專利名稱：海綿共附生優(yōu)勢細菌組成及宿主特異菌的分子鑒定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種海綿共附生優(yōu)勢細菌組成及宿主特異菌的分子鑒定方法，具體針對的是海洋無脊椎動物海綿共附生細菌的原位的基因水平上的鑒定。屬于海洋微生物分子生態(tài)學技術領域。
背景技術：
海綿具有獨特的腔狀結構，依靠過濾海水吸收營養(yǎng)生存，體內(nèi)聚集了大量的共附生微生物，一般可以達到海綿體積的40％以上。這些微生物一些可以作為海綿的食物而被消解，另外一些在海綿體內(nèi)、體表生存下來，并可能參與海綿的化學防御中或者為海綿提供能量。因此，揭示這些微生物的組成信息是開發(fā)利用海綿共附生微生物資源的前提。然而，由于目前依賴于分離培養(yǎng)的微生物研究方法僅能揭示不到1％的微生物信息，99％以上的環(huán)境微生物是目前還不能分離得到的，對于海綿共附生微生物而言，能被分離培養(yǎng)的微生物所占整個共附生微生物的比例遠小于1％，因此依賴于分離培養(yǎng)的研究方法不可能揭示海綿共附生微生物的組成信息。如果想全面地、原位地揭示海綿豐富的共附生微生物組成信息，就必須采用不依賴于分離培養(yǎng)的分子技術。
核糖體RNA基因既具有保守性又具有高變性。保守性使其能夠反映生命物種的系統(tǒng)關系，為系統(tǒng)發(fā)育提供線索；高變性則能反映出物種的特征核酸序列，是屬種鑒定的分子基礎。目前基于16S rDNA信息的分子技術已經(jīng)成為直接從分子水平揭示環(huán)境微生物區(qū)系組成的有力工具。16S rDNA文庫分析是一種經(jīng)典的揭示某一環(huán)境區(qū)系微生物多樣性組成的分子技術，其優(yōu)點在于可以全面地揭示微生物區(qū)系的整體組成信息，缺點在于操作復雜、費時，不適合不同樣品及同一樣品在不同時間或者空間時微生物組成的比較。熒光原位雜交等技術雖然能夠?qū)τ谝恍┮阎蛄械奈⑸锓植歼M行揭示，但是因為探針設計需要建立在已知基因信息基礎上，因此僅限于少數(shù)微生物信息的揭示。
如果希望能對于不同海綿樣品中的共附生微生物組成進行全面揭示和比較，DGGE(變性梯度凝膠電泳)技術是一個很好方法，其優(yōu)勢在于能快速揭示優(yōu)勢菌組成的差異性與相似性，簡便快捷，尤其適合不同樣品中微生物組成的比較，以及同一樣品在不同時間和空間時微生物組成的變化揭示。通過16S rDNA-DGGE基因指紋與克隆測序和系統(tǒng)發(fā)育樹分析相結合，就能很好地實現(xiàn)海綿共附生微生物組成與多樣性的快速揭示，這些特點是現(xiàn)有技術所不具備的。目前還沒有采用16S rDNA-DGGE技術揭示不同海綿的共附生微生物組成結構與多樣性及宿主特異細菌的方法的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種海綿共附生優(yōu)勢細菌組成及宿主特異菌的分子鑒定方法，采用不依賴于分離培養(yǎng)的分子技術，實現(xiàn)不同海綿共附生微生物的種群組成結構和宿主特異性細菌的快速揭示。
為實現(xiàn)這一目的，本發(fā)明首先采用機械研磨破碎海綿組織結構，再采用溶菌酶與蛋白酶K破壁方法釋放DNA，采用酚-氯仿抽提方法制備海綿共附生微生物宏基因組總DNA樣品。然后以提取的DNA樣品為模板，以細菌通用性引物進行16SrDNA片段的PCR(聚合酶鏈式反應)擴增。將得到的小于500bp的16S rDNA片段混合樣品進行變性梯度凝膠電泳，染色后拍照得到海綿共附生細菌的16SrDNA-DGGE基因指紋圖譜。割膠回收DNA條帶，再次PCR擴增及變性梯度凝膠電泳確認條帶位置，純化后克隆、測序，對照基因庫進行同源性與系統(tǒng)發(fā)育分析，通過一種海綿的DGGE指紋圖譜上所有條帶的分析對海綿共附生的優(yōu)勢細菌種群組成進行分子鑒定，通過找到不同海綿的DGGE指紋圖譜上的差異性條帶完成宿主特異細菌的分子鑒定。
本發(fā)明的方法具體包括如下步驟1、海綿共附生微生物的基因組總DNA的提取將海綿樣品用無菌小刀切成小塊，加入pH8.0-8.5的由三羥甲基氨基甲烷與乙二胺四乙酸二納配置的TE緩沖液，于置于冰塊上的研缽中研磨，取研磨后的懸浮液離心棄上清，加入TE緩沖液懸浮沉淀，并加入溶菌酶混勻，35-40℃水浴處理，再加入十二烷基磺酸納及蛋白酶K混勻于50-60℃水浴處理，離心取上清，加入1-1.5倍體積的三羥甲基氨基甲烷-飽和酚充分混勻重復抽提，離心取上清，依次加入1-1.5倍體積的體積比為25∶24∶1的三羥甲基氨基甲烷-飽和酚∶氯仿∶異戊醇混合液、1-1.5倍體積的體積比為24∶1的氯仿∶異戊醇混合液處理，離心取上清后，加入0.1-0.2倍體積的5M NaCl和1-2倍體積的異丙醇處理析出DNA沉淀，離心棄去異丙醇，加入70-75％的乙醇洗滌沉淀，離心棄去乙醇，干燥后將沉淀加入TE緩沖液和不含DNA酶的RNase酶，35-40℃水浴處理消解去除RNA，瓊脂糖凝膠電泳分析得到基因組總DNA樣品。
2、16S rDNA-DGGE基因指紋圖的構建以第1步得到的基因組總DNA樣品為模板，采用針對細菌16S rDNA的通用引物經(jīng)聚合酶鏈式反應擴增得到海綿共附生細菌DNA的16S rDNA片段，將小于500bp的16S rDNA的混合片段進行變性梯度凝膠電泳，染色、拍照得到變性梯度凝膠電泳的指紋圖譜。
3、海綿共附生的優(yōu)勢細菌組成的分子鑒定對于每一種海綿的變性梯度凝膠電泳的指紋圖譜，割膠回收條帶，經(jīng)無菌水多次沖洗后搗碎，加入TE緩沖液浸泡、渦旋后離心取上清作為聚合酶鏈式反應的模板進行再擴增，確認是回收的條帶后用DNA純化試劑盒純化。構建重組載體后轉(zhuǎn)化宿主菌，篩選、鑒定連接有外源DNA片段的陽性克隆，提取質(zhì)粒DNA進行16S rDNA測序，通過對照基因庫進行序列同源性比對和系統(tǒng)發(fā)育樹分析，確定條帶代表的細菌的分類地位。
4、海綿宿主特異菌的分子鑒定通過對比不同海綿的變性梯度凝膠電泳指紋圖譜的差異，找出某一海綿特有的差異性條帶，采用以上相同的方法割膠回收、克隆測序、序列同源性比對和系統(tǒng)發(fā)育樹分析，確定宿主特異菌的分類地位。
本發(fā)明采用了16S rDNA-DGGE基因指紋、克隆測序與系統(tǒng)發(fā)育分析技術對海綿共附生的優(yōu)勢細菌種群組成及宿主特異菌進行分子鑒定，克服了傳統(tǒng)依靠分離培養(yǎng)的方法的不足，原位、快速地實現(xiàn)了海綿復雜的共附生細菌種群組成的鑒定，同時實現(xiàn)了傳統(tǒng)方法很難達到的宿主特異細菌的確認。


圖1為本發(fā)明方法的技術路線流程圖。
圖2為本發(fā)明實施例中四種海綿的16S rDNA-DGGE基因指紋圖譜。
圖2中，A細薄星芒海綿；B皺皮軟海綿；C貪婪倔海綿；D澳大利亞厚皮海綿。
具體實施例方式
以下結合附圖及實施例對本發(fā)明的技術方案作進一步描述。
本發(fā)明方法的流程如圖1所示，首先獲得海綿樣品，提取基因組總DNA，利用聚合酶鏈式反應擴增得到細菌的16S rDNA片段，進行變性梯度凝膠電泳構建指紋圖譜，對于一種海綿選擇所有條帶，通過比較不同海綿變性梯度凝膠電泳構建指紋圖譜的差異找出某一海綿具有的特異性條帶，將這些條帶割膠回收克隆測序，并對照基因庫進行同源性比對和系統(tǒng)發(fā)育樹分析，完成對細菌的分子鑒定，從而揭示海綿共附生的優(yōu)勢細菌組成和海綿宿主特異菌的分子鑒定。具體實施步驟如下1.海綿共附生微生物的宏基因組DNA的提取(1)取海綿樣品用無菌小刀切成2mm3小塊，置于無菌研缽中(研缽放在冰塊上)，加入TE(pH8.010mM Tris(三羥甲基氨基甲烷)和1mM EDTA(乙二胺四乙酸二納))后研磨6-12分鐘(在無菌臺上操作)。10,000rpm離心棄上清。加入TE(pH 8.0)懸浮沉淀。
(2)加入溶菌酶混勻(10mg/ml)，37℃水浴30min。再加入10％的SDS及10mg/ml的蛋白酶K混勻，55℃水浴30min。12,000rpm離心10min取上清，加入等體積的Tris-飽和酚充分混勻處理。13,000rpm離心10min，取上清用Tris-飽和酚重復抽提一次。將上清加入等體積的Tris-飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，混勻。13,000rpm離心5min，取上清，加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)混勻處理。
(3)13,000rpm離心5min，取上清，加入0.1倍體積的5M NaCl，再加入1-1.5倍體積的異丙醇，輕輕混勻，在-20℃冰箱放置30min沉淀DNA。14,000rpm離心15min，棄去異丙醇，加入500μl 70％的乙醇洗滌沉淀。13,000rpm離心10min，棄去乙醇，風干，沉淀加入30μlTE，再加入不含DNA酶的Nase酶5μl，37℃水浴10min消解RNA。1.0％的瓊脂糖凝膠電泳，EB(溴化乙錠)染色分析檢測。
2. 16S rDNA-DGGE基因指紋圖譜的構建(1)總DNA為模板，采用引物8f(5’-GGA GAG TTT GAT CA/CT GGC T-3’)與798r(5’-CCA GGG TAT CTA ATC CTG TT-3’)擴增海綿細菌DNA的16S rDNA片段。體系及反應條件如下9μL 10×PCR緩沖液(50mmol/LTris-HCl(pH8.2)，18mmol/L MgCl2，500mmol/L KCl，0.1％甘油，1％的TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚))，10pmol的引物8f及10pmol的引物798r，2μL 10mmol/Ld NTP，1μL基因組DNA及2.5U Super Taq酶，用無菌去離子水補充體積至50μL。PCR反應程序如下94℃預變性5min，80℃保持1min，加入Super Taq酶。接著按(94℃變性1min，57℃退火1min，72℃延伸2min)25次循環(huán)，72℃延伸2min完成擴增。用1.5％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB(溴化乙錠)染色觀察。
(2)以獲得的PCR產(chǎn)物為模板，采用引物P2(5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’)與P3(5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGGGGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3’)進行16S rDNA-V3擴增。擴增體系及反應條件如下5μL 10×PCR 緩沖液(50mmol/LTris-HCl(pH8.2)，18mmol/L MgCl2，500mmol/LKCl，0.1％甘油，1％的TritonX-100)，25pmol的P3及25pmol的P2，1.75μL 10mmol/Ld NTP，2μL純的16S rDNA及2.5U Super Taq酶，用無菌去離子水補充體積至50μL。PCR反應程序如下94℃預變性5min，80℃保持1min，加入SuperTaq酶。65℃退火1min；21次循環(huán)94℃變性30S，65℃(65℃-0.5℃/循環(huán))退火30S，72℃延伸1min；5次循環(huán)94℃變性30S，55℃退火30S，72℃延伸1min；72℃延伸3min，最后4℃保存?zhèn)溆?。?.2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色觀察。
(3)在電壓150V，1×TAE電泳緩沖液(20mM Tris-醋酸，0.5mM EDTA，pH＝8.0)，60℃，電泳時間4.5h，在30-50％的變性劑梯度范圍進行DGGE電泳。得到的凝膠用固定液(10％無水乙醇，0.5％冰乙酸)固定15min，0.2％的硝酸銀染色15min，顯色液(3.0％NaOH，0.5％甲醛)顯色5min，用固定液終止反應。數(shù)碼相機拍照得到DGGE基因指紋圖譜。
3.海綿共附生的優(yōu)勢細菌組成的分子鑒定(1)用無菌的手術刀割下DGGE膠上含需回收的特征DNA片段的膠塊，經(jīng)無菌水多次沖洗后放入1.5ml離心管中，用無菌槍頭將其搗碎，加入TE緩沖液浸泡過夜。第二天將已過夜浸泡的有優(yōu)勢性條帶的1.5mlEP管用旋渦振蕩器渦旋1min后，12000r/min離心5min，取上清作為PCR的模板。對回收的優(yōu)勢性條帶進行PCR再擴增。所用引物是P15’-CCT ACG GGAGGC AGC AG-3’和P25’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’，引物P1比引物P3少一個40堿基的GC夾子。擴增體系5μl 10×PCR緩沖液(100mMTris-HCl(pH9.0)，15mM MgCl2，500mM KCl，0.1％甘油，1％的TritonX-100)1.25μl 20μM的P1或P3，1.25μl 20μM的P2，1.75μl dNTP，4μl離心上清及0.5μl Taq酶，用無菌去離子水補充體積至50μl。PCR反應程序如下20次循環(huán)94℃變性30S，55℃退火30S，72℃延伸1min；72℃延伸3min，最后4℃保存?zhèn)溆谩?br> (2)將PCR產(chǎn)物用1.2％瓊脂糖凝膠電泳，然后回收條帶用上海生工生物技術公司的UNIQ-10柱按照操作指南進行DNA純化。回收的DNA片段采用以下條件與PUCm-T載體連接1μl的連接緩沖液(50mM的Tris-HCl(pH7.8)、10mM的MgCl2、5mM的DTT、1mM的ATP、25μg/ml的BSA)+1μl PUCm-T+7μl PCR Products+1μl T4DNA ligase，16℃下連接過夜(16-18h)。
(3)轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布在LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L、葡萄糖2g/L)(含氨芐青霉素)平板上，平板在使用前預先用10μl IPTG(200mg/ml，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)和40μl X-gal(20mg/ml，5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷)涂布。
(4)采用藍白斑篩選的方法在X-gal/IPTG平板上篩選白色的連接有外源DNA片段的重組克隆。沸水浴煮沸15min，12000r/min離心2min后取上清進行PCR擴增確認是否是陽性克隆。擴增所用引物是載體引物，序列如下T7測序引物(5`-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3`)，M13反向引物(5`-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3`)，50μl體系，加入2μl模板。PCR擴增程序與16S rDNA-V3區(qū)擴增相同。
(5)取3ml培養(yǎng)好的陽性克隆的菌液提取質(zhì)粒，加入5μl 200μg/ml的RNaseA，40℃水浴10min，以降解RNA。將提到的陽性克隆的質(zhì)粒DNA用引物P2、P3(帶GC夾子)進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物跑DGGE，以在DGGE指紋上的位置是否與割膠回收的片段位置一致來確定克隆的片段是否為原先從DGGE膠中割下的條帶。
(6)將經(jīng)過位置確認的代表優(yōu)勢細菌的條帶的陽性克隆提取的質(zhì)粒送交測序公司進行16S rDNA測序。在http//www.ncbi.nlm.nih.gov上采用Blast軟件進行序列同源性比對。使用多序列聯(lián)配軟件Clustal X以N-J法進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，確定海綿優(yōu)勢細菌的分類地位。
4.海綿宿主特異菌的分子鑒定(1)將銀染后得到的不同海綿的DGGE基因指紋圖譜采用聚類分析軟件進行指紋圖帶型的相似性分析，從中找出不同海綿所具有的差異性條帶。
(2)采用步驟3中的割膠回收、克隆測序的方法進行海綿宿主特異性細菌的分子鑒定。具體方法與步驟3中相同。
采用本發(fā)明的技術路線對于我國南海細薄星芒海綿(A)、皺皮軟海綿(B)、貪婪倔海綿(C)、澳大利亞厚皮海綿(D)四種海綿的優(yōu)勢細菌種群組成進行了鑒定，取得了很好的效果。圖2是四種海綿共附生細菌的16S rDNA-DGGE基因指紋圖譜，圖中數(shù)字代表各自優(yōu)勢性條帶，從中可以明顯看出四種海綿的優(yōu)勢細菌組成的差異與相似性。通過割膠回收、克隆測序就可以得到相關特征菌的分類信息。例如測序并經(jīng)比對分析，圖中A泳道(海細薄星芒海綿)的1-10條帶細菌為α-，γ-變形菌。D泳道(澳大利亞厚皮海綿)的1-10條帶為α-變形菌、放線菌、厚壁菌、擬桿菌。兩海綿的共附生細菌種群組成有顯著差異，具體細菌的種類也不同，具有宿主特異性。
權利要求
1.一種海綿共附生優(yōu)勢細菌組成及宿主特異菌的分子鑒定方法，其特征在于包括如下步驟1)海綿共附生微生物的基因組總DNA的提取將海綿樣品用無菌小刀切成小塊，加入pH8.0-8.5的由三羥甲基氨基甲烷與乙二胺四乙酸二納配置的TE緩沖液，于置于冰塊上的研缽中研磨，取研磨后的懸浮液離心棄上清，加入TE緩沖液懸浮沉淀，并加入溶菌酶混勻，35-40℃水浴處理，再加入十二烷基磺酸納及蛋白酶K混勻于50-60℃水浴處理，離心取上清，加入1-1.5倍體積的三羥甲基氨基甲烷-飽和酚充分混勻重復抽提，離心取上清，依次加入1-1.5倍體積的體積比為25∶24∶1的三羥甲基氨基甲烷-飽和酚∶氯仿∶異戊醇混合液、1-1.5倍體積的體積比為24∶1的氯仿∶異戊醇混合液處理，離心取上清后，加入0.1-0.2倍體積的5M NaCl和1-2倍體積的異丙醇處理析出DNA沉淀，離心棄去異丙醇，加入70-75％的乙醇洗滌沉淀，離心棄去乙醇，干燥后將沉淀加入TE緩沖液和不含DNA酶的RNase酶，35-40℃水浴處理消解去除RNA，瓊脂糖凝膠電泳分析得到基因組總DNA樣品；2)16S rDNA-DGGE基因指紋圖的構建以第1步得到的基因組總DNA樣品為模板，采用針對細菌16S rDNA的通用引物經(jīng)聚合酶鏈式反應擴增得到海綿共附生細菌DNA的16S rDNA片段，將小于500bp的16S rDNA的混合片段進行變性梯度凝膠電泳，染色、拍照得到變性梯度凝膠電泳的指紋圖譜；3)海綿共附生的優(yōu)勢細菌組成的分子鑒定對于每一種海綿的變性梯度凝膠電泳的指紋圖譜，割膠回收條帶，經(jīng)無菌水多次沖洗后搗碎，加入TE緩沖液浸泡、渦旋后離心取上清作為聚合酶鏈式反應的模板進行再擴增，確認是回收的條帶后用DNA純化試劑盒純化，構建重組載體后轉(zhuǎn)化宿主菌，篩選、鑒定連接有外源DNA片段的陽性克隆，提取質(zhì)粒DNA進行16S rDNA測序，通過對照基因庫進行序列同源性比對和系統(tǒng)發(fā)育樹分析，確定條帶代表的細菌的分類地位；4)海綿宿主特異菌的分子鑒定通過對比不同海綿的變性梯度凝膠電泳指紋圖譜的差異，找出某一海綿特有的差異性條帶，采用以上相同的方法割膠回收、克隆測序、序列同源性比對和系統(tǒng)發(fā)育樹分析，確定宿主特異菌的分類地位。
全文摘要
一種海綿共附生優(yōu)勢細菌組成及宿主特異菌的分子鑒定方法，研磨破碎海綿后經(jīng)溶菌酶與蛋白酶K處理釋放DNA，采用酚－氯仿方法制備海綿共附生微生物宏基因組總DNA樣品，以其為模板，以細菌通用引物進行PCR擴增得到小于500bp的16S rDNA片段，經(jīng)變性梯度凝膠電泳將混合片段分開得到16S rDNA－DGGE基因指紋圖譜，割膠回收DNA條帶，再次PCR擴增及變性梯度凝膠電泳確認條帶位置，純化后克隆、測序，對照基因庫進行同源性與系統(tǒng)發(fā)育分析，通過一種海綿的DGGE指紋圖譜上所有條帶的分析對海綿共附生的優(yōu)勢細菌組成進行分子鑒定，通過找到不同海綿的DGGE指紋圖譜上的差異性條帶完成宿主特異菌的分子鑒定。
文檔編號C12Q1/68GK1763225SQ20051002932
公開日2006年4月26日 申請日期2005年9月1日 優(yōu)先權日2005年9月1日
發(fā)明者李志勇, 何麗明 申請人:上海交通大學