專利名稱：一種在三七細胞培養(yǎng)中增強原人參三醇型皂甙的生產(chǎn)方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種三七細胞培養(yǎng)方法，特別涉及一種誘導原人參三醇型皂甙甙元合成酶即原人參二醇-6-羥化酶的活性來調(diào)節(jié)人參皂甙的成分比例等，提高原人參三醇型皂甙含量及生產(chǎn)率的培養(yǎng)方法。
背景技術：
三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)又稱田七、三七參、人參三七等，為五加科人參屬植物，主要分布于中國西南部的云南、廣西等地。
《本草綱目》中載有其藥用功效，如活血化瘀、鎮(zhèn)定止痛、止血補血和滋補強壯等功效，現(xiàn)代醫(yī)學研究揭示了三萜類人參皂甙是其主要生物活性成分之一。人參皂甙并非單一成分，它們種類多，根據(jù)其甙元的不同可分為達瑪烷型四環(huán)三萜皂甙和齊墩果烷型五環(huán)三萜皂甙。已經(jīng)證明達瑪烷型四環(huán)三萜皂甙比齊墩果烷型五環(huán)三萜皂甙具有更強的生物活性，前者又分為原人參二醇型(如Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rh2、Rg3等)和原人參三醇型(如Rg1、Rg2、Rg1、Re等)人參皂甙。各人參皂甙單體的生物活性不一，有的甚至相反。例如，Rb1、Rb2抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)，而Rg1興奮中樞神經(jīng)(鄭光植等，三七生物學及其應用，1994)。近來研究發(fā)現(xiàn)，人參皂甙Re具有明顯的抗高血糖活性(Attele等，Diabetes 2002，61851-1858)，可能成為一類新型抗糖尿病藥物；人參皂甙Re和Rg1具有抑制神經(jīng)細胞調(diào)亡作用(Xu等，J Asian Nat Prod Res 2005，7215-224；Chen等，Eur JPharmacal 2003，4731-7)，可能成為一類新型治療帕金森等神經(jīng)性疾病的藥物。原人參三醇型人參皂甙Rg1和Re新生物活性的發(fā)現(xiàn)使其備受關注。
近年來，商業(yè)化人參產(chǎn)品已覆蓋許多國家，僅人參原材料2002年的銷量已超過12億美元(金在漢，碩士學位論文，2004)。
細胞培養(yǎng)法生產(chǎn)人參皂甙有效成份，由于生產(chǎn)周期短、勞動力省以及受外部環(huán)境影響小等優(yōu)點被認為是一種更有效的可操作的方法，因此，利用細胞培養(yǎng)大規(guī)模生產(chǎn)人參皂甙具有較大的市場潛力。由于不同人參皂甙組分的生理活性的差別大，使得總人參皂甙(各單體人參皂甙的混合物)較難顯示良好的原人參三醇型人參皂甙的專一生物活性。并且，如上述，各單體人參皂甙的分子結構非常相似、理化性質(zhì)也相近，故難以簡單把它們分離開來；即使能分離獲得，由此也會大大增加生產(chǎn)成本，這使得以目前的技術用原人參三醇型人參皂甙單體開發(fā)新藥較為困難。
Wang和Zhong(J Biosci Bioeng 2002，9348-53)以及鐘建江和王威(中國發(fā)明專利，ZL 01126882.4)報道了茉莉酮酸類化合物能提高三七細胞的皂甙含量和改變單體含量比例，但這些工作是側重提高原人參二醇型人參皂甙(Rb1)與原人參三醇型人參皂甙(Rg1+Re)的含量的比例。如果能對細胞培養(yǎng)過程中各單體皂甙的積累進行更好調(diào)控，使其生產(chǎn)更多的原人參三醇型人參皂甙，對于其商業(yè)應用無疑具有重要價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術問題是公開一利在三七細胞培養(yǎng)中增強原人參三醇型皂甙的生產(chǎn)方法，以克服現(xiàn)有技術存在的無法提高原人參三醇型人參皂甙含量占總人參皂甙含量比例和生產(chǎn)率偏低的缺陷，為工業(yè)化經(jīng)濟生產(chǎn)原人參三醇型人參皂甙奠定基礎。
本發(fā)明的技術構思是這樣的本發(fā)明在在三七細胞培養(yǎng)基中添加苯巴比妥，誘導原人參二醇-6-羥化酶(P6H)的活性，從而來提高三七細胞原人參三醇型人參皂甙含量比例和生產(chǎn)率。
本發(fā)明的方法包括如下步驟將三七(Panax notoginseng)種子細胞在添加有苯巴比妥的MS培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；所說的MS培養(yǎng)基在文獻Murashige等(Plant Physiol 1962，15473-479)中已經(jīng)有公開的報道；每隔10-15天傳代一次，培養(yǎng)使用旋轉(zhuǎn)式搖床，轉(zhuǎn)速為50-200rpm，培養(yǎng)溫度20-30℃，暗培養(yǎng)；所說的三七細胞的來源，在發(fā)明人以往的專利(中國發(fā)明專利，ZL 01126882.4)中已經(jīng)公開報道，具體如下三七種子經(jīng)消毒后誘導出無菌三七植株，從無菌三七植株剪取0.5-1.0cm長的胚根，在添加有0-20mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)，0-10mg/L6-糠基氨基嘌呤(KT)及10-30g/L蔗糖的MS瓊脂培養(yǎng)基中于20-30℃下暗培養(yǎng)，2-4周后長出愈傷組織。選擇較旺盛生長的愈傷組織接種到裝有50ml新鮮培養(yǎng)基的250ml三角搖瓶中，培養(yǎng)基為添加2mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)、0.7mg/L 6-糠基氨基嘌呤(KT)及30g/L蔗糖的MS液體培養(yǎng)基。每隔10～15天傳代一次，培養(yǎng)使用旋轉(zhuǎn)式搖床，轉(zhuǎn)速為50-200rpm，培養(yǎng)溫度20-30℃，暗培養(yǎng)。
培養(yǎng)基中添加的苯巴比妥的濃度為0.001～10.0mM，特別優(yōu)選的為0.01-5.0mM。
培養(yǎng)基中添加苯巴比妥的時間為培養(yǎng)期間的第0～15天，即苯巴比妥可在培養(yǎng)初期加入培養(yǎng)基，或在培養(yǎng)過程中加入培養(yǎng)基；所說的苯巴比妥可采用商業(yè)化的產(chǎn)品，其化學結構通式如下C12H12O3N2分子量為232.24人參單體皂甙可通過高壓液相色譜法(Wang W & Zhong JJ，J BiosciBioeng 2002，9348-53)測定。
本發(fā)明的方法，可顯著提高P6H酶的活性和原人參三醇型皂甙(Rg1+Re)含量，使原人參三醇型皂甙占總皂甙含量達85％，同時原人參三醇型皂甙生產(chǎn)率提高了約2倍。這表明通過添加苯巴比妥誘導P6H，可有效調(diào)節(jié)單體皂甙組份的多樣性并增強三七培養(yǎng)細胞原人參三醇型皂甙的生產(chǎn)能力，顯示了本發(fā)明的方法具備工業(yè)化實施的前景。
具體實施例方式
實施例1實驗采用的是由多年生三七植株的根誘導而得三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)細胞。對照培養(yǎng)采用MS培養(yǎng)基，另外添加2mg/L 2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)，0.7mg/L 6-糠基氨基嘌呤(KT)及30g/L蔗糖。將真空過濾所得濕細胞2g接種到裝有50ml新鮮培養(yǎng)基的250ml三角搖瓶中，25℃暗培養(yǎng)，細胞在40℃干燥后稱重。P6H活性誘導和單體皂甙的調(diào)控方法是于培養(yǎng)第4天添加苯巴比妥。P6H活性的測定依照岳才軍(博士論文，2005)介紹的方法；干細胞按照Wang和Zhong(J Biosci Bioeng 2002，9348-53)的方法萃取處理后高效液相色譜分析各單體皂甙的含量。結果見表1和表2(培養(yǎng)13天)。
實施例2單體皂甙的調(diào)控采用對照培養(yǎng)基在不同時間添加0.5mM苯巴比妥，其它條件同實例1。結果見表3和表4(培養(yǎng)13天)。
表1.不同濃度苯巴比妥(PB)對P6H酶活性的誘導作用

*kat每秒鐘每毫克蛋白合成原人參三醇的摩爾數(shù)；f＝1×10-15。
表2.不同濃度苯巴比妥(PB)對三七培養(yǎng)細胞人參皂甙含量比例和原人參三醇型皂甙生產(chǎn)率的影響

*Rg∶Rb＝(Rg1+Re)/Rb1。
**生產(chǎn)率是指原人參三醇型人參皂甙(Rg1+Re)的生產(chǎn)率。
表3.不同時間添加苯巴比妥(PB)對P6H酶活性的誘導作用

*kat每秒鐘每毫克蛋白合成原人參三醇的摩爾數(shù)；f＝1×10-15。
表4.不同時間添加苯巴比妥(PB)對三七培養(yǎng)細胞人參皂甙含量比例和原人參三醇型皂甙生產(chǎn)率的影響

*Rg∶Rb＝(Rg1+Re)/Rb1。
**生產(chǎn)率是指原人參三醇型皂甙(Rg1+Re)的生產(chǎn)率。
權利要求
1.一種在三七細胞培養(yǎng)中增強原人參三醇型皂甙的生產(chǎn)方法，其特征在于，包括將三七(Panax notoginseng)種子細胞在添加有苯巴比妥的MS培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的步驟。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)使用旋轉(zhuǎn)式搖床，每隔10-15天傳代一次。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，搖床轉(zhuǎn)速為50-200rpm，培養(yǎng)溫度20-30℃，暗培養(yǎng)。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)基中添加的苯巴比妥的濃度為0.001～10.0mM。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)基中添加的苯巴比妥的濃度為0.01-5.0mM。
6.根據(jù)權利要求1～5任一項所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)基中添加苯巴比妥的時間為培養(yǎng)期間的第0～15天。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種在三七細胞培養(yǎng)中增強原人參三醇型皂甙的生產(chǎn)方法。本發(fā)明的方法是基于對原人參三醇型皂甙甙元(原人參三醇)的合成酶酶活水平的操作。在三七細胞培養(yǎng)過程中添加原人參三醇合成酶酶活的誘導劑苯巴比妥，有效提高了原人參三醇型皂甙含量占總皂甙含量的比例和生產(chǎn)率。占總皂甙含量可達85％，生產(chǎn)率約提高了2倍。本發(fā)明所述的方法克服了現(xiàn)有生產(chǎn)技術存在的原人參三醇型皂甙含量占總人參皂甙含量比例和生產(chǎn)率偏低的缺陷，為工業(yè)化經(jīng)濟生產(chǎn)原人參三醇型皂甙奠定基礎。
文檔編號C12P33/00GK1710093SQ200510027538
公開日2005年12月21日 申請日期2005年7月6日 優(yōu)先權日2005年7月6日
發(fā)明者鐘建江, 岳才軍 申請人:華東理工大學, 上海穎興生物科技有限公司