專利名稱：檢測單核苷酸多態(tài)性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物基因技術(shù)領(lǐng)域的檢測單核苷酸多態(tài)性的方法，特別是一種檢測與精神分裂癥相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的方法。
背景技術(shù)：
精神分裂癥是一種復(fù)雜的且具有破壞性的腦功能紊亂，發(fā)病率約為1％，是嚴(yán)重影響人類精神和軀體健康的疾病之一，消耗了大量人力、物力和財力(Hyman SE.The NIMH perspectivenext steps in schizophrenia research.Biol.Psychiatry 2000b；471-7.)。雖然精神分裂癥的確切病因還沒有找到，但是同胞對分析，家系分析以及寄生子研究一致表明，遺傳因素在發(fā)病機制中起了重要的作用(Barkur S，Shastry.SchizophreniaA genetic perspective(Review).Int J Mol Med 2002；9207-212.)。基因組遺傳連鎖篩選鑒別出了染色體上許多位點有陽性LOD值，這樣就排除了精神分裂癥的發(fā)生是由單一主要的位點導(dǎo)致的(Pulver AE，Lasseter VK，Kasch L，et al.Schizophreniaa genome scan targets chromosomes 3p and 8p as potential sites ofsusceptibility gene.Am J Med Genet 1995；60252-260.)。單核苷酸多態(tài)性即某一物種中，在基因組的特定位置上存在著的單個核苷酸的序列變化。普遍認(rèn)為單核苷酸多態(tài)性在人類基因組中每1Kb就有1個，總數(shù)可達(dá)2～3百萬個，是人類基因組多態(tài)性的主要來源，約占人類DNA多態(tài)性的90％(Collins，F(xiàn).S.，Brooks，L.D.& Chakravarti，A.，A DNA polymorphism discovery resourcefor research on human genetic variation，Genome Res，1998，8(12)，1229.31.)。由于單核苷酸多態(tài)性密度很高，數(shù)量眾多，非常穩(wěn)定，并且絕大多數(shù)情況下只有兩種等位基因型，可進(jìn)行自動化的大規(guī)模檢測，所以它是很好的遺傳標(biāo)記。進(jìn)行全基因組的關(guān)聯(lián)分析是一個具有良好前景的精神分裂癥分子遺傳學(xué)研究方法。Affymetrix公司的基因芯片為高密度寡核苷酸芯片，利用原位光刻專利技術(shù)可使一張芯片上合成多達(dá)500,000個寡核苷酸。這種類型的芯片具有極高的特異性和靈敏度，重復(fù)性好，假陽性率非常低，是全基因組的關(guān)聯(lián)分析的有力工具。通過利用The GeneChip Mapping 100K Set對中國和蘇格蘭人群中精神分裂癥患者的全基因組關(guān)聯(lián)分析，我們首次檢測到一組12種與精神分裂癥相關(guān)的核酸序列中單核苷酸多態(tài)性位點rs7132475；rs7972508；rs10507101；rs1847533；rs2343249；rs1113996；rs807559；rs1888547；rs868276；rs883314；rs1604142；rs10498777。
經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的國內(nèi)外文獻(xiàn)檢索，至今未見與本發(fā)明主題有密切聯(lián)系的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供檢測單核苷酸多態(tài)性的方法。使其不僅適用于人類，也可診斷實驗動物，用于精神分裂癥治療藥物的開發(fā)和藥效的評價，促進(jìn)開發(fā)治療精神分裂癥藥物的進(jìn)程。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，本發(fā)明具體步驟包括(a)收集待測者的靜脈血液樣品，提取DNA；(b)取250ng基因組DNA分別用Xba I or Hind III于37℃酶切2小時，70℃滅活20分鐘；(c)酶切后的DNA分別用0.25μM Xba I or Hind III adapter(Affymetrix)和250U T4 DNA聯(lián)結(jié)酶(New England Biolabs)16℃聯(lián)結(jié)2小時，70℃滅活20分鐘；(d)連接產(chǎn)物分成3孔，每孔PCR反應(yīng)體系總體積為100ul，具中MgCl21.0mM，dNTP(each)0.3mM，Platinum Pfx DNA Polymerase(InvitrogenCorporation)0.05U/μL；(e)PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)純化，與Affymetrix GeneChip Human Mapping 50KArray Xba 240和Hind 240基因芯片雜交；(f)雜交后的芯片經(jīng)洗滌、染色，用掃描儀和分析軟件檢測單核苷酸位點是否存在多態(tài)性。
所述的PCR反應(yīng)，其條件94℃3分鐘，30X(94℃ for 30秒，60℃for 45秒，and 68℃ for 60秒)，extension at 68℃7分鐘。
步驟(f)中，檢測rs7132475；rs7972508；rs10507101；rs1847533；rs2343249；rs1113996；rs807559；rs1888547；rs868276；rs883314；rs1604142；rs10498777單核苷酸位點是否存在多態(tài)性。
本發(fā)明核苷酸序列測定方法的過程是首先，將樣品基因組DNA稀釋至標(biāo)準(zhǔn)50ng/μL，利用Xba I和Hind III兩種核酸限制性內(nèi)切酶對樣品DNA進(jìn)行特異性酶切，將基因組DNA轉(zhuǎn)化為200-2000bp的核酸片段。然后，在酶切位點末端連接通用擴增引物adaptor。利用Pfx聚合酶，通過PCR反應(yīng)，將樣品DNA進(jìn)行全基因組擴增。擴增后產(chǎn)物經(jīng)QIAGEN多孔純化板純化，濃縮。將濃縮后的擴增產(chǎn)物稀釋至40μg/45μL，通過DNA酶片段化，使之成為20-200bp左右的小片段DNA。片段化產(chǎn)物經(jīng)過標(biāo)記反應(yīng)，在核酸片段末端添加熒光標(biāo)記物，再與基因芯片上特異的寡核苷酸探針雜交。雜交后的芯片經(jīng)洗滌、染色，去處干擾信號，通過用掃描儀和分析軟件，利用基因芯片上特異位點的雜交信號檢測不同的單核苷酸位點是否存在多態(tài)性。
本發(fā)明的檢測單核苷酸多態(tài)性的方法，不僅適用于人類，也可診斷實驗動物，與目前正在使用的依據(jù)各種量表評價的診斷方法相比，它不依賴于醫(yī)生對診斷對象的主觀判斷。由于靜脈取血具有取材方便，無創(chuàng)傷性，并可連續(xù)檢測的優(yōu)點，因此本發(fā)明促進(jìn)開發(fā)治療精神分裂癥藥物的進(jìn)程，使診斷具有極大的臨床應(yīng)用的可能。
具體實施例方式
以下結(jié)合具體實施例，以進(jìn)一步說明本發(fā)明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
實施例1基因的收集和抽提精神分裂癥患者來自于中國上海市精神衛(wèi)生中心，英國阿伯丁大學(xué)，以DSM IV(中國精神病分類方案與診斷標(biāo)準(zhǔn)第二版修訂版)為診斷標(biāo)準(zhǔn)。匹配的對照個體由上海地區(qū)醫(yī)院門診部和英國阿伯丁大學(xué)提供。中國散發(fā)性的精神分裂癥患者172例，平均年齡50.17±14.33歲(標(biāo)準(zhǔn)差)，發(fā)病年齡為28.48±9.35歲(標(biāo)準(zhǔn)差)。健康自愿對照組171例，平均年齡28.10±8.14歲(標(biāo)準(zhǔn)差)。英國散發(fā)性的精神分裂癥患者166例，平均年齡44.55±13.80歲(標(biāo)準(zhǔn)差)，發(fā)病年齡為24.33±8.25歲(標(biāo)準(zhǔn)差)。健康自愿對照組179例，平均年齡39.11±11.01歲(標(biāo)準(zhǔn)差)。在經(jīng)過本人或患者家屬同意的前提下采集血液，并簽署知情同意書。
實施例2SNP的獲得以及12種單核苷酸多態(tài)性位點的檢測所有SNP均來自于Affymetrix GeneChip Mapping 100K Set，其物理間距中值為8.5kb，平均距離為23.6kb。
取250ng基因組DNA分別用Xba I or Hind III于37℃酶切2小時，70℃滅活20分鐘，將基因組DNA轉(zhuǎn)化為200-2000bp的核酸片段。
酶切后的DNA分別用0.25μM Xba I or Hind III adapter(Affymetrix)和250U T4 DNA聯(lián)結(jié)酶(New England Biolabs)16℃聯(lián)結(jié)2小時，70℃滅活20分鐘，在酶切位點末端連接通用擴增引物adaptor。。
連接產(chǎn)物分成3孔，每孔反應(yīng)體系總體積為100ul，其中MgCl21.0mMdNTP(each)0.3mMPlatinum Pfx DNA Polymerase(Invitrogen Corporation)0.05U/μLPCR反應(yīng)條件94℃ 3分鐘，30X(94℃ for 30秒，60℃ for 45秒，and 68℃ for 60秒)，extension at 68℃ 7分鐘。利用Pfx聚合酶，通過PCR反應(yīng)，將樣品DNA進(jìn)行全基因組擴增。
PCR擴增后產(chǎn)物經(jīng)QIAGEN多孔純化板純化，濃縮。將濃縮后的擴增產(chǎn)物稀釋至40μg/45μL。通過DNA酶片段化，使之成為20-200bp左右的小片段DNA。片段化產(chǎn)物經(jīng)過標(biāo)記反應(yīng)，在核酸片段末端添加熒光標(biāo)記物，再與AffymetrixGeneChip Human Mapping 50K Array Xba 240和Hind 240基因芯片上特異的寡核苷酸探針雜交。
雜交后的芯片經(jīng)Fluidics Station 450(Affymetrix)洗滌、染色，去處干擾信號，用GeneChip Scanner 3000掃描儀和GeneChip GCOS software，GeneChip DNA Analysis Software(GDAS)3.0分析軟件進(jìn)行單核苷酸等位基因檢測，通過識別基因芯片上特異位點的雜交信號檢測不同的單核苷酸位點是否存在多態(tài)性。
實施例312種單核苷酸多態(tài)性位點與精神分裂癥的相關(guān)性統(tǒng)計利用Varial.0(Silicon Genetics)軟件通過對全基因組115,071個SNP劃分Block，構(gòu)建Haplotype，進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析。統(tǒng)計學(xué)的顯著性水平設(shè)定為False Discovery Rate(FDR)＜0.01。
結(jié)果位于基因組中的一組12種單核苷酸多態(tài)性位點rs7132475；rs7972508；rs10507101；rs1847533；rs2343249；rs1113996；rs807559；rs1888547；rs868276；rs883314；rs1604142；rs10498777的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表1。
表一、中國和英國人群中FDR(q＜0.01)的12個單核苷酸多態(tài)性位點。

從上表中可見單核苷酸多態(tài)性位點rs7132475；rs7972508；rs10507101；rs1847533；rs2343249；rs1113996；rs807559；rs1888547；rs868276；rs883314；rs1604142；rs10498777軍均檢測到明顯的單核苷酸多態(tài)性，其統(tǒng)計學(xué)分析FDR值均低于0.01，是產(chǎn)生精神分裂癥的危險等位位點。
本發(fā)明的具有實用性的例證1)采用本發(fā)明提供的實驗方法可以特異、高效的檢測出上述單核苷酸多態(tài)性位點。
2)可以利用本發(fā)明所介紹的方法以及上述1所述等位位點作為藥物設(shè)計靶點來進(jìn)行藥物的篩選，促進(jìn)新的抗精神疾病藥物的發(fā)現(xiàn)。
3)利用本發(fā)明提供的精神分裂癥相關(guān)的基因及其多態(tài)性位點的核酸序列，構(gòu)建對精神分裂癥進(jìn)行遺傳學(xué)診斷的試劑盒。
4)所建立的方法可用于分析人類基因組上述單核苷酸多態(tài)性位點，來應(yīng)用于對精神分裂癥的輔助診斷和對個體是否具有精神分裂癥的易感性進(jìn)行評判。從而有利于疾病的預(yù)防、早期診斷和治療。
權(quán)利要求
1.一種檢測與精神分裂癥相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于它包括步驟(a)收集待測者的靜脈血液樣品，提取DNA；(b)取250ng基因組DNA分別用Xba I or Hind III于37℃酶切2小時，70℃滅活20分鐘；(c)酶切后的DNA分別用0.25μM Xba I or Hind III adapter和250UT4 DNA聯(lián)結(jié)酶16℃聯(lián)結(jié)2小時，70℃滅活20分鐘；(d)連接產(chǎn)物分成3孔，每孔PCR反應(yīng)體系總體積為100ul；(e)PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)純化，與Affymetrix GeneChip Human Mapping 50KArray Xba 240和Hind 240基因芯片雜交；(f)雜交后的芯片經(jīng)洗滌、染色，用掃描儀和分析軟件檢測單核苷酸位點是否存在多態(tài)性。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測與精神分裂癥相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征是，步驟(d)中，其中MgCl21.0mM，dNTP(each)0.3mM，Platinum PfxDNA Polymerase0.05U/μL。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測與精神分裂癥相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征是，所述的PCR反應(yīng)，其條件94℃3分鐘，30×(94℃for30秒，60℃for45秒，and68℃for60秒)，extension at68℃7分鐘。
4.如權(quán)利要求1所述的檢測與精神分裂癥相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征是，步驟(f)中，檢測rs7132475；rs7972508；rs10507101；rs1847533；rs2343249；rs1113996；rs807559；rs1888547；rs868276；rs883314；rs1604142；rs10498777單核苷酸位點是否存在多態(tài)性。
全文摘要
檢測單核苷酸多態(tài)性的方法。包括收集待測者的靜脈血液樣品，提取DNA；取250ng基因組DNA分別酶切；酶切后DNA聯(lián)結(jié)酶聯(lián)結(jié)；連接產(chǎn)物分成3孔，每孔PCR反應(yīng)體系總體積為100ul；PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)純化，與基因芯片雜交；雜交后的芯片經(jīng)洗滌、染色，用掃描儀和分析軟件檢測單核苷酸位點是否存在多態(tài)性。本發(fā)明利用分子標(biāo)記檢測單核苷酸多態(tài)性的方法，而不依賴于醫(yī)生對診斷對象的主觀判斷。由于血液具有取材方便，無創(chuàng)傷性，并可連續(xù)檢測的優(yōu)點，因此本發(fā)明使診斷具有極大的臨床應(yīng)用的可能。本發(fā)明同時可用于評價治療精神分裂癥藥物的療效，指導(dǎo)藥物開發(fā)。
文檔編號C12Q1/68GK1706968SQ20051002620
公開日2005年12月14日 申請日期2005年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月26日
發(fā)明者賀林, 秦?zé)? 師詠勇, 卞莉, 馮國鄞 申請人:上海交通大學(xué)