專利名稱：斑馬魚卵黃蛋白原－1基因調(diào)控序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生命科學(xué)領(lǐng)域。涉及斑馬魚卵黃蛋白原-1(vitellogenin1，vtg1)基因表達(dá)的某段調(diào)控序列。利用轉(zhuǎn)基因斑馬魚實(shí)驗(yàn)，證明該序列在斑馬魚體內(nèi)具有啟動(dòng)子活性，能夠在雌激素誘導(dǎo)下，啟動(dòng)下游基因在肝臟特異性表達(dá)。
背景技術(shù)：
卵黃蛋白原(vitellogenin，vtg)是三種卵黃蛋白的前體，特異地存在于成熟卵生雌性動(dòng)物血液中，為正在發(fā)育的胚胎提供氨基酸、脂肪、碳水化合物、維生素、磷和硫等營(yíng)養(yǎng)和功能性物質(zhì)。斑馬魚的vtg分為7種亞型，vtg1-vtg7，生理情況下主要只在成熟雌魚肝臟表達(dá)；受到水體中各種環(huán)境雌激素作用后，雄魚和幼魚會(huì)從無到有地表達(dá)vtg。其中vtg1的mRNA表達(dá)水平比其他亞型高得多(100-1000倍)。近年來，斑馬魚體內(nèi)vtg1的表達(dá)成為篩選和檢測(cè)環(huán)境雌激素的重要指標(biāo)[Marin MG，et al.Mar Pollut Bull.2004 May；48(9-10)835-9]。
檢測(cè)斑馬魚vtg1表達(dá)水平的方法通常為RT-PCR，ELISA，Western-blot。這些方法需要提取RNA或蛋白質(zhì)，實(shí)驗(yàn)時(shí)必須將斑馬魚殺死，采用昂貴的試劑(酶或抗體)，進(jìn)行繁雜的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果是靜態(tài)的，不能在活體直接觀察到[Nilsen BM，etal.Anal Bioanal Chem.2004 Feb；378(3)621-33]。隨著斑馬魚轉(zhuǎn)基因技術(shù)的逐漸成熟，構(gòu)建一種能直接反映vtg1表達(dá)情況的轉(zhuǎn)基因斑馬魚成為研究熱點(diǎn)之一，如轉(zhuǎn)基因斑馬魚將應(yīng)該能夠表達(dá)某種報(bào)告基因，如綠色熒光蛋白(enhanced greenfluorescent protein，EGFP)，并且EGFP的表達(dá)和vtg1的表達(dá)一致。通過熒光顯微鏡用肉眼直接觀察EGFP的綠色熒光，就可得知vtg1的表達(dá)情況，從而判斷水體中是否存在雌激素活性物質(zhì)。這種轉(zhuǎn)基因斑馬魚具有其他方法所無法比擬的優(yōu)勢(shì)可直接在活體進(jìn)行觀察，方法十分簡(jiǎn)便，不需要專業(yè)人員，不需要任何試劑，所需要的僅僅是一臺(tái)普通的熒光顯微鏡。故，檢驗(yàn)成本會(huì)明顯低廉，易于普及應(yīng)用，尤其在許多并不具備實(shí)驗(yàn)條件的地區(qū)，這種轉(zhuǎn)基因魚將成為人們的“環(huán)保哨兵”。
要構(gòu)建上述轉(zhuǎn)基因魚，首先必須獲得調(diào)控斑馬魚vtg1表達(dá)的啟動(dòng)子序列，利用所獲序列調(diào)控EGFP的表達(dá)。斑馬魚vtg1的cDNA和蛋白序列屬已知序列，但調(diào)控其表達(dá)的啟動(dòng)子DNA序列尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供具有啟動(dòng)子活性的斑馬魚卵黃蛋白原-1(vitellogenin1，vtg1)基因調(diào)控序列，尤其是zfvtg1-1.7的DNA序列(zebrafish vitellogenin 1-1.7)。利用所獲序列調(diào)控EGFP的表達(dá)，達(dá)到檢測(cè)環(huán)境雌激素的目的。
本發(fā)明提供了序列1的模式生物斑卵黃蛋白原-1基因上游的一段具有表達(dá)調(diào)控作用的DNA序列，由1720個(gè)核苷酸組成，命名為zfvtg1-1.7(zebrafishvitellogenin 1-1.7)。
本發(fā)明采用已知的斑馬魚vtg1的cDNA和蛋白序列，用上述zfvtg1-1.7序列建立轉(zhuǎn)基因斑馬魚，通過RT-PCR和原位雜交技術(shù)證實(shí)了zfvtg1-1.7在斑馬魚體內(nèi)具有下述啟動(dòng)子活性1)受到雌激素誘導(dǎo)；2)肝臟特異性。
本發(fā)明首先在Trust Sanger Institude斑馬魚數(shù)據(jù)庫中查找vtg1基因，并向上游追溯可能的啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增斑馬魚基因組DNA，得到一段1720bp的DNA序列。
本發(fā)明將所獲的序列與增強(qiáng)的綠色熒光蛋白基因(enhanced greenfluorescent protein，EGFP)連接，得到融合基因zfvtg1-1.7-EGFP。按照《zebrafishbook》中所描述，將zfvtg1-1.7-EGFP整合到斑馬魚基因組中，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因斑馬魚。用原位雜交和RT-PCR的方法，證明了轉(zhuǎn)基因斑馬魚EGFP的表達(dá)和vtg1的表達(dá)在時(shí)間和空間上一致，證實(shí)了zfvtg1-1.7的啟動(dòng)子活性。
采用本發(fā)明提供的zfvtg1-1.7序列與報(bào)告基因(熒光蛋白)連接，可以在轉(zhuǎn)基因斑馬魚的活體內(nèi)觀察熒光，從而快速直觀地反映vtg1的表達(dá)。而vtg1的表達(dá)是反映雌激素活性的重要指標(biāo)，因此，可以通過觀察魚體的熒光來判斷水體中是否存在雌激素樣物質(zhì)。
本發(fā)明為構(gòu)建檢測(cè)雌激素水平的熒光斑馬魚奠定了基礎(chǔ)，對(duì)保護(hù)人類自身安全和健康繁衍具有積極意義。


圖1肝臟中綠色熒光蛋白和vtg1的共表達(dá)(5dpf)。
圖中均為5天大小的斑馬魚，紅色箭頭所指分別為肝臟中綠色熒光蛋白(A、B、C)和vtg1(D、E、F)的表達(dá)，其中，A、D轉(zhuǎn)基因斑馬魚在含有100ng/L 17α-炔雌醇的系統(tǒng)水中養(yǎng)殖5天，B、E轉(zhuǎn)基因斑馬魚在含有等體積溶劑-0.001％乙醇的系統(tǒng)水中養(yǎng)殖5天，C、F野生型斑馬魚。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 獲得zfvtg1-1.7的DNA序列1.斑馬魚的養(yǎng)殖野生型斑馬魚(Danio rerio)購(gòu)自國(guó)際斑馬魚資源中心，斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)從美國(guó)Aquatic Habitats公司引進(jìn)，喂養(yǎng)方案按照Zebrafish Book描述進(jìn)行。
2.提取斑馬魚基因組DNA采用美國(guó)promega公司的基因組DNA提取試劑盒提取斑馬魚基因組DNA。
3.引物設(shè)計(jì)根據(jù)Trust Sanger Institude斑馬魚數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)的vtg1基因(IDENSDARG00000016825)設(shè)計(jì)了序列2、序列3的引物，并引入HindIII和BamHI酶切位點(diǎn)P15′-GCTGCAAGCTTACTAATAGGAAGCCAACGAAGGACC-3′(序列2)P25’-CTCGGATCCGCTACAGTCAAGGCAAGCACAACAGC-3’ (序列3)所述引物由上海賽百盛生物技術(shù)公司合成。
4.克隆zfvtg1-1.7序列Zfvtg1-1.7序列的克隆按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》的方法進(jìn)行。
(1)從基因組中擴(kuò)增zfvtg1-1.7序列取上述提取的斑馬魚基因組DNA，用引物P1，P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下滅菌去離子水 32μL10×PCR緩沖液 5μLdNTP(2.5mM each) 8μLP11μLP21μL基因組DNA 2μL
Takara LA Taq DNA聚合酶(5U/μL)1μL總體積 50μL反應(yīng)條件94℃5分鐘，(94℃1分鐘，62℃1分鐘，72℃2分鐘)×30循環(huán)，72℃7分鐘。
取PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％的瓊脂糖凝膠電泳，分析產(chǎn)物片斷的大小。并用美國(guó)promega公司的核酸純化試劑盒純化上述PCR產(chǎn)物。
(2)構(gòu)建zfvtg1-1.7-EGFP重組質(zhì)粒純化后的PCR產(chǎn)物用HindIII和BamHI雙酶切，與同樣雙酶切的的pEGFP-1載體連接，反應(yīng)體系如下pEGFP-11μLPCR產(chǎn)物4μLSolI(含連接酶) 5μL16℃連接3小時(shí)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，抽提質(zhì)粒酶切鑒定，送上?；瞪锛夹g(shù)公司測(cè)序。該重組質(zhì)粒命名為zfvtg1-1.7-EGFP。
所述pEGFP-1載體購(gòu)自Clontech公司；限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司；快速連接試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；DH5α菌株由本室保存。
實(shí)施例2 zfvtg1-1.7-EGFP啟動(dòng)子活性的鑒定(EGFP和vtg1的時(shí)空表達(dá)一致)1.構(gòu)建zfvtg1-1.7-EGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚2.斑馬魚的養(yǎng)殖，轉(zhuǎn)基因技術(shù)和熒光觀察方法參照《Zebrafish Book》。
(1)斑馬魚養(yǎng)殖野生型斑馬魚(Danio rerio)購(gòu)自國(guó)際斑馬魚資源中心，斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)從美國(guó)Aquatic Habitats公司引進(jìn)，喂養(yǎng)方案按照《Zebrafish Book》描述進(jìn)行。
(2)轉(zhuǎn)基因用限制性內(nèi)切酶bgl II線性化重組質(zhì)粒，純化后溶于含酚紅的磷酸鹽緩沖液，濃度為50ng/μL。當(dāng)受精卵發(fā)育到一至二個(gè)細(xì)胞階段，在解剖鏡下進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作，每受精卵轉(zhuǎn)入外源基因量為100pg(2nL)。
(3)熒光觀察轉(zhuǎn)基因操作后的受精卵分三組空白組，溶劑組，EE2處理組(100ng/L)，每組800個(gè)卵。28℃恒溫培養(yǎng)，定期在熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況。
(4)RT-PCR和PCR鑒定EGFP的表達(dá)和在基因組中的整合分別取轉(zhuǎn)基因后觀察到熒光的魚和未觀察到熒光的魚(5dpf，每組15條)，按說明書用Trizol(Invitrogen)一步法提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄以1ug總RNA為模板，10mmol/L的oligodT 1ul，70℃，5min；冰上加10×緩沖液2ul，25mmol/L的dNTP4ul，M-MLV(Invitrogen)1ul(200U)，42℃，60min，95℃，5min，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按Krovel AV和Islinger M等的文獻(xiàn)[Aquat Toxicol.2003 Jan24；62(2)85-103；Biol Reprod.2002 Jun；66(6)1881-92]設(shè)計(jì)引物EGFP P1(5’-ACCACATGAAGCAGCACGACT-3’)，EGFP P2(5’-CTTCTCGTTGGGGTCTTTGC-3’)；vtg1 P1(5’-GCT GCT GCA TCTGTC AAT GT-3’)，vtg1 P2(5’-CTG CTG CTG CTTTCA GAA GA-3’)。
以1u逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，PCR擴(kuò)增檢測(cè)EGFP基因和vtg1基因；同時(shí)以pEGFP-1質(zhì)粒為模板作陽性對(duì)照。反應(yīng)條件如下94℃預(yù)變性5min，每循環(huán)包括94℃變性40sec，55℃復(fù)性30sec，72℃延伸40sec，共28個(gè)循環(huán)，最后1個(gè)循環(huán)結(jié)束后再72℃延伸7min。擴(kuò)增片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。
待觀察到熒光的魚長(zhǎng)至成熟后，提取基因組DNA(promega DNA提取試劑盒)，PCR鑒定EGFP的基因組整合，引物為上述EGFP P1和EGFP P2，同時(shí)以質(zhì)粒pEGFP-1為模板作為陽性對(duì)照，以野生型魚基因組DNA為模板作為陰性對(duì)照。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min，每循環(huán)包括94℃變性40sec，55℃復(fù)性40sec，72℃延伸1min，共28個(gè)循環(huán)，最后1個(gè)循環(huán)結(jié)束后再72℃延伸7min。擴(kuò)增片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。
2.原位雜交檢測(cè)轉(zhuǎn)基因魚EGFP和vtg1的表達(dá)(1)重組質(zhì)粒pGEMTzfvtg1的制備取上述實(shí)驗(yàn)所擴(kuò)增出來的vtg1cDNA片段(801bp)，與promega公司的pGEM-T載體重組，反應(yīng)體系如下2×連接酶緩沖液5μLpGEM-T(50ng) 1μLPCR產(chǎn)物3μL
T4 DNA連接酶 1μL4℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，抽提質(zhì)粒測(cè)序，該重組質(zhì)粒命名為pGEMTzfvtg1。
(2)探針標(biāo)記用限制性內(nèi)切酶NcoI使pGEMTzfvtg1充分線性化，反應(yīng)步驟如下反應(yīng)體系pGEMTzfvtg1(1μg/μL)30μL10×反應(yīng)緩沖液 10μLNcoI(10U/μL)8μL水 52μL總體積 100μL37℃反應(yīng)過夜。
線性化的pGEMTzfvtg1采用promega公司的核酸純化試劑盒純化，具體步驟按說明書進(jìn)行。
采用線性化的pGEMTzfvtg1為模板，用地高辛標(biāo)記的NTP進(jìn)行RNA探針標(biāo)記。反應(yīng)體系如下10×SP6 RNA聚合酶緩沖液 2μLDTT(50mM) 2μL地高辛標(biāo)記NTP混合物(每種2.5mM)4μLRNA酶抑制劑(40U/μL) 0.5μLpGEMTzfvtg1(0.5μg/μL) 1μLSP6 RNA聚合酶(50U/μL)1μL無RNA酶水 9.5μL37℃反應(yīng)2小時(shí)。
加入2μL(2U/μL)的DNA酶，37℃孵育30分鐘。
加入2ul乙二胺四乙酸二鈉(pH8.0，0.2mol/L)，2.5ul氯化鋰(4mol/L)，75ul無水乙醇零下20攝氏度過夜。4℃12000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，去上清，用50ul的無RNA酶的水溶解。變性瓊脂糖凝膠電泳觀察探針的質(zhì)量。最后加入450ul的雜交緩沖液，備用。
(3)幼魚的處理和固定幼魚從胚胎發(fā)育第一天開始分組處理溶劑(0.001％乙醇)，100ng/L EE2，每24小時(shí)換液。生長(zhǎng)到第五天時(shí)，分組收集幼魚。用0.5毫升PBST洗滌兩次。加入4％的多聚甲醛0.5毫升，室溫靜置5分鐘，去多聚甲醛。再加入0.5毫升4％多聚甲醛室溫靜置5分鐘，再置于4℃ 12-15小時(shí)。去多聚甲醛，用PBST 0.5毫升洗滌一次。再用甲醇洗滌三次，最后加入0.5毫升甲醇凍存于零下20攝氏度。
(4)雜交(1)用表1所示的溶液和時(shí)間使固定的胚胎重新水化表1

(2)在PBST中用細(xì)針頭去掉絨毛膜；(3)在室溫用25μg/ml的蛋白酶K消化胚胎30分鐘；(4)室溫用4％的多聚甲醛重新固定胚胎20分鐘；(5)用0.5ml的PBST洗5次，每次5分鐘；(6)在300μL雜交液中65℃預(yù)雜交2小時(shí)，雜交完畢前30分鐘用雜交液1/20稀釋探針置于65℃預(yù)熱30分鐘；(7)去除預(yù)雜交液換成含有探針的雜交液，在65℃雜交過夜；(8)去除雜交液，用表2溶液在65℃洗滌。溶液要在65℃預(yù)熱30分鐘，每種溶液洗滌時(shí)間為10分鐘。
表2

(9)用0.5毫升0.2×SSC在65℃洗兩次，每次30分鐘；(10)用表3溶液洗滌
表3

(11)在PBST中加入2mg/ml的BSA和5％的綿羊血清作為封閉液，4℃封閉胚胎1-3小時(shí)；(12)用封閉液1/2000稀釋堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體，使胚胎在此抗體溶液中4℃過夜；(13)用含有2mg/ml的PBST洗八次，每次15分鐘；(14)用含有100mM Tris pH＝9.5、100mM的氯化鈉、50mM的氯化鎂和0.1％土溫-20溶液平衡胚胎；(15)加入堿性磷酸酶顯色液室溫顯色30分鐘至1小時(shí)，觀察結(jié)果。
本發(fā)明所采用的雜交相關(guān)試劑購(gòu)自Roche診斷試劑公司。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在含有100ng/L的17α-炔雌醇的系統(tǒng)水中，生長(zhǎng)到第五天的轉(zhuǎn)基因斑馬魚肝臟出現(xiàn)明顯的綠色熒光，肝臟同時(shí)表達(dá)vtg1；而系統(tǒng)水中如果不含有17α-炔雌醇，轉(zhuǎn)基因斑馬魚的肝臟不出現(xiàn)熒光，也沒有vtg1的表達(dá)。因此zfvtg1-1.7啟動(dòng)的EGFP表達(dá)和vtg1的表達(dá)在時(shí)空上是一致的，而且均受到雌激素(17α-炔雌醇)的調(diào)控。
無需進(jìn)一步詳細(xì)闡述，相信采用前面所公開的內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可最大限度地應(yīng)用本發(fā)明。因此，前面的優(yōu)選具體實(shí)施方案應(yīng)被理解為僅是舉例說明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
從以上描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可很容易地明了本發(fā)明的本質(zhì)特征，而且在不偏離其主旨和范圍的情況下，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種變更和改進(jìn)。
SEQUENCE LISTING<110>復(fù)旦大學(xué)<120>斑馬魚卵黃蛋白原-1基因調(diào)控序列<130>Fudan-20050619<160>3<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1720<212>DNA<213>斑馬魚(Danio rerio)<220>
<221>promoter<222>(1)..(1720)<400>1actaatagga agccaacgaa ggactttaag caatgtgcaa ccaactggtt aaaagccttg60cagctgcatt cagcacaact tgcaatcaat ctacagatga ctatttagac aagtgtacag120aacattaaat agtccaaccg tgaagagata aaggaatgac aagcatctcc atcttttctt180atgaaaccat atttctagtt tttgcaatat tcctaagatg gaaaacactt gcaaacacag240attaaaacat agaactttat caaagatgac atccatattt ctgtttccac tgcaatttaa300gggtgacaga tacaaaaata ctcaatctct gggatgacat tataaaaatg caaaaatcta360catctcagtt ttgtcaggat taagttgaaa attgtcagcc atccatttgt taatggtgac420taaacaatcc tgcaagaact gtaagaaaag tacaatagca tatcatcagc atagcaatga480taagacacaa atttaaagct gctagtattg ttgcttagag aaagtgtata caaatgaaac540agaagagagc ctagcacaga aacttgaggc acgcacagga cagaggaaca gagtctgaca600
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1.斑馬魚卵黃蛋白原-1基因調(diào)控序列，其特征是具有序列1的序列，命名為zfvtg1-1.7。
2.按權(quán)利要求1所述的斑馬魚卵黃蛋白原-1基因調(diào)控序列，其特征是所述調(diào)控序列是通過設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增斑馬魚基因組DNA，得到1720bp的DNA序列，所述引物具有序列1和序列2的序列。
3.一種重組質(zhì)粒，其特征是含有權(quán)利要求1中所述的調(diào)控序列和增強(qiáng)的綠色熒光蛋白基因，命名為zfvtg1-1.7-EGFP。
4.權(quán)利要求1或2的斑馬魚卵黃蛋白原-1基因調(diào)控序列在制備檢測(cè)環(huán)境雌激素制劑中的用途。
5.權(quán)利要求3的重組質(zhì)粒在制備檢測(cè)環(huán)境雌激素制劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬于生命科學(xué)領(lǐng)域。提供了序列1的斑馬魚卵黃蛋白原－1(vitellogenin1，vtg1)基因表達(dá)的調(diào)控序列。本發(fā)明利用轉(zhuǎn)基因斑馬魚實(shí)驗(yàn)，證明該序列在斑馬魚體內(nèi)具有啟動(dòng)子活性，能夠在雌激素誘導(dǎo)下，啟動(dòng)下游基因在肝臟特異性表達(dá)。采用本發(fā)明提供的zfvtg1－1.7序列與報(bào)告基因(熒光蛋白)連接，可以在轉(zhuǎn)基因斑馬魚的活體內(nèi)觀察熒光，從而快速直觀地反映vtg1的表達(dá)?？梢酝ㄟ^觀察魚體的熒光判斷水體中是否存在雌激素樣物質(zhì)。本發(fā)明為構(gòu)建檢測(cè)雌激素水平的熒光斑馬魚奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1904048SQ20051002815
公開日2007年1月31日 申請(qǐng)日期2005年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月26日
發(fā)明者宋后燕, 陳浩, 楊健 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)