專利名稱：一種北非蝎昆蟲毒素基因序列及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及昆蟲毒素，尤其涉及昆蟲毒素基因的改造和表達(dá)。
背景技術(shù)：
蝎子是一種在我國分布很廣的以軟體昆蟲為食的動物，在長期的進(jìn)化過程中，為生存或防衛(wèi)的需要在其體內(nèi)形成了一系列毒素。蝎毒素按其作用對象大致可分為3類(1)哺乳動物神經(jīng)毒素(MTx，在粗蝎毒中含量高達(dá)10％～50％)；(2)昆蟲神經(jīng)毒素，即抗昆蟲蝎毒素(ITx，在粗蝎毒中含量低于1％)；(3)甲殼動物神經(jīng)毒素(CTx)。
蝎毒素的應(yīng)用價值有1)可用來開發(fā)新型生物殺蟲劑由于北非蝎昆蟲毒素對昆蟲的高毒性、特異性以及對甲殼動物、哺乳動物等其他非目標(biāo)生物均無毒性，因此是開發(fā)生物殺蟲劑的非常理想的選擇。
2)可用來開發(fā)具有重要藥理活性的蛋白全蝎為我國傳統(tǒng)的名貴中藥，其有效成分正是蝎毒，主治驚癇抽搐、中風(fēng)、半身不遂、口眼歪斜、破傷風(fēng)等，而且還有解毒、止痛，同時也可用來治療腫瘤、血栓等疾病，并且副作用較小，可以用來生產(chǎn)具有重要藥理活性的毒素蛋白。
3)可作為研究蛋白質(zhì)的理想材料由于蝎昆蟲毒素具有特異性和高度選擇性，分子較小，便于操作，是研究蛋白質(zhì)工程、神經(jīng)生物學(xué)、免疫學(xué)和離子通道等的理想材料。
從蝎毒中分離得到的抗昆蟲神經(jīng)毒素(下稱抗蝎昆蟲毒素)，由于多數(shù)能專一作用于昆蟲，并具有對哺乳動物無害或毒性很小的特點(diǎn)，因而引起了國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。作為一類新的潛在的殺蟲基因，應(yīng)用基因工程的手段，構(gòu)建重組微生物殺蟲劑及轉(zhuǎn)基因抗蟲植物，已經(jīng)成為重要發(fā)展方向。
北非蝎昆蟲毒素(Androctonus australis Hector insect toxin，AaHIT1)是北非蝎產(chǎn)生的一種毒素，由216bp基因編碼，71個氨基酸，分子量約為7KD。AaHIT1毒性很強(qiáng)，具有只作用于昆蟲，而對哺乳動物無害的特征。目前國內(nèi)外對AaHIT1的研究主要集中在兩個方面，其一是將AaHIT1基因轉(zhuǎn)入桿狀病毒，得到重組的桿狀病毒殺蟲劑，可縮短殺蟲時間，改善保護(hù)植物免受危害的效果；其二是轉(zhuǎn)入AaHIT1基因，得到穩(wěn)定表達(dá)AaHIT1基因的抗蟲植物，已經(jīng)體現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。
例如，國內(nèi)姚斌等在中國科學(xué)(C輯)，Val 26(1)79～84中將AaHIT1基因在桿狀病毒中表達(dá)，該重組的桿狀病毒對粉紋夜蛾幼蟲的ST50比野生型桿狀病毒縮短了50％。姚斌等還在中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，Val 19(2)182-185，將北非蝎昆蟲毒素AaHIT1基因轉(zhuǎn)化入煙草中并獲得了轉(zhuǎn)基因植株抗蟲實(shí)驗表明，該轉(zhuǎn)基因煙草對白粉虱有明顯的抗性。
然而，由于帶有AaHIT1基因的重組桿狀病毒殺蟲劑及轉(zhuǎn)基因抗蟲植物對各種昆蟲尚缺乏理想的選擇性，對非目標(biāo)鱗翅類昆蟲造成持久的危險，其性質(zhì)更接近于殺蟲劑，而不象生物防治制劑，同時重組桿狀病毒還存在與野生病毒發(fā)生基因交換的風(fēng)險，造成環(huán)境隱患，因此許多學(xué)者對此類重組病毒的環(huán)境安全性提出了異議。另一方面，AaHIT1毒素基因在多數(shù)表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)水平較低，不能滿足科學(xué)研究的需要，其基因的調(diào)控與表達(dá)技術(shù)有待進(jìn)一步完善。
熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens，簡稱Pf)由于分布廣泛，能在多種作物上定殖、對植物病蟲害有良好抑菌和防治作用。熒光假單胞菌對人畜無害，多數(shù)對植物有益以及遺傳操作簡便、試驗材料豐富等特點(diǎn)，已成為應(yīng)用重組微生物研究的理想受體菌。美國Mycogen公司將Bt殺蟲蛋白基因轉(zhuǎn)入熒光假單胞菌，獲得的產(chǎn)品已投放市場。
不同的生物表達(dá)基因?qū)蛐蛄杏斜容^嚴(yán)格的選擇性，基因序列的設(shè)計成了用基因表達(dá)的方法生產(chǎn)高產(chǎn)量和高純度活性物質(zhì)的關(guān)鍵。大腸桿菌和熒光假單胞菌是原核生物，北非蝎是真核生物，這種跨界表達(dá)更困難，因此國內(nèi)國外還沒有見到能同時在大腸桿菌和熒光假單胞菌中表達(dá)的北非蝎昆蟲毒素的報告。
本領(lǐng)域迫切需要新的適合作為重組微生物殺蟲劑的受體菌，開發(fā)新的微生物殺蟲劑；同時，需要改進(jìn)蝎昆蟲毒素的表達(dá)方法，提供高產(chǎn)量和高純度的蝎昆蟲毒素，滿足科學(xué)研究的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種同時滿足大腸桿菌和熒光假單胞菌嗜好的北非蝎昆蟲毒素基因序列，使得北非蝎昆蟲毒素基因能在兩種宿主菌高水平表達(dá)，以克服現(xiàn)有技術(shù)之不足。
本發(fā)明的另一目的是提供一種制備上述序列的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種北非蝎昆蟲毒素的制備方法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種上述非蝎昆蟲毒素基因序列的應(yīng)用，用于轉(zhuǎn)化熒光假單胞菌，作為新型微生物殺蟲劑，以克服現(xiàn)有技術(shù)之不足。
本發(fā)明的構(gòu)思是這樣的，用生物信息學(xué)的方法分析和計算密碼子的偏好率，依照已公開的北非蝎昆蟲毒素的氨基酸序列和大腸桿菌及熒光假單胞菌翻譯蛋白質(zhì)的密碼子的偏好，設(shè)計北非蝎昆蟲毒素的基因序列。
本發(fā)明的第一方面，提供一種能同時在大腸桿菌和熒光假單胞菌細(xì)胞中表達(dá)的北非蝎昆蟲毒素基因的人工序列，見SEQ.1。
ATGAAGAAGAACGGCTACGCGGTGGACAGCAGCGGCAAGGCGCCGGAATGCCTGCTGAGCAACTACTGCAACAACGAATGCACCAAGGTGCACTACGCGGACAAGGGCTACTGCTGCCTGCTGAGCTGCTACTGCTTCGGCCTGAACGACGACAAGAAGGTGCTGGAAATCAGCGACACCCGCAAGAGCTACTGCGACACCACCATCATCAACTAA序列前端劃線部分為起始密碼子ATG，序列末端劃線部分為終止密碼子TAA。
本發(fā)明的第二方面，提供一種制備SEQ.1所示北非蝎昆蟲毒素基因人工序列的方法，該序列是用PCR方法合成的，PCR的引物為P15′-ATGAAGAAGAACGGCTACGCGGTGGACAGCAGCGGCAAGGCGCCGGAA-3′P25′-GCAACTACTGCAACAACGAATGCACCAAGGTGCACTACGCGGACAAGGGC-3′P35′-GCCTGCTGAGCTGCTACTGCTTCGGCCTGAACGACGACA-3′P45′-ATCAGCGACACCCGCAAGAGCTACTGCGACACCACCA-3′P53′-CCGTTCCGCGGCCTTACGGACGACTCGTTGATGACGTTGTTGC -5′P63′-ATGCGCCTGTTCCCGATGACGACGGACGACTCGACG-5′P73′-CGGACTTGCTGCTGTTCTTCCACGACCTTTAGTCGCTGTGGGCG-5′P83′-TGACGCTGTGGTGGTAGTAGTTGATT-5′。
8條引物之間有互補(bǔ)的片段，這些互補(bǔ)的片段依次相互配對，經(jīng)DNA聚合酶補(bǔ)平，可拼接成編碼AaHIT1成熟肽的完整的DNA序列，作為PCR反應(yīng)的模板；所說的DNA聚合酶優(yōu)選Taq酶。
AaHIT1基因人工序列的合成分兩個階段(1)引物P1～P8加入到如下反應(yīng)體系ddH2O 55μl，Buffer 10μl，dNTP(10mM)2μl，P1～P8各4μl，Taq酶1μl，反應(yīng)總體積為100μl；50℃復(fù)性1min，72℃延伸20min。
(2)取步驟(1)的反應(yīng)產(chǎn)物做模板，用P1和P8為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR的反應(yīng)體系為ddH2O 37.5μl，Buffer 5μl，dNTP(10mmol)1μl，P1、P8各2μl，模板2μl，Taq酶0.5μl。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2min，94℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 30s，35個循環(huán)，最后72℃延伸5min，回收PCR產(chǎn)物。
PCR產(chǎn)物與pMD18-T進(jìn)行連接得到測序質(zhì)粒pMD18-T/AaHIT1，用常規(guī)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑取陽性克隆，測序，PCR產(chǎn)物的序列與AaHIT1的編碼基因的序列一致。
本發(fā)明的第三方面，提供一種北非蝎昆蟲毒素的制備方法，將本發(fā)明所提及的北非蝎昆蟲毒素基因(SEQ.1)與表達(dá)載體重組，形成重組表達(dá)載體，本發(fā)明不限于特定的表達(dá)載體。再將重組表達(dá)載體按常規(guī)方法導(dǎo)入適宜的宿主細(xì)胞，本發(fā)明不局限于任何特定的宿主細(xì)胞，只要它能表達(dá)所述重組表達(dá)載體。常規(guī)方法培養(yǎng)宿主細(xì)胞，收集北非蝎昆蟲毒素。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的方案中，上述基因序列與表達(dá)載體pET32a連接，在大腸桿菌B121細(xì)胞中表達(dá)。
本發(fā)明的另一個優(yōu)選的方案中，上述基因序列與載體pSUP106連接，在熒光假單胞菌A49838細(xì)胞中表達(dá)。
本發(fā)明的第四方面，公開了北非蝎昆蟲毒素基因序列(SEQ.1)的應(yīng)用，用于轉(zhuǎn)化熒光假單胞菌，作為新型微生物殺蟲劑。
在本發(fā)明一個優(yōu)選的方案中，培養(yǎng)北非蝎昆蟲毒素基因序列(SEQ.1)轉(zhuǎn)化的熒光假單胞菌，菌體裂解上清液能夠抑制甜菜夜蛾幼蟲的生長，平均校正死亡率為73.2％。
本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的北非蝎昆蟲毒素基因序列在大腸桿菌和熒光假單胞菌中能夠高效表達(dá)。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測表明，在大腸桿菌和熒光假單胞菌中的表達(dá)量分別為35％和33％，見實(shí)施例3、實(shí)施例4。
本發(fā)明的北非蝎昆蟲毒素基因轉(zhuǎn)化熒光假單胞菌得到的基因工程菌，其菌體裂解的上清液能夠抑制甜菜夜蛾幼蟲的生長，說明熒光假單胞菌可正確表達(dá)有生物活性的北非蝎昆蟲毒素，而熒光假單胞菌原有的抑制植物致病菌(玉米小斑病病原菌)的特性沒有改變。因此，本發(fā)明的北非蝎昆蟲毒素基因可用于轉(zhuǎn)化熒光假單胞菌，開發(fā)“雙抗”環(huán)境友好的新型生物農(nóng)藥。


圖1、北非蝎昆蟲毒素基因(SEQ.1)在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，考馬斯亮藍(lán)染色而顯示。MMarker；1不加誘導(dǎo)劑的表達(dá)產(chǎn)物；2加誘導(dǎo)劑的表達(dá)產(chǎn)物，箭頭所指為表達(dá)條帶。
圖2、北非蝎昆蟲毒素基因(SEQ.1)在熒光假單胞菌細(xì)胞中的表達(dá)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，考馬斯亮藍(lán)染色而顯示。MMarker；1加誘導(dǎo)劑的表達(dá)產(chǎn)物，箭頭所指為表達(dá)條帶；2不加誘導(dǎo)劑的表達(dá)產(chǎn)物。
圖3、北非蝎昆蟲毒素基因(SEQ.1)轉(zhuǎn)化的熒光假單胞菌A49838對玉米小斑病病原菌的抑制作用。
具體實(shí)施例方式
質(zhì)粒pET32a、pMD18-T，大腸桿菌BL21菌株、熒光假單胞菌A49838菌株購于華美公司，pSUP106按文獻(xiàn)方法制備(Priefer，U B.，Simon，R.and Pühler，A.(1985)Extension of the host range of Escherichia coli vectors by incorporation ofRSF1010 replication and mobilization functions.Journal of Bacteriology，163，324-330)。
限制性內(nèi)切酶購于購自TaKaRa公司；PCR引物由上海博亞公司合成，其他試劑為國產(chǎn)分析純試劑，實(shí)施例中采用的方法根據(jù)《分子克隆》(科學(xué)出版社，第二版，2002年)。
實(shí)施例1、滿足大腸桿菌和熒光假單胞菌嗜好的北非蝎昆蟲毒素基因人工序列設(shè)計根據(jù)北非蝎昆蟲毒素AaHIT1的氨基酸序列，參照大腸桿菌對密碼子的偏好性和熒光假單胞菌密碼子的使用頻率，設(shè)計出相應(yīng)的DNA序列，具體見SEQ.1。
實(shí)施例2北非蝎昆蟲毒素(AaHIT1)基因的合成以SEQ.1為模板，設(shè)計引物P1～P8。AaHIT1基因人工序列的合成分兩個階段(1)引物P1～P8加入到如下反應(yīng)體系ddH2O 55μl，Buffer 10μl，dNTP(10mM)2μl，P1～P8各4μl，Taq酶1μl，反應(yīng)總體積為100μl；50℃復(fù)性1min，72℃延伸20min。
(2)取步驟(1)的反應(yīng)產(chǎn)物做模板，用P1和P8為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR的反應(yīng)體系為ddH2O 37.5μl，Buffer 5μl，dNTP(10mmol)1μl，P1、P8各2μl，模板2μl，Taq酶0.5μl。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2min，94℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 30s，35個循環(huán)，最后72℃延伸5min，回收PCR產(chǎn)物。
PCR產(chǎn)物與pMD18-T進(jìn)行連接，得到測序質(zhì)粒pMD18-T/AaHIT1，常規(guī)方法轉(zhuǎn)化，挑取陽性克隆，測序鑒定，PCR產(chǎn)物測序結(jié)果與SEQ.1完全相同。
實(shí)施例3、AaHIT1基因在大腸桿菌中的表達(dá)首先構(gòu)建pET32a/AaHIT1表達(dá)載體。在原有的引物P1、P8的5’端加上Nde I、HindIII的酶切位點(diǎn)構(gòu)成引物P9、P10，引物序列為P9 5’-CGCCATATGAAGAAGAACGGCTACGCGGTGGACAGC-3’P105’-GGGAAGCTTAGTTGATGATGGTGGTGTCGCAGT-3’以實(shí)施例2制備的pMD18-T/AaHIT1為模板，以P9，P10為引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)。將上述的PCR產(chǎn)物回收，分別用Nde I、HindIII酶切，用相同的酶作用pET32a載體。酶切產(chǎn)物經(jīng)過1.5％的瓊脂糖凝膠電泳回收片段。將AaHIT1基因的酶切片段和經(jīng)相同的酶作用了的pET32a相連接，轉(zhuǎn)化DH5α菌，得到陽性克隆，提取質(zhì)粒，經(jīng)鑒定為含有AaHIT1基因的質(zhì)粒pET32a，命名為pET32a/AaHIT1。然后用pET32a/AaHIT1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli Bl21宿主菌。
挑取轉(zhuǎn)化了pET32a/AaHIT1的Bl 21單菌落，置2ml LB(amp+)中，37℃200rpm培養(yǎng)過夜，從中取100μl菌液加入10ml LB(amp+)培養(yǎng)液中，37℃200rpm培養(yǎng)2h以上，待OD值達(dá)到0.5～1.0時，加入誘導(dǎo)劑IPTG(0.8mol/L)，搖床培養(yǎng)2h或4h，利用凍融的方法使菌體破裂，離心去除細(xì)胞體，上清液通過SDS-聚丙烯酰胺電泳檢測，電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)染色，以不加IPTG誘導(dǎo)劑的細(xì)菌菌體提取液作為對照。。在分子量7kD左右的部位可見表達(dá)產(chǎn)物條帶，見圖1。通過電泳圖譜掃描，目標(biāo)產(chǎn)物表達(dá)量為上清液總蛋白的35％。
實(shí)施例4、AaHIT1基因在熒光假單胞菌中的表達(dá)挑取熒光假單胞菌A49838菌株的單克隆接入LB液體培養(yǎng)基搖床過夜，以1％的接種量接5ml LB液體培養(yǎng)基，200rpm培養(yǎng)6小時左右，待菌液的OD值達(dá)到0.6左右，在無菌的條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個無菌的用冰預(yù)冷的1.5ml Ep管，在冰上放置10min，使培養(yǎng)物冷卻到0℃。5000rpm離心10min。倒出培養(yǎng)液，將管倒置以使最后殘留物的痕量培養(yǎng)液流盡。以1ml用冰預(yù)冷的30mmol/LCaCl2重懸每份沉淀，放置于冰浴上30min。5000rpm離心10min。倒出培養(yǎng)液，將管倒置以使最后殘留物的痕量培養(yǎng)液流盡。用200μl預(yù)冷的30mmol/L CaCl2重懸每份沉淀。待用。
在原有的引物P1和P8的5′端加上HindIII的酶切位點(diǎn)構(gòu)成P11和P12P115’-CGCCATATGAAGAAGAACGGCTACGCGGTGGACAGC-3’P125’-GGGAAGCTTAGTTGATGATGGTGGTGTCGCAGT-3’以P11，P12為引物，原有的pMD18-T/AaHIT1為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，回收PCR產(chǎn)物。用HindIII酶作用回收的PCR產(chǎn)物和去磷酸化處理過的pSUP106質(zhì)粒。連接質(zhì)粒與PCR產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂LB Cm+平板，挑取陽性克隆，抽提質(zhì)粒，經(jīng)鑒定為pSUP106/AaHIT1。然后用pSUP106/AaHIT1轉(zhuǎn)化熒光假單胞菌A49838菌株。
吸取適量質(zhì)粒pSUP106/AaHIT1加入200μl的感受態(tài)細(xì)胞，輕輕混勻內(nèi)容物，在冰中放置30min，42℃水浴2min，快速冰浴1-2min，加入800μl LB培養(yǎng)基，28℃搖床復(fù)蘇1h，取100μl菌液涂布于平板，28℃培養(yǎng)24-36小時，挑取陽性克隆抽質(zhì)粒鑒定。37℃200rpm培養(yǎng)2h以上，待OD值達(dá)到0.5～1.0時，加入誘導(dǎo)劑IPTG(0.8mol/L)，搖床培養(yǎng)2h或4h，利用凍融的方法使菌體破裂，離心去除細(xì)胞體，上清液通過SDS-聚丙烯酰胺電泳檢測，電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)染色，以不加IPTG誘導(dǎo)劑的細(xì)菌菌體提取液作為對照。在分子量7kD左右的部位可見表達(dá)產(chǎn)物條帶，見圖1。通過電泳圖譜掃描，目標(biāo)產(chǎn)物表達(dá)量為上清液總蛋白的33％。
實(shí)施例5、轉(zhuǎn)化的熒光假單胞菌殺蟲作用按實(shí)施例4方法制備pSUP106/AaHIT1轉(zhuǎn)化的熒光假單胞菌，加入誘導(dǎo)劑IPTG表達(dá)，分別培養(yǎng)2h和4h。凍融的方法使菌體破裂，離心去除細(xì)胞體，用該上清液喂飼甜菜夜蛾幼蟲，喂養(yǎng)1月后，統(tǒng)計死亡蟲體的數(shù)量，計算死亡率(見表1)，并測量存活蟲體的重量(見表2)。2h表達(dá)產(chǎn)物的平均致死率為48.6％，4h表達(dá)產(chǎn)物的平均致死率為73.5％，對照組為0.35％；存活蟲體平均體重試驗組為0.0086克，對照組為0.020克，說明轉(zhuǎn)化的熒光假單胞菌表達(dá)上清具有顯著的殺蟲作用。
表1、AaHIT1轉(zhuǎn)化的熒光假單胞菌表達(dá)上清的殺蟲作用

表2 甜菜夜蛾存活蟲體的重量對比表


實(shí)施例6、轉(zhuǎn)化的熒光假單胞菌抑制玉米小斑病病原菌的作用拮抗菌的篩選采用菌斑抑制法。在空白的PDA培養(yǎng)基中央打一直徑為10mm小孔，移去培養(yǎng)基，接入相同大小的病原菌，用接種環(huán)挑取待測單菌落菌體，在離病原菌的邊緣15mm處，劃1條不連續(xù)同心圓弧，劃線時注意與菌斑邊緣保持等距離。在28℃培養(yǎng)，并觀察菌斑的生長趨勢。同時做一份對照樣，不接種待測菌體，以比較抑制效果。結(jié)果表明A平板為玉米小斑病病原菌的周圍接種了A49838菌株，玉米小斑病病原菌的生長受到了限制；B平板只接種了玉米小斑病病原菌，病原菌生長良好。重復(fù)實(shí)驗后，還是產(chǎn)生了同樣的結(jié)果。平均抑菌帶為0.79CM(圖3)。
序列表<110>上海師范大學(xué)<120>一種北非蝎昆蟲毒素基因序列及應(yīng)用<130>SPI058272<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>216<212>DNA<213>人工序列<400>1atgaagaaga acggctacgc ggtggacagc agcggcaagg cgccggaatg cctgctgagc 60aactactgca acaacgaatg caccaaggtg cactacgcgg acaagggcta ctgctgcctg 120ctgagctgct actgcttcgg cctgaacgac gacaagaagg tgctggaaat cagcgacacc 180cgcaagagct actgcgacac caccatcatc aactaa21權(quán)利要求
1.一種同時滿足大腸桿菌和熒光假單胞菌嗜好的北非蝎昆蟲毒素(AaHIT1)基因人工序列，其特征在于，所述的序列見SEQ.1。
2.制備權(quán)利要求1所述的北非蝎昆蟲毒素基因序列的方法，其特征在于，該基因序列用PCR方法合成，PCR擴(kuò)增的引物為P15′-ATGAAGAAGAACGGCTACGCGGTGGACAGCAGCGGCAAGGCGCCGGAA-3′P25′-GCAACTACTGCAACAACGAATGCACCAAGGTGCACTACGCGGACAAGGGC-3′P35′-GCCTGCTGAGCTGCTACTGCTTCGGCCTGAACGACGACA-3′P45′-ATCAGCGACACCCGCAAGAGCTACTGCGACACCACCA-3′P53′-CCGTTCCGCGGCCTTACGGACGACTCGTTGATGACGTTGTTGC-5′P63′-ATGCGCCTGTTCCCGATGACGACGGACGACTCGACG-5′P73′-CGGACTTGCTGCTGTTCTTCCACGACCTTTAGTCGCTGTGGGCG-5′P83′-TGACGCTGTGGTGGTAGTAGTTGATT-5′8條引物之間互補(bǔ)的片段依次相互配對，用DNA聚合酶末端補(bǔ)平，作為PCR擴(kuò)增的模板，用P1、P8進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到完整的北非蝎昆蟲毒素基因序列。
3.一種制備北非蝎昆蟲毒素的方法，其特征在于，包括如下步驟將權(quán)利要求1所述的北非蝎昆蟲毒素基因與表達(dá)載體重組，形成重組表達(dá)載體；將重組表達(dá)載體按常規(guī)方法導(dǎo)入適宜的宿主細(xì)胞；常規(guī)方法培養(yǎng)宿主細(xì)胞，收獲非蝎昆蟲毒素蛋白。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，表達(dá)載體為pET32a，宿主細(xì)胞為大腸桿菌B121細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，表達(dá)載體為pSUP106，宿主細(xì)胞為熒光假單胞菌A49838細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求1所述的北非蝎昆蟲毒素基因人工序列的應(yīng)用，其特征在于，用于轉(zhuǎn)化熒光假單胞菌，作為新型微生物殺蟲劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及昆蟲毒素，尤其涉及昆蟲毒素基因的改造和表達(dá)。本發(fā)明用生物信息學(xué)的方法分析和計算密碼子的偏好率，依照已公開的北非蝎昆蟲毒素的氨基酸序列和大腸桿菌及熒光假單胞菌翻譯蛋白質(zhì)的密碼子的偏好，設(shè)計北非蝎昆蟲毒素的基因序列。該序列能在大腸桿菌及熒光假單胞菌中高效表達(dá)。本發(fā)明還提供一種轉(zhuǎn)化有北非蝎昆蟲毒素基因的熒光假單胞菌，作為一種潛在的新型微生物殺蟲劑。利用本發(fā)明的北非蝎昆蟲毒素基因序列表達(dá)的蛋白以及轉(zhuǎn)化熒光假單胞菌得到的基因工程菌，均能夠有效抑制甜菜夜蛾幼蟲的生長。
文檔編號C12P21/02GK1763206SQ20051002883
公開日2006年4月26日 申請日期2005年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月16日
發(fā)明者肖明 申請人:上海師范大學(xué)