專(zhuān)利名稱：重組人干擾素β的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明提供了一種高效生產(chǎn)重組人干擾素β的方法，以及有關(guān)的工程細(xì)胞的構(gòu)建、重組人干擾素β表達(dá)和純化工藝。
背景技術(shù)：
干擾素是由多種細(xì)胞產(chǎn)生的具有廣泛的抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的可溶性蛋白。干擾素在整體上不是均一的分子，可根據(jù)產(chǎn)生細(xì)胞分為3種類(lèi)型白細(xì)胞產(chǎn)生的為α型；成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的為β型；T細(xì)胞產(chǎn)生的為γ型。根據(jù)干擾素的產(chǎn)生細(xì)胞、受體和活性等綜合因素將其分為2種類(lèi)型I型和II型。
I型干擾素又稱為抗病毒干擾素，其生物活性以抗病毒為主。I型干擾素有3種形式IFNα、IFNβ和IFNω。其中IFNβ是單一基因的產(chǎn)物，主要由成纖維細(xì)胞和白細(xì)胞以外的其他細(xì)胞產(chǎn)生；與IFNα的同源性在氨基酸水平上僅為30％，在核苷酸水平上約45％。IFNβ的受體基因位于第21號(hào)染色體上，表達(dá)在幾乎所有類(lèi)型的有核細(xì)胞表面，因此其作用范圍十分廣泛。
研究表明，干擾素β的生物學(xué)功能主要表現(xiàn)為以下幾種(1)抗病毒作用IFN-β具有廣譜的抗病毒作用，其作用機(jī)理是①通過(guò)抑制某些病毒的吸附(如VSV)、脫衣殼和最初的病毒核酸轉(zhuǎn)錄(如SV-40、HSV-1、流感病毒和VSV)、病毒蛋白合成(如SVS、SV-40)以及成熟病毒的釋放(如逆轉(zhuǎn)錄病毒、HSV-1)等不同環(huán)節(jié)；②通過(guò)NK、巨噬細(xì)胞和CTL殺傷病毒感染靶細(xì)胞。
(2)抑制某些細(xì)胞的生長(zhǎng)，如抑制成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和造血細(xì)胞的增殖，其機(jī)理可能通過(guò)使細(xì)胞停留在Go/G1期，降低DNA合成，下調(diào)c-myc、c-fos等細(xì)胞原癌基因轉(zhuǎn)錄水平，下調(diào)某些生長(zhǎng)因子受體表達(dá)，如EGf R、胰島素-I R和M-CSFR等。
(3)免疫調(diào)節(jié)作用促進(jìn)大多數(shù)細(xì)胞MHC I類(lèi)抗原的表達(dá)，活化NK細(xì)胞和CTL。
(4)抑制和殺傷腫瘤細(xì)胞IFN-β殺傷腫瘤細(xì)胞主要是通過(guò)促進(jìn)機(jī)體免疫功能，提高巨噬細(xì)胞、NK和CTL的殺傷水平。
干擾素β廣泛的生物學(xué)功能使其在臨床上的應(yīng)用極為廣泛。目前干擾素β在臨床上主要用于治療多發(fā)性硬化癥(MS)、抗病毒、抗腫瘤和抑制血管的生成，已批準(zhǔn)的適應(yīng)癥有多發(fā)性硬化癥、繼發(fā)性系統(tǒng)性多發(fā)性硬化癥(SPMS)、病毒性肝炎等病毒性疾病，在對(duì)各種腫瘤的治療過(guò)程中也廣泛使用到干擾素β。而研究表明，干擾素β的臨床應(yīng)用前景可能更為廣闊。東京大學(xué)醫(yī)學(xué)系谷口維紹教授近日發(fā)現(xiàn)，干擾素β對(duì)治療骨質(zhì)疏松有一定療效，預(yù)計(jì)這種新藥對(duì)與骨質(zhì)疏松有同樣癥狀的風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎也會(huì)有療效。國(guó)際中樞神經(jīng)專(zhuān)家認(rèn)為，干擾素β在治療老年性癡呆疾病方面將顯奇效；德國(guó)學(xué)者的一項(xiàng)研究表明，干擾素β對(duì)于用皮質(zhì)類(lèi)固醇治療無(wú)效的難治性嚴(yán)重潰瘍性結(jié)腸炎病人可能有效。
IFN-β的臨床研究表明，干擾素β的臨床應(yīng)用前景非常廣闊。而東京大學(xué)醫(yī)學(xué)系谷口維紹教授近日發(fā)現(xiàn)，干擾素β對(duì)治療骨質(zhì)疏松有一定療效，預(yù)計(jì)這種新藥對(duì)與骨質(zhì)疏松有同樣癥狀的風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎也會(huì)有療效。國(guó)際中樞神經(jīng)專(zhuān)家認(rèn)為，干擾素β在治療老年性癡呆疾病方面將顯奇效；德國(guó)學(xué)者的一項(xiàng)研究表明，干擾素β對(duì)于用皮質(zhì)類(lèi)固醇治療無(wú)效的難治性嚴(yán)重潰瘍性結(jié)腸炎病人可能有效。因此，IFNβ的臨床應(yīng)用前景可能更加廣闊。
人IFN-β基因只有一個(gè)，無(wú)內(nèi)含子，與IFN-α基因連鎖在一起，位于第9號(hào)染色體上。人干擾素β前體分子由187個(gè)氨基酸組成，其中第1~21個(gè)為信號(hào)肽序列。成熟的人IFN-β分子含166個(gè)氨基酸，有一個(gè)糖基鏈，分子量為約為22500Da，含有3個(gè)半胱氨酸，分別在17、31和141位氨基酸。31與141位半胱氨酸之間形成的分子內(nèi)二硫鍵對(duì)于IFN-β生物學(xué)活性非常很重，141Cys被Tyr替代后則完全喪失抗病毒作用，而Cys17被Ser替代后不僅不影響生物學(xué)活性，反而是使IFN-β分子穩(wěn)定性更好。糖基對(duì)生物學(xué)活性無(wú)影響。
目前上市的INF-β1a在氨基酸序列上與天然INF-β分子完全一致，同樣帶有一個(gè)糖基化位點(diǎn)并被糖基化修飾，分子量也與天然INF-β一致，為22500Da。但是是用CHO細(xì)胞表達(dá)的，工藝比較復(fù)雜。
INF-β1b則在基因上經(jīng)過(guò)修飾，與天然分子存在一定的差異。它在第17位用Ser替代了原來(lái)的Cys，同時(shí)去掉了糖基化位點(diǎn)。它是用大腸桿菌表達(dá)的，表達(dá)產(chǎn)物只有165個(gè)氨基酸(N端失去了Met)，分子量為18500 Da。
本發(fā)明系統(tǒng)提供了一種高效生產(chǎn)重組人干擾素β的方法。通過(guò)優(yōu)化編碼重組人干擾素β的核苷酸序列，采用糖基人源化改造的新型畢赤酵母表達(dá)體系分泌表達(dá)人干擾素β，優(yōu)化表達(dá)載體/宿主菌組合，同時(shí)改進(jìn)發(fā)酵工藝，提高重組人干擾素β的表達(dá)水平。同時(shí)簡(jiǎn)便純化工藝，獲得高表達(dá)、高得率、極具產(chǎn)業(yè)化價(jià)值的一種重組人干擾素β生產(chǎn)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種高效和/或簡(jiǎn)便的生產(chǎn)重組人干擾素β的方法。
本發(fā)明的另一目的就是提供重組人干擾素β蛋白的編碼序列和用于該方法的表達(dá)載體及工程細(xì)胞。
在本發(fā)明的第一方面，就是提供了一種優(yōu)化的編碼重組人干擾素β蛋白的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列編碼SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，而且所述核苷酸序列編碼區(qū)與SEQ ID NO1所示核苷酸序列有95％以上相同性。
在另一優(yōu)選例中，所述的核苷酸序列含有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種表達(dá)載體，含有權(quán)利要求1所述的核苷酸序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體是pPIC9K/rIFN-β。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種工程細(xì)胞，其特征在于，整合有權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體。
在另一優(yōu)選例中，所述的工程細(xì)胞是經(jīng)過(guò)糖基人源化改造的畢赤酵母(Pichia Pastoris)。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的畢赤酵母宿主細(xì)胞的基因組中整合有2-30拷貝的人干擾素β編碼序列。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的畢赤酵母工程細(xì)胞包括快速利用甲醇型和慢速利用甲醇型。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種生產(chǎn)重組人干擾素β蛋白的方法，該方法包括步驟a)在適合的表達(dá)條件下，培養(yǎng)如權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)出人干擾素β蛋白；較佳地，所述的宿主細(xì)胞是畢赤酵母。
b)分離純化出表達(dá)的人干擾素β蛋白。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的步驟(a)的培養(yǎng)條件包括培養(yǎng)分為培養(yǎng)階段和誘導(dǎo)階段，培養(yǎng)階段培養(yǎng)菌液濃度達(dá)到OD600為40-200，誘導(dǎo)時(shí)間為24-100hr，發(fā)酵及誘導(dǎo)溫度保持在28-30℃，微量元素的量為0.1-2ml/L，誘導(dǎo)期的pH值為3-9，誘導(dǎo)期甲醇濃度控制在0.5-5％。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，誘導(dǎo)過(guò)程還可以添加酪蛋白水解物(CA)、蛋白胨(peptone)、奶粉、精氨酸等作為保護(hù)劑。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，所述的步驟(c)包括步驟(i)對(duì)發(fā)酵樣品通過(guò)離心和/或過(guò)濾方式去除沉淀，獲得發(fā)酵上清液；(ii)對(duì)發(fā)酵上清液進(jìn)行超濾濃縮，更換緩沖液；(iii)層析純化，所述的層析選自陽(yáng)離子交換層析、陰離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、疏水層析、親和層析、及其組合。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，樣品超濾濃縮置換緩沖液、Q Sepharose F.F.以及phenyl sepharose F.F.層析以后得到純度大于95％、得率在50％以上的純品。


圖1是pPIC9k/IFN-β表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建路線圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人通過(guò)深入而廣泛的研究，通過(guò)基因編碼序列的優(yōu)化設(shè)計(jì)，將優(yōu)化后的人干擾素β編碼序列(SEQ ID NO1)轉(zhuǎn)入經(jīng)糖基人源化改造的甲醇利用型畢赤酵母(P.pastoris)，從而實(shí)現(xiàn)了人干擾素β高效分泌表達(dá)，并且表達(dá)出的人干擾素β保持很高的生物學(xué)活性。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
本發(fā)明根據(jù)人干擾素β天然氨基酸序列，按密碼子偏愛(ài)性，在不改變氨基酸序列的條件下，全基因合成重組人干擾素β蛋白的目的基因序列，將該基因克隆到pUC19中測(cè)序驗(yàn)證后，用分子克隆的常規(guī)方法，克隆入表達(dá)載體pPIC9K，轉(zhuǎn)化、整合入P.pastoris宿主細(xì)胞染色體，通過(guò)施加抗生素篩選出多拷貝整合的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，進(jìn)而篩選出高表達(dá)工程細(xì)胞。搖瓶試驗(yàn)表明，誘導(dǎo)24小時(shí)后，培養(yǎng)上清目的蛋白占總蛋白50％以上，表達(dá)水平100mg/l以上。根據(jù)其消耗甲醇的速度，判斷此工程細(xì)胞株為Mut+。
在獲得工程細(xì)胞后，便可在適合的條件下培養(yǎng)工程細(xì)胞。在本發(fā)明中，工程菌表達(dá)的重組人干擾素β發(fā)酵條件沒(méi)有特別限制?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域常規(guī)的發(fā)酵條件。例如，合適的培養(yǎng)基包括(但不限于)以下組成(iv)氮源含有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源，其中有機(jī)氮源如蛋白胨、酵母粉，或二者的混合物，總濃度0.1-3％；無(wú)機(jī)氮源如氨水或NH4Cl、(NH4)2SO4等銨鹽，濃度0-1.5％。
(v)無(wú)機(jī)鹽包括磷酸鹽、枸鹽酸鹽、Mg2+鹽等。較佳地，磷酸鹽緩沖體系濃度20-200mM，pH5-8；Mg2+鹽0-5mM。
(vi)在培養(yǎng)基中添加維生素B1作為補(bǔ)充維生素，濃度1～1000PPM。
(vii)根據(jù)M9培養(yǎng)基中的微量元素配方，微量元素可加0.1-2ml/L培液。
(viii)碳源包括甘油、葡萄糖、乳糖等?？梢允菃我惶荚?，也可以是混合碳源。較佳地，碳源選自下組甘油濃度為0.1-3％；乳糖濃度為0.1-3％；葡萄糖濃度為0.1-1.5％。
為大規(guī)模獲得重組人干擾素β，需要在發(fā)酵罐中進(jìn)行表達(dá)培養(yǎng)。本發(fā)明研究了中試發(fā)酵工藝，優(yōu)化后的表達(dá)水平達(dá)到200mg/l在發(fā)酵表達(dá)后，對(duì)表達(dá)的重組人干擾素β蛋白進(jìn)行分離。通常，發(fā)酵樣品先以離心、過(guò)濾等方式獲得發(fā)酵液上清。然后進(jìn)行初步純化和層析包括陽(yáng)離子交換層析、陰離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、親和層析等。
經(jīng)不同層析過(guò)程比較，優(yōu)化的純化方法包括1.對(duì)發(fā)酵樣品通過(guò)離心和/或過(guò)濾方式獲得發(fā)酵上清液；2.通過(guò)鹽析和/或超濾進(jìn)行初步純化后，或直接通過(guò)陰離子交換、疏水層析方法，從而得到純度達(dá)到95％的純品。
純品純度95％以上，得率約100mg/L發(fā)酵液。
純品的活性按細(xì)胞病變抑制法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)晶紫染色，用酶標(biāo)儀測(cè)定D570值，最后以國(guó)際標(biāo)淮品校正活性單位。
純化后重組人干擾素β可用常規(guī)技術(shù)制成各種劑型。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，構(gòu)建了生產(chǎn)重組人干擾素β的P.pastoris酵母表達(dá)工程細(xì)胞，甲醇誘導(dǎo)，高水平分泌表達(dá)，不需復(fù)性。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)例中，經(jīng)過(guò)發(fā)酵工藝的優(yōu)化，進(jìn)一步提高了重組人干擾素β的表達(dá)量。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)例中，由于蛋白分泌表達(dá)，發(fā)酵上清科直接純化，純化工藝簡(jiǎn)單，純化后可得到純品5g/L。
純化后原液加入適當(dāng)輔料，制成重組人干擾素β的注射用粉針劑。初步穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，該粉針劑穩(wěn)定。
中試研究表明，產(chǎn)品制造工藝穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)單，周期短，成本低，每升發(fā)酵液可獲得重組人干擾素β純品100mg。適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(1)選用的是經(jīng)過(guò)糖基人源化改造的畢赤酵母宿主細(xì)胞，很好地保持了人干擾素β的生物學(xué)活性。
(2)優(yōu)化后的重組人干擾素β蛋白基因非常適合在畢赤酵母中表達(dá)，具有高表達(dá)、高穩(wěn)定的特點(diǎn)。
(3)通過(guò)控制關(guān)鍵的發(fā)酵工藝條件，使表達(dá)水平達(dá)到200mg/L。
(4)純化工藝簡(jiǎn)便，回收率高。由于分泌蛋白不是以包涵體形式表達(dá)，因此簡(jiǎn)化了純化工序，使純化回收率大大提高，使得大規(guī)模生產(chǎn)重組人干擾素β成為可能。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和高表達(dá)工程菌株的獲得根據(jù)人干擾素β天然氨基酸序列，按密碼子偏愛(ài)性，在不改變氨基酸序列的條件下，全基因合成重組人干擾素β蛋白的目的基因序列，將該基因克隆到pUC19中并測(cè)序驗(yàn)證表達(dá)載體構(gòu)建方法見(jiàn)圖1。通過(guò)PCR擴(kuò)增得到目的人干擾素β基因，用XhoI+EcoRI雙酶切(MBI，2*TangoTM，37℃)PCR產(chǎn)物及pPIC9質(zhì)粒(購(gòu)自Invitrogen公司)。將兩個(gè)片段用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5α(購(gòu)自Promega公司)，在含有氨芐青霉素的LB平板上挑選克隆，小量制備質(zhì)粒，通過(guò)雙酶切/PCR鑒定篩選出陽(yáng)性克隆。大量擴(kuò)增確證的pPIC9/IFN-β質(zhì)粒，用BamH I+EcoR I雙酶切，回收小片段；質(zhì)粒pPIC9K(購(gòu)自Invitrogen公司)用相同的酶處理，回收大片段。將兩個(gè)片段用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5α，在含有氨芐青霉素的LB平板上挑選陽(yáng)性克隆并進(jìn)行質(zhì)粒酶切鑒定，小量制備質(zhì)粒，通過(guò)雙酶切/PCR鑒定篩選出陽(yáng)性克隆。獲得含有干擾素β的重組質(zhì)粒pPIC9K/IFN-β(干擾素β)。
表達(dá)質(zhì)粒pPIC9/IFN-β經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后，用Sal I酶切線性化，電穿孔法轉(zhuǎn)化進(jìn)入畢赤酵母SMD1168(購(gòu)自Promega公司)，涂于RDB平板上于30℃培養(yǎng)至有轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出，篩選高表達(dá)菌株。將pPIC9K/IFN-β質(zhì)粒(先測(cè)序驗(yàn)證)轉(zhuǎn)化已篩選的高表達(dá)菌株，篩選G418抗性菌株。用點(diǎn)種法鑒定酵母轉(zhuǎn)化子的G418抗性。依次用含G418濃度為1、2、3、4mg/mL的YPD平板篩選高抗性轉(zhuǎn)化子，并進(jìn)行小搖表達(dá)篩選得到IFN-β高表達(dá)的工程酵母菌株。根據(jù)其消耗甲醇的速度，判斷此工程細(xì)胞株為Mut+。
實(shí)施例2誘導(dǎo)階段添加不同蛋白保護(hù)劑對(duì)表達(dá)水平的影響取單克隆，接種到BMGY一級(jí)種子液中，培養(yǎng)17-20hr；按1∶10的比例二級(jí)接種于250ml BMGY的1L三角燒瓶中，培養(yǎng)4~8hr左右，上罐發(fā)酵，pH 5.0、溫度20℃、DO＞35％，待溶氧上升后以10~15轉(zhuǎn)度流加50％甘油。待甘油耗盡，溶氧再次上升后用100％甲醇以轉(zhuǎn)速1開(kāi)始誘導(dǎo)，逐漸提速。誘導(dǎo)階段將濃度為10％的CA、Peptone和Tryptone各300ml流加入罐(5L發(fā)酵罐，發(fā)酵上清3L)，誘導(dǎo)48hr結(jié)束。樣品檢測(cè)SDS-PAGE和蛋白含量以確定誘導(dǎo)階段的最佳蛋白保護(hù)劑。
實(shí)施例3誘導(dǎo)階段不同Peptone量對(duì)表達(dá)水平的影響取單克隆，接種到BMGY一級(jí)種子液中，培養(yǎng)17-20hr；按1∶10的比例二級(jí)接種于250ml BMGY的1L三角燒瓶中，培養(yǎng)4~8hr左右，上罐發(fā)酵，pH 5.0、溫度20℃、DO＞35％，待溶氧上升后以10~15轉(zhuǎn)度流加50％甘油。待甘油耗盡，溶氧再次上升后用100％甲醇以轉(zhuǎn)速1開(kāi)始誘導(dǎo)，逐漸提速。誘導(dǎo)階段取不同體積10％的Peptone流加入5L發(fā)酵罐(發(fā)酵上清3L)，誘導(dǎo)48hr結(jié)束。樣品檢測(cè)SDS-PAGE和蛋白含量以確定誘導(dǎo)階段的最佳Peptone量。
實(shí)施例4重組人干擾素β純化將高表達(dá)菌株擴(kuò)大體積進(jìn)行培養(yǎng)并誘導(dǎo)48h，4℃下5000rpm離心10分鐘，獲得發(fā)酵上清液，上樣于裝填SP XL SePharose的陽(yáng)離子交換柱，用含1m/L的NaCl的PBS洗脫；洗脫液加(NH4)2SO4至1mol/L，上樣于平衡好的PhenylSepharose FF疏水層析柱，20mmol/L PB洗脫目的蛋白；目的蛋白峰上樣于pH7.2，20mmol/L PB，0.15m/L NaCl平衡的Superdex 75凝膠過(guò)濾柱，收集洗脫峰。從而得到純度達(dá)到95％的純品。
經(jīng)過(guò)以上純化工藝，最后可得蛋白純品100mg/L。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
序列表<110>上海新生源醫(yī)藥研究有限公司<120>重組人干擾素β的生產(chǎn)方法<160>2<210>1<211>498<212>DNA<213>人工序列<221>misc_feature<222>(1)…(498)<223>優(yōu)化的重組人干擾素β基因<400>1atgagctaca acttgcttgg attcctacaa agaagcagca attttcagtg tcagaagctc 60ctgtggcaat tgaatgggag gcttgaatac tgcctcaagg acaggatgaa ctttgacatc120cctgaggaga ttaagcagct gcagcagttc cagaaggagg acgccgcatt gaccatctat180gagatgctcc agaacatctt tgctattttc agacaagatt catctagcac tggctggaat240gagactattg ttgagaacct cctggctaat gtctatcatc agattaacca tctgaagaca300gtcctggaag aaaaactgga gaaagaagat ttcaccaggg gaaaactcat gagcagtctg360cacctgaaaa gatattatgg gaggattctg cattacctga aggccaagga gtacagtcac420tgtgcctgga ccattgtcag agtggaaatc ctaaggaact tttacttcat taacagactt480acaggttacc tcagaaac 498<210>2<211>333<212>PRT<213>智人<400>2
Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln1 5 10 15Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met20 25 30 35Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp40 45 50Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln55 60 65 70Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn75 80 85 90Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys95 100 105Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr110 115 120 125Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile130 135 140 145Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr150 155 160Leu Arg Asn16權(quán)利要求
1.一種編碼人干擾素β融合蛋白的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列編碼SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，而且所述核苷酸序列編碼區(qū)與SEQ ID NO1所示核苷酸序列有95％以上相同性。
2.如權(quán)利要求1所述的核苷酸序列，其特征在于，含有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
3.一種表達(dá)載體和宿主菌的優(yōu)化組合，其特征在于，所述的表達(dá)載體含有權(quán)利要求1所述的核苷酸序列。
4.一種工程細(xì)胞，其特征在于，它整合有權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體。
5.如權(quán)利要求4所述的工程細(xì)胞，其特征在于，它是畢赤酵母。
6.一種生產(chǎn)人干擾素β的方法，其特征在于，該方法包括步驟(a)在適合的表達(dá)條件下，培養(yǎng)如權(quán)利要求4所述的工程細(xì)胞，從而表達(dá)出人干擾素β蛋白；(b)分離純化出表達(dá)的人干擾素β蛋白。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(a)所示的表達(dá)條件為誘導(dǎo)時(shí)間為24-120小時(shí)，較佳的為24-100小時(shí)；誘導(dǎo)pH為3-9，較佳的為5-7。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種重組人干擾素β的核苷酸序列，高效生產(chǎn)重組人干擾素β的生產(chǎn)方法，以及有關(guān)的工程細(xì)胞構(gòu)建、表達(dá)和純化的工藝。優(yōu)化后的重組人人干擾素β蛋白基因，非常適合在畢赤酵母中表達(dá)，同時(shí)通過(guò)發(fā)酵與純化工藝優(yōu)化，提高了表達(dá)量，具有高表達(dá)、高穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明可高效、簡(jiǎn)便、低成本的獲得重組人干擾素β純品。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1854296SQ20051002559
公開(kāi)日2006年11月1日 申請(qǐng)日期2005年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月29日
發(fā)明者孫九如, 任軍, 黃陽(yáng)濱, 黃智華, 豐濤, 蔣劍 申請(qǐng)人:上海新生源醫(yī)藥研究有限公司