專利名稱：一種組成型畢赤酵母菌株及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程菌和微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體地說，是關(guān)于一種表達(dá)D-氨基酸氧化酶的組成型畢赤酵母菌株及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
D-氨基酸氧化酶(D-Amino Acid Oxidase，DAO，EC 1.4.3.3)是一種以黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)為輔基的典型黃素蛋白酶類，它催化D型氨基酸氧化脫氨反應(yīng)，生成相應(yīng)的酮酸和氨，并伴隨著一分子氧還原，而釋放出過氧化氫。在兩步酶法生產(chǎn)7-氨基酸頭孢烷酸(7-ACA)工藝中，DAO用于轉(zhuǎn)化頭孢菌素C(CPC)的第一步反應(yīng)。
巴斯德畢赤酵母已經(jīng)成為一種主要的真核微生物表達(dá)系統(tǒng)(Cregg JM.，Vedvick TS.，Raschke WC.Bio/Technology.11905-910，1993)。畢赤酵母可以高密度發(fā)酵，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中整合質(zhì)粒常用的啟動子是醇氧化酶啟動子(Alcohol oxidasel promoter，PAOX1)和三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，PGAP)。
甲醇誘導(dǎo)型畢赤酵母菌能夠表達(dá)三角酵母來源的DAO(Yu J，Yang S，Yuan ZY.J.Mol.Catal B-Enzym.18291-297，2002)，但是，誘導(dǎo)型畢赤酵母菌在發(fā)酵過程中需要添加甲醇誘導(dǎo)，且誘導(dǎo)過程的條件控制比較復(fù)雜，此外，發(fā)酵時(shí)間相對也比較長，酶活力達(dá)到最高點(diǎn)通常需要40小時(shí)左右。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就在于克服現(xiàn)有表達(dá)D-氨基酸氧化酶(DAO)的甲醇誘導(dǎo)型畢赤酵母菌的上述缺點(diǎn)和不足，從而提供一種表達(dá)DAO的組成型畢赤酵母基因工程菌株。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種上述表達(dá)DAO的組成型畢赤酵母表達(dá)菌株的構(gòu)建方法。
本發(fā)明的表達(dá)DAO的組成型畢赤酵母表達(dá)菌株轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒pMMZY03，該重組質(zhì)粒以三磷酸甘油醛脫氫酶基因?yàn)閱幼?，并含有D-氨基酸氧化酶基因、組氨醇脫氫酶基因和卡那霉素基因。
本發(fā)明的組成型畢赤酵母重組菌株的構(gòu)建方法包括以下步驟A、酶切質(zhì)粒質(zhì)粒pPIC3.5k，回收含有卡那霉素基因和組氨醇脫氫酶基因的片段；酶切質(zhì)粒pGAPZA，回收含有三磷酸甘油醛脫氫酶基因的片段；連接酶連接上述兩片段得到重組質(zhì)粒pPICGAP；B、重組質(zhì)粒pPICGAP酶切線性化后與帶有組氨酸純化標(biāo)簽的DAO基因(HDAO)片段用T4連接酶相連接，得到重組質(zhì)粒pMMZY03；C、將重組質(zhì)粒pMMZY03電擊轉(zhuǎn)化入畢赤酵母宿主菌中，構(gòu)建成表達(dá)D-氨基酸氧化酶的組成型畢赤酵母重組菌株。
與現(xiàn)有技術(shù)中已知的DAO生產(chǎn)菌株相比，本發(fā)明的帶組氨酸純化標(biāo)簽的重組DAO的表達(dá)菌株達(dá)到相同發(fā)酵單位所需的發(fā)酵時(shí)間大為縮短(約為1/3)，并且不需要甲醇誘導(dǎo)。因此在生產(chǎn)中具有非常明顯的優(yōu)勢，例如時(shí)間短、能耗低、發(fā)酵過程控制相對簡單等。
新構(gòu)建的整合載體啟動子是三磷酸甘油醛脫氫酶基因。與商品化的相同類型載體相比較，載體中含有組氨醇脫氫酶基因(HIS4)，同時(shí)避免了高價(jià)格抗生素Zeocin使用。


圖1為在組成型畢赤酵母中表達(dá)重組三角酵母DAO的整合質(zhì)粒pMMZY03的構(gòu)建流程圖。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限定本發(fā)明的范圍。
以下實(shí)施例中，DNA片段連接、質(zhì)粒的制備，化學(xué)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入宿主菌，克隆均參照《分子克隆》(Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.P.，Maniatis，T.(2001)“Molecular CloningA LaboratoryManual 3rd ed，”Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。
本發(fā)明所構(gòu)建的表達(dá)DAO的組成型巴斯德畢赤酵母菌株MMZY03已于2005年8月9日提交中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏號為CCTCC M 205088。
實(shí)施例1、質(zhì)粒構(gòu)建1、材料質(zhì)粒pPIC3.5kInvitrogen公司產(chǎn)品，大小為9.0kb，含有卡那霉素抗性基因，氨芐青霉素抗性基因，組氨醇脫氫酶基因，啟動子是醇氧化酶基因，并具有多個(gè)限制性酶切位點(diǎn)。
質(zhì)粒pGAPZAInvitrogen公司產(chǎn)品，大小為2.9kb，含有Zeocin抗性基因，啟動子是三磷酸甘油醛脫氫酶基因，并具有多個(gè)限制性酶切位點(diǎn)。
質(zhì)粒pLHB-3按照Liu HB等(Liu HB.，Jiang WH.，Yang YL.Cloning，Sequencing andExpression of D-amino acid oxidase gene.Chinese Journal of Biotechnology 15337-342，1999)的方法構(gòu)建，大小為6.4kb，含有帶組氨酸純化標(biāo)簽的DAO基因(HDAO)，卡那霉素抗性基因，啟動子是T7lac。
2、方法如圖1所示，質(zhì)粒pPIC3.5k用EcoRI單酶切，再用BglII部分酶切，割膠回收大小約8.0kb的基因片段，該片段含有卡那霉素基因和組氨醇脫氫酶基因；質(zhì)粒pGAPZA用EcoRI和BglII雙酶切后膠回收約0.5kb的基因片段，該片段含有三磷酸甘油醛脫氫酶基因；T4連接酶連接上述兩片段得到重組質(zhì)粒pPICGAP，該重組質(zhì)粒啟動子是三磷酸甘油醛脫氫酶基因，含有組氨醇脫氫酶基因和卡那霉素抗性基因。
質(zhì)粒pPICGAP用EcoRI線性化后再用Klenow補(bǔ)平，膠回收得到約8.5kb大小的片段；質(zhì)粒pLHB-3用NcoI和HindIII雙酶切后再用Klenow補(bǔ)平，得到約1.2kb的HDAO基因片段；T4連接酶連接兩個(gè)基因片段，得到重組質(zhì)粒pMMZY03，該重組質(zhì)粒啟動子是三磷酸甘油醛脫氫酶基因，含有重組D-氨基酸氧化酶基因，組氨醇脫氫酶基因和卡那霉素抗性基因。
實(shí)施例2、質(zhì)粒擴(kuò)增質(zhì)粒pMMZY03采用常規(guī)的化學(xué)轉(zhuǎn)化法《參考分子克隆》轉(zhuǎn)化至至大腸桿菌宿主菌DH5α(Takara)，挑取單個(gè)轉(zhuǎn)化子接種到LB液體培養(yǎng)基(1％蛋白胨，0.5％酵母膏，1％氯化鈉)中，在37℃培養(yǎng)擴(kuò)增pMMZY03質(zhì)粒。
實(shí)施例3、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化參考《分子克隆》，采用堿裂解法從實(shí)施例2的大腸桿菌抽提擴(kuò)增的質(zhì)粒pMMZY03，抽提的質(zhì)粒選用BspEI單酶切線性化，乙醇沉淀回收線性化質(zhì)粒約10μg，與畢赤酵母宿主菌GS115(his-mut+)感受態(tài)細(xì)胞80μl混合后轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)化杯中，冰浴中放置5min，同時(shí)準(zhǔn)備一份不添加線性化質(zhì)粒pMMZY03的感受態(tài)細(xì)胞作為陰性對照。采用Bio-Rad電轉(zhuǎn)化儀器，電轉(zhuǎn)化參數(shù)設(shè)置是1.5KV、25μF、200Ω，電擊時(shí)間4.6ms，電擊轉(zhuǎn)化后立即加入1ml冰浴的山梨醇。電擊轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂在MD平板(1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％葡萄糖，2％瓊脂糖)上，放置28℃培養(yǎng)，2-3天后MD平板上長出轉(zhuǎn)化子。
實(shí)施例4、轉(zhuǎn)化子篩選從MD平板上挑取10個(gè)轉(zhuǎn)化子接種至YPD培養(yǎng)基(2％蛋白胨，1％酵母膏，2％葡萄糖)中，培養(yǎng)溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速為280rpm，培養(yǎng)至24h時(shí)取樣測定DAO活力。
一個(gè)酶活力單位(U)的DAO定義37℃，pH8.5條件下，每分鐘氧化脫氨生成1μmol酮酸所需的酶量。
采用比色法測定DAO活力(Nilsson.K.，Mosbach.K.，Appl.Biochem.Biotechnol.，6293-308，1981)，具體如下待測樣品中加入用0.1mol/L、pH8.0的焦磷酸鈉緩沖液配制的50mmol/L DL-甲硫氨酸溶液，在37℃浴中振蕩反應(yīng)30min，加入10％的三氯乙酸終止反應(yīng)。將終止液稀釋10倍后加入0.2％的2，4-二硝基苯肼飽和溶液，混勻靜置10min。加入3mol/L的NaOH溶液，混勻后靜置15min，離心后測定A550值。
按照上述方法測定10個(gè)轉(zhuǎn)化子在24h的DAO活力，結(jié)果如下表1所示表1、DAO活力測定

通過上述測定DAO活力的方法篩選出DAO表達(dá)最高的重組菌株，命名為MMZY03。該菌株并已于2005年8月9日提交中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏號為CCTCC M 205088。
實(shí)施例5、表達(dá)DAO活力的比較以本發(fā)明的組成型重組畢赤酵母菌株MMZY03與誘導(dǎo)型重組畢赤酵母菌株在同等條件下進(jìn)行表達(dá)DAO活力的比較，發(fā)酵采用YPD培養(yǎng)基(同實(shí)施例4)，接種量為5％，發(fā)酵溫度為30℃，溶氧維持在30％左右，發(fā)酵過程中用氨水調(diào)節(jié)pH6.0，從接種時(shí)刻算起，每隔1小時(shí)取樣測定DAO活力，結(jié)果如表2所示
表2、表達(dá)DAO活力比較

由以上表2的結(jié)果可見，本發(fā)明的組成型重組畢赤酵母菌株MMZY03(組成型)從接種時(shí)間起約13h時(shí)發(fā)酵單位達(dá)到最高，約為6321U/L，相比之下，現(xiàn)有技術(shù)中使用的誘導(dǎo)型重組畢赤酵母中DAO發(fā)酵單位達(dá)到最高需要約40h，所用時(shí)間約為本發(fā)明的菌株的3倍。可見以本發(fā)明的組成型畢赤酵母重組菌株表達(dá)D-氨基酸氧化酶，不但可以避免發(fā)酵過程中甲醇誘導(dǎo)的難控制因素，而且酶活力達(dá)到最高點(diǎn)僅需約13h左右，約為現(xiàn)有甲醇誘導(dǎo)型菌株的1/3，從而大大縮短了發(fā)酵時(shí)間，減少了能耗，進(jìn)而降低了生產(chǎn)成本。
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)D-氨基酸氧化酶的組成型畢赤酵母重組菌株，其特征在于，所述菌株轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒pMMZY03，該重組質(zhì)粒以三磷酸甘油醛脫氫酶基因?yàn)閱幼?，并含有D-氨基酸氧化酶基因、組氨醇脫氫酶基因和卡那霉素基因。
2.如權(quán)利要求1所述的組成型畢赤酵母重組菌株，其特征在于，所述重組質(zhì)粒pMMZY03還具有組氨酸標(biāo)簽。
3.如權(quán)利要求1所述的組成型畢赤酵母重組菌株，其特征在于，所述菌株的保藏號CCTCC M 205088。
4.一種組成型畢赤酵母重組菌株的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟A、酶切質(zhì)粒pPIC3.5k，回收含有卡那霉素基因和組氨醇脫氫酶基因的片段；酶切質(zhì)粒pGAPZA，回收含有三磷酸甘油醛脫氫酶基因的片段；連接酶連接上述兩片段得到重組質(zhì)粒pPICGAP；B、重組質(zhì)粒pPICGAP酶切線性化后用連接酶與帶有組氨酸純化標(biāo)簽的D-氨基酸氧化酶基因片段相連接，得到重組質(zhì)粒pMMZY03；C、將重組質(zhì)粒pMMZY03電擊轉(zhuǎn)化入畢赤酵母宿主菌中，構(gòu)建成表達(dá)D-氨基酸氧化酶的組成型畢赤酵母重組菌株。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟A和B中所使用的連接酶為T4連接酶。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟B中所述線性化的重組質(zhì)粒pPICGAP以及帶有組氨酸純化標(biāo)簽的D-氨基酸氧化酶基因片段在用連接酶連接前先以Klenow補(bǔ)平。
7.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，在將重組質(zhì)粒pMMZY03電擊轉(zhuǎn)化入畢赤酵母宿主菌前還包括將重組質(zhì)粒pMMZY03導(dǎo)入大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增的步驟。
8.一種重組質(zhì)粒，其特征在于，所述重組質(zhì)粒以三磷酸甘油醛脫氫酶基因?yàn)閱幼?，并含有D-氨基酸氧化酶基因、組氨醇脫氫酶基因和卡那霉素基因。
9.如權(quán)利要求4所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述重組質(zhì)粒帶有組氨酸標(biāo)簽。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種表達(dá)D－氨基酸氧化酶的組成型畢赤酵母重組菌株，該菌株轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒pMMZY03，該重組質(zhì)粒以三磷酸甘油醛脫氫酶基因?yàn)閱幼?，并含有D－氨基酸氧化酶基因，組氨醇脫氫酶基因和卡那霉素抗性基因。本發(fā)明還公開了所述表達(dá)D－氨基酸氧化酶的組成型畢赤酵母重組菌株的構(gòu)建方法。與現(xiàn)有已知的D－氨基酸氧化酶生產(chǎn)菌株相比較，本發(fā)明的菌株具有生產(chǎn)時(shí)間縮短的優(yōu)勢，且避免了發(fā)酵過程中甲醇誘導(dǎo)的難控制因素。
文檔編號C12N15/53GK1737112SQ20051002875
公開日2006年2月22日 申請日期2005年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月12日
發(fā)明者楊晟, 鄭華寶, 陳軍, 楊蘊(yùn)劉, 姜衛(wèi)紅 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院