專利名稱：一種腫瘤相關(guān)基因突變的pcr檢測方法及試劑系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬藥物療效檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種腫瘤相關(guān)基因突變的PCR檢測方法及試劑系統(tǒng)。更進(jìn)一步，涉及一種與分子靶向抗癌藥物療效相關(guān)的EGFR和ras基因突變的TaqMan-MGB實時熒光定量PCR方法及其試劑系統(tǒng)。本發(fā)明可對腫瘤相關(guān)基因的特定位點的突變及其突變類型進(jìn)行檢測，用于分子靶向抗腫瘤新藥的療效預(yù)測和腫瘤患者的臨床個體化用藥方案的指導(dǎo)。
背景技術(shù)：
現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究表明，腫瘤的發(fā)病機制和治療效果與腫瘤相關(guān)基因，即癌基因和抑癌基因的體細(xì)胞突變具有密切關(guān)系。腫瘤相關(guān)基因包括EGFR(表皮生長因子受體)；VEGFR(血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體)；ras基因家族；myc基因家族等。分子靶向藥物是根據(jù)腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞分子生物學(xué)特征差異而研發(fā)的，阻斷腫瘤細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的新型抗癌藥物，如易瑞沙(Iressa)，阿瓦斯汀(Avastin)，格列衛(wèi)(Glivec)，埃比特斯(Erbitux)，Tarceva等。靶向治療藥物有其特殊性，它并非對所有的患者均有效，它僅對部分有特殊基因突變或腫瘤標(biāo)志物表達(dá)的患者有較好的療效。如易瑞沙(Iressa)對EGFR突變的非小細(xì)胞肺癌患者有接近80％的有效率，對于沒有EGFR突變的，則有效率很低。格列衛(wèi)(Glivec)僅對有CD117的胃腸間質(zhì)瘤有效，和赫塞汀亦主要對表達(dá)HER-2的患者有效。因而，在分子靶向治療藥物的臨床用藥之前，對適用的腫瘤個體患者給予藥物療效預(yù)測是非常重要的。本發(fā)明以分子靶向抗癌藥物療效相關(guān)的腫瘤相關(guān)基因如EGFR，ras的突變位點為檢測靶點，使用高靈敏度的TaqMan-MGB(Taqman-大溝結(jié)合蛋白)反應(yīng)系統(tǒng)，通過實時熒光定量PCR方法對個體腫瘤相關(guān)基因突變類型進(jìn)行檢測，并用于分子靶向抗癌藥物對個體治療療效的預(yù)測。
EGFR基因定位于第7號染色體上，編碼產(chǎn)物為P170的糖蛋白，屬于受體型酪氨酸蛋白激酶。相當(dāng)多的腫瘤細(xì)胞發(fā)生了EGFR基因突變，部分EGFR突變已經(jīng)證實與腫瘤分子靶向抗癌藥物的療效有相關(guān)性。其中EGFR外顯子18，外顯子19，外顯子21等的缺失突變和錯配突變與抗癌新藥Iressa的療效關(guān)系密切。本發(fā)明針對上述突變位點，設(shè)計了成套特異性的擴增引物和TaqMan探針，建立了反應(yīng)試劑系統(tǒng)和試劑盒，可以采用實時熒光定量PCR儀對不同腫瘤個體進(jìn)行突變類型檢測，從而預(yù)測腫瘤患者對易瑞沙(Iressa)的藥物敏感性和治療效果。
實時熒光定量PCR技術(shù)與常規(guī)PCR相比，特異性好，具有引物和探針的雙重特異性，敏感度高，通常達(dá)102拷貝/ml，且線性范圍很寬，為0-1011拷貝/ml，重復(fù)性好，以CT值為閾，更穩(wěn)定精確地反映起始模板的拷貝數(shù)。可有效解決產(chǎn)物污染的風(fēng)險。TaqMan-MGB熒光探針原理為PCR擴增時在加入一對引物的同時加入熒光探針，探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。其中的MGB探針技術(shù)則具有提高探針Tm(15mer提高18℃)和提高配對探針與非配對探針Tm差異的雙重功能，使探針設(shè)計更短，具有更好的淬滅效果，明顯降低背景熒光，提高信噪比。本發(fā)明基于以上技術(shù)原理，以EGFR等藥物靶點基因為目的基因，自主設(shè)計建立了成套特異性寡核苷酸引物序列和探針系統(tǒng)和采用實時熒光定量PCR儀的腫瘤相關(guān)基因突變檢測方法，應(yīng)用于分子靶向抗癌藥物的療效預(yù)測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提出一種應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷和分子靶向新藥療效篩選的腫瘤相關(guān)基因突變的PCR檢測方法和試劑系統(tǒng)，尤其是基于TaqMan-MGB探針的實時熒光定量PCR檢測試劑和檢測方法。
本發(fā)明提出的腫瘤相關(guān)突變基因的PCR檢測方法，是以腫瘤相關(guān)基因為檢測目的基因，使用專門設(shè)計的特異性寡核苷酸引物序列和探針，采用TaqMan-MGB檢測試劑系統(tǒng)，通過實時熒光定量PCR方法，對腫瘤相關(guān)基因的特定位點突變進(jìn)行檢測。
本發(fā)明中所述的腫瘤相關(guān)基因是指EGFR基因及其突變基因和ras基因及其突變基因。
所述的特異性寡核苷酸引物序列和探針如下引物序列至少包括下述之一種，以及由該引物序列采用任意標(biāo)記方法或修飾方法而生成的寡核苷酸衍生物


探針至少包括下述之一種，以及由該探針采用任意標(biāo)記方法或修飾修飾方法而生成的寡核苷酸衍生物


其中，F(xiàn)代表FAM基團，P代表MGB基團，7代表TET基團，6代表HEX基團。
所述的突變位點包括(1)在EGFR基因(含基因組DNA和mRNA)的片段SEQ.ID.NO1中的突變位點(＞表示錯配突變，del表示缺失突變)EGFR exon 182155G＞AEGFR exon 192235_2249del GGAATTAAGAGAAGC2236_2250del GAATTAAGAGAAGCA2238_2255del ATTAAGAGAAGCAACATC2239_2247del TTAAGAGAA2240_2257del TAAGAGAAGCAACATCTC2254_2277del TCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATC2248 G＞C2237 A＞TEGFR exon 212573 T＞G(2)ras基因片段(含基因組DNA和mRNA)的片段SEQ.ID.NO2中加下劃線的三個核苷酸即GGT的任一核苷酸的任何缺失和錯配突變。尤其特指GGT＞TGT；GGT＞GTT；GGT＞AGT等突變。
本發(fā)明的所述的Taqman-MGB檢測試劑系統(tǒng)是指包含有本方法所涉及的任何特異性寡核苷酸引物序列和探針的實時熒光定量PCR試劑系統(tǒng)，由下述組成一和組成二--四中任意一項或多項而構(gòu)成。組成一--四具體如下組成一Taqman-MGB實時熒光定量PCR試劑系統(tǒng)(1)5XPCR反應(yīng)緩沖液 含50-250mmol/L Tris·Cl(20℃下pH8.3-8.8)，100-500mmol/L KCl，0.5-25mmol/L MgCl2，25mmol/L的二硫蘇糖醇，0.25-2.5％Triton X-100(2)dNTP 含0.6-15mmol/L各種dNTP；(3)前向引物和后向引物 指按照本發(fā)明所涉及的引物序列所合成的引物，各種引物濃度范圍10-200μmol/L。
(4)探針 指按照本發(fā)明所涉及的探針序列所合成的探針，探針濃度范圍10-200μmol/L；(5)熱啟動DNA多聚酶 0.5-5U；組成二DNA提取試劑系統(tǒng)可用于標(biāo)本DNA抽提的酚/氯仿法，微量離心柱法或簡化方法的試劑系統(tǒng)；組成三RNA提取試劑系統(tǒng)可用于標(biāo)本RNA抽提的異硫氰酸胍/酚/氯仿法，微量離心柱法或簡化方法的試劑系統(tǒng)；組成四反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑系統(tǒng)采用M-MLV；AMV或其它具有反轉(zhuǎn)錄活性的酶類催化的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的試劑系統(tǒng)。
上述試劑系統(tǒng)可制成相應(yīng)試劑盒。
本發(fā)明所涉及的EGFR和ras基因突變及其突變類型的檢測方法的具體操作介紹如下本方法的檢測標(biāo)本種類包括手術(shù)標(biāo)本，活檢標(biāo)本，外周血，胸腹水，石蠟包埋組織等本方法的檢測目標(biāo)基因包括與分子靶向抗癌藥物的療效相關(guān)的腫瘤相關(guān)基因。具體則指EGFR基因及其突變基因；ras基因及其突變基因。
本方法所涉及的設(shè)備包括臺式高速離心機，超凈工作臺，熒光定量PCR儀等。
本發(fā)明方法的基本步驟1、標(biāo)本的前處理及其DNA抽提手術(shù)標(biāo)本和活檢標(biāo)本標(biāo)本量活檢腫瘤標(biāo)本或手術(shù)腫瘤標(biāo)本5-50mg。研磨棒研磨組織后，采用下述方法之一抽提DNA(1)酚/氯仿DNA純化法，(2)微量離心柱法，(3)其它簡化抽提法?；虿捎孟率龇椒ㄖ怀樘酭NA(1)異硫氰酸胍/酚/氯仿總RNA純化法，(2)微量離心柱法，(3)其它簡化抽提法。
外周血和胸腹水標(biāo)本量外周血0.5-3ml，胸腹水2-5ml。均使用檸檬酸鈉抗凝。
外周血標(biāo)本加入2-5倍體積的紅細(xì)胞裂解液，混勻后冰浴10-20分鐘。1000rpm離心5-15分鐘。去上清。采用下述方法之一抽提DNA(1)酚/氯仿DNA純化法，(2)微量離心柱法，(3)其它簡化抽提法?；虿捎孟率龇椒ㄖ怀樘酭NA(1)異硫氰酸胍/酚/氯仿總RNA純化法，(2)微量離心柱法，(3)其它簡化抽提法。
胸腹水標(biāo)本1000rpm離心5-10分鐘后，去上清，保留約1ml殘液。加入2-5倍體積的紅細(xì)胞裂解液，混勻后冰浴10-20分鐘。1000rpm離心5-15分鐘。去上清。采用下述方法之一抽提DNA(1)酚/氯仿DNA純化法，(2)微量離心柱法，(3)其它簡化抽提法。或采用下述方法之一抽提RNA(1)異硫氰酸胍/酚/氯仿總RNA純化法，(2)微量離心柱法，(3)其它簡化抽提法。
石蠟包埋組織標(biāo)本量3～10片5-10μm厚的石蠟包埋組織塊切片。采用下述方法之一抽提DNA(1)改良酚/氯仿DNA純化法。(2)Gpelz氏石蠟包埋組織DNA提取法。
2、標(biāo)本RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用下述方法之一(1)反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV催化的任何cDNA合成方法。(2)反轉(zhuǎn)錄酶AMV催化的任何cDNA合成方法。(3)其它具有反轉(zhuǎn)錄活性的酶類催化的任何cDNA合成方法3、Taqman-MGB實時熒光定量PCR方法反應(yīng)系統(tǒng)組分包含本發(fā)明所涉及的任何特異性寡核苷酸引物序列和探針的任何Taqman-MGB實時熒光定量PCR方法。
本發(fā)明使用的反應(yīng)體系如下(1)PCR反應(yīng)緩沖液 終濃度含10-50mmol/L Tris·Cl(20℃下pH8.3-8.8)，20-100mmol/L KCl，0.1-5mmol/L MgCl2，5mmol/L的二硫蘇糖醇，0.05-0.5％TritonX-100。
(2)dNTP終濃度含0.02-0.5mmol/L各種dNTP(3)前向引物和后向引物 終濃度含0.2-2μmol/L各種引物(4)模板DNA 0.1-5μg模板DNA(5)探針終濃度含0.2-2μmol/L探針(6)熱啟動DNA多聚酶0.5-5U擴增條件實時熒光定量PCR儀，采用如下參數(shù)94℃，1-5分鐘；94℃，1-5秒；60℃，5-30秒。35-50個循環(huán)。
本發(fā)明涉及的用途包括用途一 用于腫瘤相關(guān)基因的突變檢測。腫瘤相關(guān)基因具體則指EGFR；VEGFR；ras；myc等。突變具體則指腫瘤相關(guān)基因的錯配突變；缺失突變和插入突變。
用途二 用于分子靶向抗腫瘤物藥的療效預(yù)測。分子靶向抗腫瘤藥物具體則指易瑞沙(Iressa)，阿瓦斯汀(Arastin)，格列衛(wèi)(Glivec)，埃比特斯(Erbitux)，Tarceva等。
用途三 用于腫瘤患者的臨床個體化用藥方案的指導(dǎo).具體來說，本發(fā)明用于判斷腫瘤患者是否適宜于采用易瑞沙(Iressa)，阿瓦斯汀(Arastin)，格列衛(wèi)(Glivec)，埃比特斯(Erbitux)，Tarceva等分子靶向抗腫瘤藥物進(jìn)行治療。
具體實施例方式
實施例1纖維支氣管鏡標(biāo)本和手術(shù)標(biāo)本的基因組EGFR突變檢測及其Iressa藥物敏感性預(yù)測(1)標(biāo)本DNA抽提酚/氯仿DNA純化法。取纖維支氣管鏡腫瘤標(biāo)本或手術(shù)腫瘤標(biāo)本2-10mg，倒入液氮，磨成粉末，加1ml分離緩沖液(10mmol/L Tris·ClpH7.4，10mmol/LNaCl，25mmol/LEDTA)；加0.1ml 10％SDS，混勻，此時樣品變得很粘稠；加5ul或0.1mg蛋白酶K，37℃保溫1-2小時，直到組織完全解體。加0.1ml 5mol/L NaCl，混勻，5000rpm離心數(shù)秒鐘。取上清液于新離心管，用等體積酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提。待分層后，3000rpm離心5分鐘。取上層水相至干凈離心管，加2倍體積乙醚抽提(在通風(fēng)情況下操作)。移去上層乙醚，保留下層水相。加1/10體積3mol/L NaAc，及2倍體積無水乙醇顛倒混合沉淀DNA。-20℃下靜止10-20分鐘，待DNA沉淀。5000rpm離心數(shù)秒鐘，倒去上清。70％乙醇中漂洗后，吹干，溶解于0.1ml TE中，-20℃保存。
(2)常規(guī)PCR反應(yīng)系統(tǒng)依次混勻下列試劑35μl H2O5μl 10×PCR反應(yīng)緩沖液4μl 25mmol/L MgCl24μl 4種dNTP0.5μl EGFR19 FP引物0.5μl EGFR19 RP引物0.5μl 模板DNA(約1ng)混勻后離心5秒。
若擴增EGFR exon 21基因片段，則加EGFR21FP引物和EGFR21RP引物。
若擴增EGFR exon 18基因片段，則加EGFR18FP引物和EGFR18RP引物。
若擴增ras基因片段，則加rasFP引物和rasRP引物。
將混合物在94℃下加熱5分鐘后冰冷，迅速離心數(shù)秒，使管壁上液滴沉至管底，加入Taq DNA聚合酶(0.5μl約2.5U)，混勻后稍離心，加入一滴礦物油覆蓋于反應(yīng)混合物上。
用94℃變性1分鐘，56℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘，循環(huán)35輪，進(jìn)行PCR。最后一輪循環(huán)結(jié)束后，于72℃下保溫10分鐘，使反應(yīng)產(chǎn)物擴增充分。
取10μl擴增產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，檢查反應(yīng)產(chǎn)物及長度。
(3)Taqman-MGB實時熒光定量PCR檢測突變使用下述反應(yīng)體系5×PCR Buffer5μldNTP Mixture 0.75μlMg Solution 0.5μlEGFR19 FP引物0.5μlEGFR19 RP引物0.5μl探針EGFR19FAM(另一管為EGFR19TET) 0.6μlEx Taq HS0.25μl標(biāo)本基因組DNA1μldH2O 補充至25μl若檢測EGFR exon 21基因突變，則加EGFR21-FP引物，EGFR21-RP引物及探針EGFR-21FAM，EGFR21-TET。
若檢測EGFR exon 18基因突變，則加EGFR18-FP引物，EGFR18-RP引物及探針EGFR18-FAM，EGFR18-TET。
若檢測ras基因突變GGT＞TGT，則加ras-FP引物，ras-RP引物及探針ras-N1-FAM，ras-M1-TET。
若檢測ras基因突變GGT＞GTT，則加ras-FP引物，ras-RP引物及探針ras-N1-FAM，ras-M2-TET。
若檢測ras基因突變GGT＞AGT，則加ras-FP引物，ras-RP引物及探針ras-N1-FAM，ras-M3-TET。
擴增條件
94℃，3min94℃，5s→60℃，30s 50個循環(huán)。
檢測結(jié)果選取的40例基因組DNA(8例在EGFR21外顯子處有突變，32例正常對照)，檢測它們與EGFR21FAM、EGFR21TET的反應(yīng)情況。在EGFR21外顯子處有突變的8例基因組DNA與EGFR21FAM、EGFR21TET反應(yīng)時均有特異性擴增曲線出現(xiàn)，32例正常對照僅與EGFR21TET反應(yīng)時才出現(xiàn)擴增曲線。
檢測結(jié)論8例腫瘤標(biāo)本的基因組DNA發(fā)生EGFR21外顯子突變，對Iressa可能有良好的反應(yīng)性。
實施例2纖維支氣管鏡標(biāo)本和手術(shù)標(biāo)本的EGFR mRNA突變檢測及其Iressa藥物敏感性預(yù)測(1)標(biāo)本總RNA抽提異硫氰酸胍/酚/氯仿總RNA純化法。將纖維支氣管鏡標(biāo)本和手術(shù)標(biāo)本腫瘤組織在液氮中磨成粉末后，再以2-50mg組織加入1ml Trizol液研磨，研磨液室溫放置5分鐘，加入0.2ml氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒。取上層水相于一新的離心管，加0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘，12000g離心10分鐘。棄去上清液，加入至少1ml 75％乙醇，渦旋混勻，4℃下7500g離心5分鐘。小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥5-10分鐘。然后將RNA溶于水中，或貯存于70％乙醇并保存于-70℃。
(2)cDNA合成方法M-MLV反轉(zhuǎn)錄法。取總RNA 2μg加隨機引物0.5μL(100mg/L)，Rnasin 0.5μL(40uM/L)，加DEPC水至10μL.65℃水浴5min變性后，立即冰浴。再加5×M-MLV緩沖液6μL，5mmol/L dNTP 2μL，Rnasin0.5μL，M-MLV1μL(200Mu/L)，加DEPC水至30μL混勻.37℃60min水浴。反轉(zhuǎn)錄后95℃5min以破壞管中殘余的酶，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物-20℃保存?zhèn)溆谩?br> (3)常規(guī)PCR反應(yīng)系統(tǒng)依次混勻下列試劑35μl H2O5μl 10×PCR反應(yīng)緩沖液4μl 25mmol/L MgCl24μl 4種dNTP0.5μl EGFR19 FP引物0.5μl EGFR19 RP引物0.5μl 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物DNA(約1ng)
混勻后離心5秒。
若擴增EGFR exon 21基因片段，則加EGFR21FP引物和EGFR21RP引物。
若擴增EGFR exon 18基因片段，則加EGFR18FP引物和EGFR18RP引物。
若擴增ras基因片段，則加rasFP引物和rasRP引物。
將混合物在94℃下加熱5分鐘后冰冷，迅速離心數(shù)秒，使管壁上液滴沉至管底，加入Taq DNA聚合酶(0.5μl約2.5U)，混勻后稍離心，加入一滴礦物油覆蓋于反應(yīng)混合物上。
用94℃變性1分鐘，56℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘，循環(huán)35輪，進(jìn)行PCR。最后一輪循環(huán)結(jié)束后，于72℃下保溫10分鐘，使反應(yīng)產(chǎn)物擴增充分。
取10μl擴增產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，檢查反應(yīng)產(chǎn)物及長度。
(3)Taqman-MGB實時熒光定量PCR檢測突變使用下述反應(yīng)體系5×PCR Buffer 5μldNTP Mixture0.75μlMg Solution 0.5μlEGFR19 FP引物 0.5μlEGFR19 RP引物 0.5μl探針EGFR19FAM(另一管為EGFR19TET)0.6μlEx Taq HS 0.25μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物DNA 1μldH2O補充至25μl若檢測EGFR exon 21基因突變，則加EGFR21FP引物，EGFR21RP引物及探針EGFR21FAM，EGFR21TET。
擴增條件94℃，3min94℃，5s→60℃，30s 50個循環(huán)。
檢測結(jié)果選取的40例手術(shù)標(biāo)本(DNA在EGFR21外顯子處有突變，32例正常對照)，檢測它們EGFR mRNA突變情況。在8例基因組EGFR21外顯子處有突變的標(biāo)本，其EGFR mRNA與EGFR21FAM、EGFR21TET反應(yīng)時均有特異性擴增曲線出現(xiàn)。32例正常對照的EGFR mRNA僅與EGFR21TET反應(yīng)時才出現(xiàn)擴增曲線。
檢測結(jié)論檢測腫瘤標(biāo)本EGFR mRNA突變的結(jié)果與檢測腫瘤標(biāo)本基因組EGFR的結(jié)果是一致的，同樣可以用于Iressa敏感性預(yù)測。
實施例3基因組DNA快速簡化抽提法的EGFR突變檢測及其Iressa藥物敏感性預(yù)測(1)標(biāo)本DNA抽提快速簡化抽提法。取纖維支氣管鏡腫瘤標(biāo)本或手術(shù)腫瘤標(biāo)本約1mg，加入50μl含0.38mg/ml的蛋白酶K的TE緩沖液，60℃30分鐘，100℃水浴15分鐘，14000r/min離心2分鐘后分別取0.5-1μl上清液作為PCR反應(yīng)模板。
(2)常規(guī)PCR反應(yīng)系統(tǒng)同實施例1。
(3)Taqman-MGB實時熒光定量PCR檢測突變同實施例1。
實施例4基因組DNA微量離心柱提取法EGFR突變檢測及其Iressa藥物敏感性預(yù)測(1)標(biāo)本DNA抽提微量離心柱提取法。取纖維支氣管鏡腫瘤標(biāo)本或手術(shù)腫瘤標(biāo)本約1mg，加200μl組織裂解液，研磨。加200μl中和液，顛倒離心管數(shù)次。4℃下12000g離心5分鐘，取上清液于新的eppendorf管中。加異丙醇500μl充分混勻。加入微量離心柱，4℃下12000g離心1分鐘。加洗滌液洗滌一次，加去蛋白液洗滌一次，微量離心柱移入新的離心管，加50μl TE緩沖液，靜止1分鐘后，4℃下12000g離心20秒離心1分鐘。將離心管DNA貯于4℃或-20℃冰箱。
(2)常規(guī)PCR反應(yīng)系統(tǒng)同實施例1。
(3)Taqman-MGB實時熒光定量PCR檢測突變同實施例1。
實施例5石蠟包埋組織ras基因突變檢測(1)石蠟包埋組織DNA抽提改良酚/氯仿DNA純化法。制備DNA。將甲醛固定、石蠟包埋的組織塊切成8μm厚的薄片，取4～5片放入1.5ml Eppendorf管中。每管加入1.0ml二甲苯，振搖混勻30min，溶解石蠟。10000r/min離心5min，用干凈滴管吸去上清，保留沉淀。重復(fù)加二甲苯步驟一次盡可能除去石蠟。然后加1.0ml無水乙醇，輕輕翻轉(zhuǎn)混勻3min。10000r/min離心5min，除去上清。重復(fù)加無水乙醇盡可能除去二甲苯。最后干燥樣品，使乙醇完全揮發(fā)。制備石蠟包埋組織DNA(1)蛋白酶K消化每管加100～200μl含SDS的細(xì)胞裂解緩沖液，同時加入蛋白酶K，使其終濃度為200μg/ml。65℃水浴數(shù)小時或過夜，不時震搖，至組織消化完全。(2)氯仿抽提加入醋酸鉀溶液，翻轉(zhuǎn)混勻，4℃靜置15min后，加入氯仿，充分震搖后10000r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入一新的Ep管，沉淀棄去。(3)乙醇沉淀DNA加3倍體積的冷無水乙醇至DNA溶液中，翻轉(zhuǎn)混勻，在-20℃過夜、10000r/min離心10min。棄去上清，沉淀以70％乙醇洗滌，再離心棄去上清，將沉淀在室溫中干燥。加入50μlTE(pH8.0)溶解DNA，待其完全溶解后，取少量樣品以752紫外光柵分光光度計測定DNA含量及純度，并作0.8％瓊脂糖凝膠電泳觀察，確定DNA的質(zhì)量。
(2)Taqman-MGB實時熒光定量PCR檢測ras基因突變，突變類型GGT＞TGT等使用下述反應(yīng)體系5×PCR Buffer 5μldNTP Mixture 0.75μlMg Solution 0.5μlras-FP引物0.5μlras-RP引物0.5μl探針ras-M1-FAM(另一管為ras-N1-FAM)0.6μlEx Taq HS 0.25μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物DNA 1μldH2O 補充至25μl若檢測ras基因突變GGT＞GTT，則加探針ras-M2-FAM。若檢測ras基因突變GGT＞AGT，則加探針ras-M3-FAM。
若檢測EGFR exon 21基因突變，則加EGFR21-FP引物，EGFR21-RP引物及探針EGFR-21FAM，EGFR21-TET。
若檢測EGFR exon 18基因突變，則加EGFR18-FP引物，EGFR18-RP引物及探針EGFR18-FAM，EGFR18-TET。
擴增條件94℃，3min94℃，5s→60℃，30s 50個循環(huán)。
檢測結(jié)果選取的20例石蠟包埋標(biāo)本(10例正常對照)，檢測它們ras突變情況。在10例基因組ras有突變的標(biāo)本，其DNA分別與ras-M1-FAM、ras-M2-FAM、ras-M3-FAM、ras-M4-FAM反應(yīng)時均有特異性擴增曲線出現(xiàn)。10例正常對照的ras DNA僅與ras-N1-FAM反應(yīng)時才出現(xiàn)擴增曲線。
檢測結(jié)論石蠟包埋標(biāo)本檢測ras基因突變的結(jié)果與檢測標(biāo)本基因組ras突變類型是一致的，本法可以用于ras基因突變類型的檢測。
序列表SEQ.ID.NO.12101 catcgccact gggatggtgg gggccctcct cttgctgctg gtggtggccc tggggatcgg2161 cctcttcatg cgaaggcgcc acatcgttcg gaagcgcacg ctgcggaggc tgctgcagga2221 gagggagctt gtggagcctc ttacacccag tggagaagct cccaaccaag ctctcttgag2281 gatcttgaag gaaactgaat tcaaaaagat caaagtgctg ggctccggtg cgttcggcac2341 ggtgtataag ggactctgga tcccagaagg tgagaaagtt aaaattcccg tcgctatcaa2401 ggaattaaga gaagcaacat ctccgaaagc caacaaggaa atcctcgatg aagcctacgt2461 gatggccagc gtggacaacc cccacgtgtg ccgcctgctg ggcatctgcc tcacctccac2521 cgtgcagctc atcacgcagc tcatgccctt cggctgcctc ctggactatg tccgggaaca2581 caaagacaat attggctccc agtacctgct caactggtgt gtgcagatcg caaagggcatSEQ.ID.NO.2ATGACTGAATA TAAACTTGTG GTAGTTGGAG CTGGTGGCGT AGGCAAGAGT GCCTTGACGATACAGCTAAT TCAGAATCAT TTTGTGGACG AATATGA TCC A ACA
權(quán)利要求
1.一種腫瘤相關(guān)基因突變的PCR檢測方法，其特征在于以腫瘤相關(guān)基因為檢測目的基因，使用專門設(shè)計的特異性寡核苷酸引物序列和探針，采用TaqMan-MGB檢測試劑系統(tǒng)，通過實時熒光定量PCR方法，對腫瘤相關(guān)基因的特定位點突變進(jìn)行檢測；其中所述的腫瘤基因是指EGFR基因及其突變基因和ras基因及其突變基；所述的特異性寡核苷酸引物序列和探針如下引物序列至少包括下述之一種，以及由該引物序列采用任意標(biāo)記方法或修飾方法而生成的寡核苷酸衍生物
探針至少包括下述之一種，以及由該探針采用任意標(biāo)記方法或修飾修飾方法而生成的寡核苷酸衍生物
其中，F(xiàn)代表FAM基團，P代表MGB基團，7代表TET基團，6代表HEX基團.
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述TaqMan-MGB檢測試劑系統(tǒng)由下述組成一和組成二到四中任意一項或多項構(gòu)成組成一Taqman-MGB實時熒光定量PCR試劑系統(tǒng)(1)5X PCR反應(yīng)緩沖液 含50-250mmol/L Tris·Cl(20℃下pH8.3-8.8)，100-500mmol/L KCl，0.5-25mmol/L MgCl2，25mmol/L的二硫蘇糖醇，0.25-2.5％TritonX-100；(2)dNTP 含0.6-15mmol/L各種dNTP；(3)前向引物和后向引物 由所述引物序列所合成的引物，各種引物濃度范圍10-200μmol/L；(4)探針 由所述探針序列所合成的探針，探針濃度范圍10-200μmol/L；(5)熱啟動DNA多聚酶 0.5-5U；組成二DNA提取試劑系統(tǒng)用于標(biāo)本DNA抽提的酚/氯仿法、微量離心柱法或簡化方法的試劑系統(tǒng)；組成三RNA提取試劑系統(tǒng)用于標(biāo)本RNA抽提的異硫氰酸胍/酚/氯仿法、微量離心柱法或簡化方法的試劑系統(tǒng)；組成四反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑系統(tǒng)采用M-MLV；AMV或其它具有反轉(zhuǎn)錄活性的酶類催化的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的試劑系統(tǒng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于所述的基因突變位點包括(1)EGFR exon 182155 G＞AEGFR exon 192235-2249del GGAATTAAGAGAAGC2236-2250del GAATTAAGAGAAGCA2238-2255del ATTAAGAGAAGCAACATC2239-2247del TTAAGAGAA2240-2257del TAAGAGAAGCAACATCTC2254-2277del TCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATC2248 G＞C2237 A＞TEGFR exon 212573 T＞G其中，＞表示錯配，del表示缺失，數(shù)字表示位點；(2)ras 基因片段ATGACTGAATA TAAACTTGTG GTAGTTGGAG CTGGTGGCGTAGGCAAGAGT GCCTTGACGA TACAGCTAAT TCAGAATCAT TTTGTGGACGAATATGATCCA ACA中加下劃線的三個核苷酸GGT的任一核苷酸的任何缺失和錯配突變，尤其特指GGT＞TGT；GGT＞GTT；GGT＞AGT等突變。
4.一種腫瘤相關(guān)基因突變的PCR檢測試劑系統(tǒng)，其特征在于由下述組成一和組成二到四中任意一項或多項構(gòu)成組成一Taqman-MGB實時熒光定量PCR試劑系統(tǒng)(1)5X PCR反應(yīng)緩沖液 含50-250mmol/L Tris·Cl(20℃下pH8.3-8.8)，100-500mmol/L KCl，0.5-25mmol/L MgCl2，25mmol/L的二硫蘇糖醇，0.25-2.5％TritonX-100；(2)dNTP 含0.6-15mmol/L各種dNTP；(3)前向引物和后向引物 所述引物序列所合成的引物，各種引物濃度范圍10-200μmol/L；(4)探針 所述探針序列所合成的探針，探針濃度范圍10-200μmol/L；(5)熱啟動DNA多聚酶 0.5-5U；組成二DNA提取試劑系統(tǒng)用于標(biāo)本DNA抽提的酚/氯仿法、微量離心柱法或簡化方法的試劑系統(tǒng)；組成三RNA提取試劑系統(tǒng)用于標(biāo)本RNA抽提的異硫氰酸胍/酚/氯仿法、微量離心柱法或簡化方法的試劑系統(tǒng)；組成四反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑系統(tǒng)采用M-MLV；AMV或其它具有反轉(zhuǎn)錄活性的酶類催化的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的試劑系統(tǒng)。
全文摘要
本發(fā)明屬藥物療效檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種腫瘤相關(guān)基因突變的PCR檢測方法及試劑系統(tǒng)。更進(jìn)一步，涉及一種與分子靶向抗癌藥物療效相關(guān)的EGFR和ras基因突變的TaqMan－MGB實時熒光定量PCR方法及其試劑系統(tǒng)。主要內(nèi)容包括分子靶向抗癌藥物療效相關(guān)的特定突變位點，專門設(shè)計的特異性寡核苷酸引物序列和探針序列，測定流程方法，試劑系統(tǒng)和用途。試劑系統(tǒng)是指包含有發(fā)明所涉及的任何特異性寡核苷酸引物序列和探針的實時熒光定量PCR試劑系統(tǒng)。本發(fā)明可對腫瘤相關(guān)基因的特定位點的突變及其突變類型進(jìn)行檢測，用于分子靶向抗腫瘤新藥的療效預(yù)測和腫瘤患者的臨床個體化用藥方案的指導(dǎo)。
文檔編號C12Q1/68GK1710102SQ20051002693
公開日2005年12月21日 申請日期2005年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月20日
發(fā)明者周彩存, 粟波, 潘虹 申請人:上海市肺科醫(yī)院