酸是引物或探針，并且所述的引物可擴增出對應于SEQ ID NO1或2的PCR擴增產物(擴增產物的長度通常為150-800bp或更長)，更佳地所述的寡核苷酸選自SEQ ID NO3-7。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種檢測飼料中的牛源性和/或羊源性成分的試劑盒，它含有容器以及位于容器中的特異性擴增牛羊成分遺傳標記物的引物對，所述的引物長度為14-35個核苷酸，其中一個引物的序列與SEQ ID NO1所示的序列相同，且另一個引物的序列與SEQ ID NO1所示的序列互補，并且所述引物擴增出長度為300-1000bp的擴增產物；或者一個引物的序列與SEQ ID NO2所示的序列相同，且另一個引物的序列與SEQ IDNO2所示的序列互補，并且所述引物擴增出長度為300-1000bp的擴增產物。
在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還含有探針，所述探針的長度為14-18bp左右，且該探針的序列與SEQ ID NO1或2所示的序列相同或互補。
在另一優(yōu)選例中，所述引物對選自下組SEQ ID NO3-4；并且所述的探針是選自下組的一種或多種SEQ ID NO5、6、7。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種檢測樣品中的牛源性和/或羊源性成分的方法，它包括步驟(a)抽提樣品的DNA；(b)將抽提的DNA作為模板，用特異性擴增牛羊成分遺傳標記物的引物對進行PCR擴增，其中所述的引物長度為14-35個核苷酸，且一個引物的序列與SEQ ID NO1所示的序列相同，且另一個引物的序列與SEQ ID NO1所示的序列互補，并且所述引物擴增出長度為300-1000bp的擴增產物；或者一個引物的序列與SEQ ID NO2所示的序列相同，且另一個引物的序列與SEQ ID NO2所示的序列互補，并且所述引物擴增出長度為300-1000bp的擴增產物；(c)檢測擴增產物是否存在，存在擴增產物就表示樣品中存在牛羊成分。
在另一優(yōu)選例中，所述的步驟(c)是同時通過用牛特異性探針、羊特異性探針或牛羊通用探針與目標序列DNA的特異性結合及引物對與目標序列的特異性結合來確定樣品中存在牛羊成分，其中，與牛特異性探針結合表示存在牛成分，與羊特異性探針結合表示存在羊成分，與牛羊通用探針結合表示存在牛成分和羊成分中至少一種成分；此外，步驟(c)還包括通過檢測熒光信號的強弱來定性定量檢測樣品中的飼料中的牛源性/羊源性成分。


圖1顯示了牛D-Loop區(qū)，其中第476-899位為D-Loop區(qū)。其中用下劃線標出了特異性核苷酸探針和各探針確切位置。
圖2顯示了羊D-Loop區(qū)，其中第1-1212位為D-Loop區(qū)。其中用下劃線標出了特異性核苷酸探針和各探針確切位置。
圖3顯示了羊探針的線性回歸曲線。
圖4顯示了牛探針的線性回歸曲線。
具體實施例方式
本發(fā)明人經過深入而廣泛的研究，首次發(fā)現(xiàn)了牛羊的D-Loop區(qū)的序列，特別適合作為檢測牛羊成分的特征性的遺傳標記物。在該遺傳標記物的基礎上，開發(fā)了特異性擴增飼料中的牛源性/羊源性成分遺傳標記物或其片段的引物和試劑盒，從而首次實現(xiàn)了對飼料中的牛源性/羊源性成分的快速檢測。
如本文所用，術語“牛羊特異性引物(對)”指這樣的引物(對)，它能夠特異性結合于牛和羊的D-loop區(qū)核苷酸序列，并擴增出含D-loop區(qū)核苷酸序列的擴增產物。
如本文所用，術語“牛特異性探針”指能夠結合于牛的模板DNA，但不結合于羊的模板DNA的探針。
如本文所用，術語“羊特異性探針”指能夠結合于羊的模板DNA，但不結合于牛的模板DNA的探針。
如本文所用，術語“牛羊通用探針”指既能夠結合于牛的模板DNA，又能夠結合于羊的模板DNA的探針。
如本文所用，術語“牛源性/羊源性成分”，“牛源性和/或羊源性成分”以及“牛羊成分”可互換使用，都指來源于牛和/或羊的成分。較佳地，所述的牛羊成分含有核酸物質。
本發(fā)明的主要理論基礎是牛、羊、豬、雞、魚、馬等動物雖然在進化上極為接近，但是在D-Loop區(qū)域之間卻有較為明顯的多態(tài)性，而且這種多態(tài)性不僅特別適合用于將牛羊區(qū)別于其他動物(包括哺乳動物)，而且還特別適合進一步將牛和羊區(qū)分開，因此特別適用于檢測樣品(包括飼料樣品)中是否存在牛羊成分。
基于D-Loop區(qū)，發(fā)明人設計出多種核酸分子引物和探針。用這些引物和探針，發(fā)明人建立了快速、準確檢測和定量計數(shù)飼料中的牛源性/羊源性成分的分子生物學方法。
本發(fā)明所提供的用于飼料中的牛源性/羊源性成分檢測的遺傳標記，其核苷酸序列(SEQ ID NO3-7)位于D-Loop區(qū)中。其全序列及結構特征如SEQ ID NO1-2和圖1-2所示。該序列可用PCR法(如實施例1)得到；或者按該序列的核苷酸組成和順序，在商業(yè)化的DNA自動合成儀上按常規(guī)方法合成得到。
應理解，牛羊的D-Loop區(qū)在自然界有多種天然變異形式。在SEQ ID NO1中僅列出了牛的D-Loop區(qū)的序列，在SEQ ID NO2中僅列出了羊的D-Loop區(qū)的序列。然而，在GenBank數(shù)據庫中還列出了其他多種變體的核苷酸序列?；谶@些序列同樣可以設計引物和探針。
優(yōu)選的引物是其序列在野生型序列和多種變體序列中都存在的引物，例如當引物對可以在90％以上牛羊的DNA提取物中特異性擴增出產物，并且在其他動物的DNA提取物中無法特異性擴增出產物，那么該引物對就是優(yōu)選的。
本發(fā)明所述的特異性擴增飼料中的牛源性/羊源性成分的引物以及檢測用探針，可根據本發(fā)明的遺傳標記的序列(SEQ ID NO1或2)進行設計，并通過常規(guī)的DNA合成方法合成而得(例如可以用商業(yè)化的DNA自動合成儀合成)。
本發(fā)明的這些引物可以用放射性同位素、生物素、酶、熒光素或其他化學發(fā)光物質進行標記。
本發(fā)明所述飼料中的牛源性/羊源性成分特異性核酸分子引物具有較好的種特異性。用本發(fā)明引物進行常規(guī)PCR反應，結果只能從含有飼料中的牛羊成分的材料的DNA提取物中擴增出大小為300-1000特異性PCR產物。因此，以本發(fā)明引物進行常規(guī)PCR反應，并通過判斷相應大小PCR產物的有無可以準確、快速地檢測飼料中的牛羊成分，而且所需的樣品量很少。優(yōu)選的PCR方法是熒光實時PCR法。
同時本發(fā)明中所述的探針具有極高的特異性，可直接與靶DNA雜交結合。一種優(yōu)選的探針是Taqman探針，它可在PCR反應中直接實時地通過熒光信號反映擴增產物的存在與否以及數(shù)量的高低。
本發(fā)明的探針可以用放射性同位素、生物素、酶、熒光素或其他化學發(fā)光物質進行標記。將該序列的5’端用報告熒光基團如羧基熒光素(Carboxyfluorescein，F(xiàn)AM)等標記，3’端用淬滅熒光基團如TAMRA或Dabcyl等標記后即可用于對飼料中的牛源性/羊源性成分進行定性和定量分析的實時PCR反應。
將本發(fā)明的引物與Taqman探針技術結合，便得到了本發(fā)明的同時對飼料中的牛源性/羊源性成分進行定性檢測和定量計數(shù)分析方法，即Real-Time PCR反應。這種分析方法不僅克服了常規(guī)定量PCR方法中的誤差，而且分析所需的樣品量少，檢出極限低，靈敏度高。
本發(fā)明還提供了檢測樣品(如飼料)中的牛羊成分的試劑盒。該試劑盒含有容器以及裝于容器內的本發(fā)明的牛羊特異性引物。此外，試劑盒還宜含有牛特異性探針、羊特異性探針或牛羊通用探針。
此外，在試劑盒中還可含有提取DNA所需的試劑，或PCR反應所需的試劑。
本發(fā)明方法的主要優(yōu)點在于(1)高靈敏度地檢測出飼料中的牛羊成分。
(2)方法簡便，僅使用一套引物進行擴增。
(3)在很大范圍內有非常好的線性關系，可以很準確地定量測定飼料中的牛羊成分。
(4)特異性高。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1飼料中的牛源性/羊源性成分特異性引物對和探針的設計和合成根據在NCBI數(shù)據庫中所列出的各種牛、羊、豬、雞、魚、馬等的特征性序列，經過序列對比，從D-Loop區(qū)域選出合適的片段，然后采用ABI的PrimerExpress軟件，針對牛、羊分別設計出了如下特異性非常高的引物及探針上游引物5’GAG CTT AAT TAC CAT GCC G 3’(SEQ ID NO3)；下游引物5’TTA TGT GTG AGC ATG GGC 3’(SEQ ID NO4)；牛探針FAM-5’TTT CTT CAG GGC CAT C 3’-TAMRA(SEQ ID NO5)；羊探針(FAM-5’AGG GAT CCC TCT TC 3’-TAMRA)(SEQID NO6)；通用探針(FAM-5’AGG GAT CCC TCT TC 3’-TAMRA)(SEQ ID NO7)；其中FAM為熒光報告基團，TAMRA為熒光淬滅基團。
牛的D-Loop區(qū)序列列于SEQ ID NO1。羊的D-Loop區(qū)序列列于SEQ ID NO2。各引物和探針的相應位置示于圖1和圖2。
其中SEQ ID NO3和4構成的引物對和通用探針(SEQ ID NO7)能夠同時結合于牛羊的遺傳物質-DNA上，因而能夠檢測到飼料中的各種?；蜓虺煞?。而牛探針則只能夠結合于牛的DNA，故只能檢測到飼料中的各種牛成分；羊探針只能夠結合于羊的DNA，故只能檢測到飼料中的各種羊成分。
實施例2對飼料中的牛源性/羊源性成分的檢測首先，用常規(guī)方法抽提各種飼料樣品中的DNA樣品，或者用以下抽提試劑盒抽提各種飼料樣品中的DNA樣品
A.緩沖液1(100mmol/L Tris-HCl，pH＝8.0，0.20mmol/L EDTA，500mmol/L NaCl)B.緩沖液2(乙醚，酚∶氯仿∶異戊醇＝24∶25∶1，10％ SDS)C.洗滌緩沖液(70％乙醇，3mol/L醋酸鈉)D.蛋白酶K(干粉，10mg/管，使用時配成10mg/mL)E.DNA吸附柱。
接著，在含以下成分的PCR反應體系(40uL)中，加入引物(各0.25ul，濃度20μM/L)和抽提的DNAA.20％甘油(10uL)B.10×TaqMan緩沖液A(5uL)C.25uM MgCl2(10uL)，D.dATP(1uL)，dCTP(1uL)，dGTP(1uL)，dUTP(1uL)E.Gold Taq聚合酶(5U/uL，購自ABI公司)0.5uLF.AmpErase@UNG酶(1U/uL，購自ABI公司)0.5uLG.ddH2O(10uL)按常規(guī)的PCR方法進行PCR反應，其中反應循環(huán)條件為，50℃ 2分鐘，95℃預變性10分鐘，95℃變性30秒，63℃退火延伸30秒，45個循環(huán)后，4℃保存。(注對59-65范圍內的多個退火溫度進行了重復試驗，結果以63℃作為最佳退火溫度)。
然后在7000 Sequence Detection System(Applied Biosystems，美國)實時熒光定量儀上，使用通用探針、牛探針或羊探針進行檢測，判定樣本中的成分及含量。
結果(1)特異性和檢測限表1和表2為退火溫度為63℃時，牛及羊模板DNA的實時熒光定量反應的結果。實驗結果表明，在63℃的退火溫度下，該方法的特異性和靈敏度都能夠得到較好的滿足。在該反應條件下，牛、羊、魚、雞及豬的模板DNA互不干擾，交叉率為0％；且其檢測限都至少達到了飼料濃度分別為0.1％的牛骨粉及0.1％羊骨粉。
表1使用牛探針(SEQ ID NO5)時本發(fā)明方法的特異性和檢測限

表2使用羊探針(SEQ ID NO6)時本發(fā)明方法的特異性和檢測限

(2)定量范圍結果如圖3和圖4所示。
圖3為羊探針的線性回歸曲線。觀察圖譜可以發(fā)現(xiàn)當羊骨粉含量為10％至90％時，其Ct值與羊骨粉的濃度之間呈現(xiàn)較好的線性相關性，相關系數(shù)R＝0.987。當羊骨粉濃度小于10％時，Ct值與羊骨粉濃度之間不再呈現(xiàn)線性相關。
圖4為牛探針的線性回歸曲線。觀察圖譜可以發(fā)現(xiàn)當牛骨粉含量為30％至90％時，其Ct值與羊骨粉的濃度之間呈現(xiàn)較好的線性相關性，相關系數(shù)R＝0.987。當牛骨粉濃度小于30％時，Ct值與牛骨粉濃度之間不再呈現(xiàn)線性相關。
實施例3陰性樣品及陽性樣品的實驗結果比對為驗證了本發(fā)明方法，采用實施例2中相同的方法，分別對20份盲樣進行了檢測。即先從研細的飼料樣品中抽提出DNA，然后在在7000 SequenceDetection System(Applied Biosystems，美國)實時熒光定量儀上，使用通用探針檢測樣本，判定樣本的陰陽性。若樣本呈陽性，則進一步使用牛探針和羊探針進行檢測，判定樣本中的成分及含量。
檢測結果如表3和表4所示，與實際成分相符。
表3飼料中牛源性成分的檢測

注％為飼料的質量百分比；Ct值為循環(huán)域值表4飼料中羊源性成分的檢測

注％為飼料的質量百分比；Ct值為循環(huán)域值實施例4飼料中的牛羊成分快速檢測和定量計數(shù)試劑盒為了有利于本方法的商品化，特制備方便使用的試劑盒，盒中含有下列試劑和材料1.上游引物(SEQ ID NO3)溶液(20μmol/L)2.下游引物(SEQ ID NO4)溶液(20μmol/L)3.熒光物質標記的牛特異性探針、羊特異性探針、牛羊通用探針(SEQ IDNO5-7)(各20μmol/L)4.使用說明書(一份)在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海市畜牧獸醫(yī)站<120>檢測飼料中牛羊成分的方法和試劑盒<130>042819<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>911<212>DNA<213>牛(taurus)<400>1aacactatta atatagttcc ataaatacaa agagccttat cagtattaaa tttatcaaaa 60atcccaataa ctcaacacag aatttgcacc ctaaccaaat attacaaaca ccactagcta120acataacacg cccatacaca gaccacagaa tgaattacct acgcaagggg taatgtacat180aacattaatg taataaagac ataatatgta tatagtacat taaattatat gccccatgca240tataagcaag cacatgacct ctatagcagt acataataca tataattatt gactgtacat300aatacattat gtcaaattca ttcttgatag tatatctatt atatattcct taccattaga360tcacgagctt aattaccatg ccgcgtgaaa ccagcaaccc gctaggcagg gatccctctt420ctcgctccgg gcccataaac cgtgggggtc gctatccaat gaattttacc aggcatctgg480ttctttcttc agggccatct catctaaaac gcccatgctc acacataact ataagacatc540tcgatggact aatggctaat cagcccatgc tcacacataa ctgtgctgtc atacatttgg600tattttttta ttttggggga tgcttggact cagctatggc cgtcaaaggc cctgacccgg660agcatctatt gtagctggac ttaactgcat cttgagcacc agcataatga taagcgtgga720cattacagtc aatggtcaca ggacataaat tatattatat atccccccct tcataaaaat780ttccccctta aatatctacc accactttta acagactttt ccctagatac ttatttaaat840ttttcacgct ttcaatactc aatttagcac tccaaacaaa gtcaatatat aaacgcaggc900cccccccccc c 911
<210>2<211>1212<212>DNA<213>羊(Hircus)<400>2aaccactatt aaccacatct attaatatac ccccaaaaat attaagagcc tccccagtat 60taaatttact aaaaatttca aatatacaac acaaacttcc cactccacaa gcctacagac 120atgccaacaa cccacacgta taaaaacatc ccaatcctaa cccaacttag atacccacac 180aaacgccaac accacacaat attgcgtgta tgcaagtaca ttacaccgct cgcctacaca 240caaatacatt tactaacatc catataacgc ggacatacag ccttcatata gtttactgta 300tatctaccct acacatatgc agtactaatc cagcataaac gtaatgtatg tacattacat 360tttatgatct acttcatgtg tacgtacata atattaatgt aacagggaca tagtatgtat 420atagtacatt aaacgatttt ccacatgcat attaagcacg tacatcagta ttaatgtaat 480aaggacataa tatgtatatt gtacattaaa cgatcttccc catgcatata agcatgtata 540atgcttctat cggcagtaca tagtacattt tactgcatat tcgtacatag cacatagagt 600caaatccatt cctgccaaca tgcgtatccc gtccactaga tcacgggctt gttgaccatg 660ccgcgtgaaa ccagcaaccc gcttggcagg gatccctctt ctcgctccgg gcccattaac 720cgtgggggta gctatttaat gagcttaatt accatgccgg ttctttcttc agggccatct 780cacctaaaat cgcccactct tccctcttaa ataagacatc tcgatggact aatgactaat 840cagcccatgc tcacacataa ctgtgctgtc gcccatgctc acacataaca ttttcgggga 900tgcttggact cagctatggc cgtctgaggc cccgacccgg agcataaatt gtagctggac 960ttaactgcat cttgagcatc cccataatgg taggcatggg cattgcagtt aatggtcaca1020ggacatattt attatgttgc atttcatcat gcatccgctc cacctttccc cccctccttc1080ttagatatat accaccgttt taaacacgct ccctcctaga tattagtgca aaatttttct1140acttccaata ctcaaatctt tactccagcc aaggtaaata tataagtgcc tgggtctttt1200acatggtaag tg1212
<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3gagcttaatt accatgccg 19<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4ttatgtgtga gcatgggc18<210>5<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>探針<400>5tttcttcagg gccatc 16<210>6<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>探針
<400>6agggatccct cttc14<210>7<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>探針<400>7agggatccct cttc1權利要求
1.一種用于檢測飼料中的牛源性和/或羊源性成分的遺傳標記物，其特征在于，它具有SEQ ID NO1和/或2中連續(xù)的300-900個核苷酸。
2.如權利要求1所述的遺傳標記物，其特征在于，它具有SEQ ID NO1或2中連續(xù)的500-800核苷酸。
3.一種用于檢測飼料中的牛源性和/或羊源性成分的寡核苷酸，其特征在于，其長度為14-35個核苷酸，且其序列與SEQ ID NO1或2所示的序列相同或互補。
4.如權利要求3所述的寡核苷酸，其特征在于，其長度為20-30個核苷酸。
5.如權利要求3所述的寡核苷酸，其特征在于，所述的寡核苷酸是引物或探針，并且所述的引物可擴增出對應于SEQ ID NO1或2的PCR擴增產物，并且所述的寡核苷酸選自SEQ ID NO3-7。
6.一種檢測飼料中的牛源性和/或羊源性成分的試劑盒，其特征在于，它含有容器以及位于容器中的特異性擴增牛羊成分遺傳標記物的引物對，所述的引物長度為14-35個核苷酸，其中一個引物的序列與SEQ ID NO1所示的序列相同，且另一個引物的序列與SEQ ID NO1所示的序列互補，并且所述引物擴增出長度為300-1000bp的擴增產物；或者一個引物的序列與SEQ ID NO2所示的序列相同，且另一個引物的序列與SEQ IDNO2所示的序列互補，并且所述引物擴增出長度為300-1000bp的擴增產物。
7.如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，還含有探針，所述探針的長度為14-18bp，且該探針的序列與SEQ ID NO1或2所示的序列相同或互補。
8.如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述引物對選自下組SEQ IDNO3-4；并且所述的探針是選自下組的一種或多種SEQ ID NO5、6、7。
9.一種檢測樣品中的牛源性和/或羊源性成分的方法，其特征在于，它包括步驟(a)抽提樣品的DNA；(b)將抽提的DNA作為模板，用特異性擴增牛羊成分遺傳標記物的引物對進行PCR擴增，其中所述的引物長度為14-35個核苷酸，且一個引物的序列與SEQ ID NO1所示的序列相同，且另一個引物的序列與SEQ ID NO1所示的序列互補，并且所述引物擴增出長度為300-1000bp的擴增產物；或者一個引物的序列與SEQ ID NO2所示的序列相同，且另一個引物的序列與SEQ ID NO2所示的序列互補，并且所述引物擴增出長度為300-1000bp的擴增產物；(c)檢測擴增產物是否存在，存在擴增產物就表示樣品中存在牛羊成分。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述的步驟(c)是同時通過用牛特異性探針、羊特異性探針或牛羊通用探針與目標序列DNA的特異性結合及引物對與目標序列的特異性結合來確定樣品中存在牛羊成分，其中，與牛特異性探針結合表示存在牛成分，與羊特異性探針結合表示存在羊成分，與牛羊通用探針結合表示存在牛成分和羊成分中至少一種成分；此外，步驟(c)還包括通過檢測熒光信號的強弱來定性定量檢測樣品中的飼料中的牛源性/羊源性成分。
全文摘要
本發(fā)明提供了快速定量檢測飼料中的牛源性/羊源性成分的遺傳標記、方法和試劑盒。具體地，本發(fā)明提供了飼料中的牛源性/羊源性成分D－loop區(qū)核苷酸序列，以及以該序列為基礎設計的引物和探針。利用本發(fā)明方法可方便、快速、準確地定性檢測和定量計數(shù)飼料中的牛源性/羊源性成分。
文檔編號C12Q1/68GK1810988SQ20051002497
公開日2006年8月2日 申請日期2005年4月8日 優(yōu)先權日2005年4月8日
發(fā)明者張?zhí)K華, 沈富林, 黃士新, 李潔, 周文駿, 王蓓, 孫亞云, 曹瑩 申請人:上海市畜牧獸醫(yī)站