專利名稱：一種分離人脂肪組織中內(nèi)皮祖細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及組織工程學(xué)中獲得種子細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
目前組織工程血管構(gòu)建所需的內(nèi)皮種子細(xì)胞主要來源于大血管或微血管的成熟內(nèi)皮細(xì)胞，以下原因限制了其應(yīng)用一，供體血管來源有限；二，所得細(xì)胞為終末分化細(xì)胞，擴(kuò)增能力有限，不能滿足組織工程對種子細(xì)胞數(shù)量的要求。
早在1997年Asahara T等發(fā)現(xiàn)出生后循環(huán)外周血中存在能分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，考慮其與胚胎發(fā)育中血管母細(xì)胞的延續(xù)關(guān)系，將其稱為血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cell，EPC)。EPC是一類能循環(huán)、增殖并分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，但尚未表達(dá)成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞表型，也未形成血管的前體細(xì)胞。由于其在血管新生中的重要地位，EPC一直是研究熱點(diǎn)，大量的研究主要集中在從臍帶血、骨髓以及外周血中分離EPC。然而外周血中EPC獲取量極少，臍帶血存在倫理問題，而骨髓穿刺比較痛苦且細(xì)胞獲取量也較少，這些缺點(diǎn)都限制了其應(yīng)用。2001年Zuk PA等報(bào)道抽脂手術(shù)得到的皮下脂肪組織中存在多向分化的干細(xì)胞以來，從脂肪中獲取內(nèi)皮祖細(xì)胞的研究成為熱點(diǎn)目前，體外分離EPC的方法有多種，免疫磁珠(magnetic activated cellsortor，MACS)分選法是最常用的一種。而免疫磁珠分選法早期一般用CD34+磁珠，近年來更多的應(yīng)用CD133+磁珠，其最大特點(diǎn)是可以收集到較高純度的EPC，但研究也發(fā)現(xiàn)分離得到的CD34+細(xì)胞數(shù)量非常少，單獨(dú)培養(yǎng)時往往不能增殖，只能與CD34-細(xì)胞共同培養(yǎng)時才有增殖活性，而且免疫磁珠分選法操作復(fù)雜、費(fèi)用較高。
密度梯度離心結(jié)合纖維粘連蛋白(FN)黏附法也是分離EPC的一種常用方法，早就用在從骨髓或外周血中分離EPC。但用FN從脂肪組織中分選EPC，國內(nèi)外尚無此報(bào)道。
因此本領(lǐng)域迫切需要一種操作簡便、成本低廉、有效、原材料來源廣泛的分選EPC的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在利用纖維粘連蛋白(FN)從人脂肪組織中分選內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)。
在本發(fā)明的一個方面，是提供一種內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離方法，它是從脂肪組織中分選，步驟包括(1)將脂肪組織用膠原酶消化，從而解離脂肪組織中的細(xì)胞；(2)對步驟(1)中解離的細(xì)胞在800-1500g離心3-10分鐘，去除上層的脂肪獲得，獲得下層細(xì)胞；(3)將步驟(2)中獲得的下層細(xì)胞，以1×104-5×104個/cm2接種于纖維粘連蛋白(FN)包被的培養(yǎng)皿，在含1％-3％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)3-8小時；(4)去除步驟(3)中培養(yǎng)物中游離的細(xì)胞，從而獲得通過纖維粘連蛋白固定于培養(yǎng)皿的固定細(xì)胞，即為內(nèi)皮祖細(xì)胞。
其中優(yōu)選0.005-0.02％II型膠原酶消化20-60分鐘；所述的脂肪組織是人脂肪組織。
上述的分離方法，還包括步驟(5)將獲得的內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行傳代，傳代如下進(jìn)行0.05％胰酶消化，待細(xì)胞收縮變圓，終止消化；細(xì)胞收集離心；細(xì)胞計(jì)數(shù)按密度為2×104個/cm2接種。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(3)或(5)中低血清培養(yǎng)，即含10-30ml胎牛血清/升培養(yǎng)液。它包括DMEM、M199或F12培養(yǎng)液。
上述的分離方法，還包括步驟檢測分離獲得的內(nèi)皮祖細(xì)胞上標(biāo)志物CD34+。
在本發(fā)明的另一方面，是用上述的分離方法得到的內(nèi)皮祖細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，是用上述的分離方法得到的內(nèi)皮祖細(xì)胞可用于分化產(chǎn)生內(nèi)皮細(xì)胞；用上述的分離方法得到的內(nèi)皮祖細(xì)胞在組織工程中可作為內(nèi)皮種子細(xì)胞；上述的分離方法得到的內(nèi)皮祖細(xì)胞可用于制備內(nèi)皮移植物。
在本發(fā)明的另一方面，是纖維粘連蛋白(FN)在從脂肪組織中獲得內(nèi)皮祖細(xì)胞的應(yīng)用。
本發(fā)明所提供的內(nèi)皮祖細(xì)胞分選方法操作簡便、成本低廉、原材料來源廣泛。


圖1細(xì)胞形態(tài)顯微鏡觀察圖2細(xì)胞免疫熒光檢測圖3流式細(xì)胞儀(FACS)檢測圖4a.誘導(dǎo)祖細(xì)胞光鏡觀察(×200)b.誘導(dǎo)祖細(xì)胞熒光顯微鏡觀察圖5第2代細(xì)胞接種在甲基纖維素的半固體培養(yǎng)基內(nèi)顯微鏡觀察具體實(shí)施方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究發(fā)現(xiàn)在脂肪組織中存在一定含量的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)，運(yùn)用纖維粘連蛋白(FN)可以從脂肪組織中有效分選EPC。由該方法所得的內(nèi)皮祖細(xì)胞陽性率高，具有分化能力。
Fibronectin(FN)是細(xì)胞外基質(zhì)中的一種糖蛋白，參與細(xì)胞黏附、細(xì)胞運(yùn)動、傷口愈合等細(xì)胞功能性活動，本發(fā)明的一個方面在利用FN從人脂肪組織中分選EPC，應(yīng)用低血清培養(yǎng)，其步驟包括(1)將脂肪組織用膠原酶消化，從而解離脂肪組織中的細(xì)胞；(2)對步驟(1)中解離的細(xì)胞在800-1500g離心3-10分鐘，去除上層的脂肪獲得，獲得下層細(xì)胞；(3)將步驟(2)中獲得的下層細(xì)胞，以1×104-5×104個/cm2接種于纖維粘連蛋白(FN)包被的培養(yǎng)皿，在含1％-3％胎牛血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)3-8小時；(4)去除步驟(3)中培養(yǎng)物中游離的細(xì)胞，從而獲得通過纖維粘連蛋白固定于培養(yǎng)皿的固定細(xì)胞，即為內(nèi)皮祖細(xì)胞。
本發(fā)明所述的膠原酶是II型膠原酶，其中優(yōu)選0.005-0.02％II型膠原酶消化20-60分鐘；本發(fā)明所述的低血清培養(yǎng)液是含10-30ml胎牛血清/升培養(yǎng)液，它包括DMEM、M199或F12培養(yǎng)液。本發(fā)明是從人脂肪組織中分選、培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞EPC。
CD34是內(nèi)皮祖細(xì)胞主要的分子標(biāo)志，本發(fā)明得到的細(xì)胞傳至第二代CD34+陽性率高達(dá)72.39±13.45％，而不表達(dá)CD45(造血干/祖細(xì)胞的標(biāo)志)及PECAM-1(成熟內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志)，如圖3所示。本發(fā)明涉及的分離方法為組織工程血管構(gòu)建找到了新的種子細(xì)胞來源。
本發(fā)明的另一個方面是用上述方法所獲得的內(nèi)皮祖細(xì)胞EPC，所述的EPCCD34+陽性率高；能分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞；可以作為組織工程中的種子細(xì)胞。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于1.分離方法的原材料來源廣泛，不存在道德倫理問題；2.分離方法操作簡便、成本低廉；3.所獲得的EPC具有理想的分化能力。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1人脂肪組織中分離內(nèi)皮祖細(xì)胞的方法(1)將人脂肪組織用0.01％II型膠原酶消化30分鐘；(2)1200g離心5分鐘；(3)以5×104個/cm2接種于纖維粘連蛋白(FN)包被的培養(yǎng)皿，用含2％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，6小時換液；(4)待細(xì)胞融合至80-90％時，進(jìn)行傳代，傳代密度為2×104個/cm2，體外擴(kuò)增至第二代后，進(jìn)行誘導(dǎo)。
實(shí)施例2細(xì)胞誘導(dǎo)用實(shí)施例1所述的方法獲得的第二代細(xì)胞分誘導(dǎo)組與非誘導(dǎo)組，非誘導(dǎo)組用含2％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；誘導(dǎo)組用含2％胎牛血清和VEGF，bFGF等生長因子的EGM-2培養(yǎng)基培養(yǎng)。
實(shí)施例3檢測1.細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果見圖1，誘導(dǎo)12天后細(xì)胞呈典型內(nèi)皮細(xì)胞“鋪路石”樣結(jié)構(gòu)。原代細(xì)胞為梭形細(xì)胞(圖1a)；第二代細(xì)胞非誘導(dǎo)組仍為梭形(圖1b)，而誘導(dǎo)組細(xì)胞呈典型的“鋪路石”樣排列(圖1c)。
正常內(nèi)皮細(xì)胞是“鋪路石”樣形態(tài)。我們把收到的“梭形”細(xì)胞，在合適的培養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)化為內(nèi)皮樣形態(tài)。從形態(tài)上講，“梭形”細(xì)胞轉(zhuǎn)化為正常內(nèi)皮細(xì)胞樣形態(tài)，結(jié)果表明分離得到“梭形”細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞(即其祖細(xì)胞)。
2.細(xì)胞免疫熒光檢測分別培養(yǎng)和誘導(dǎo)12天后，用乙醇∶乙酸(99∶1)固定細(xì)胞15min；其中準(zhǔn)備檢測VWF的爬片加0.25％Triton X-100作用10min，以增加細(xì)胞膜的通透性，其它爬片加PBS 10min；0.5％BSA 37℃封閉30min；0.5％BSA 1∶200稀釋鼠抗人CD34、VEGFR-2、VWF和PECAM-1單抗(美國Santa Cruz公司產(chǎn)品)37℃孵育60min；加0.5％BSA 1∶50稀釋FITC標(biāo)記羊抗鼠二抗37℃孵育30min；PBS漂洗；碘化丙啶(PI)(1∶1000，美國Sigma公司)37℃孵育10min；PBS漂洗后封片，熒光顯微鏡觀察。
結(jié)果見圖2，第二代細(xì)胞非誘導(dǎo)組CD34有表達(dá)(圖2a)，而VEGFR-2、VWF和PECAM-1未見明顯的陽性表達(dá)細(xì)胞；誘導(dǎo)組VWF和PECAM-1為陽性(圖2b、2c)，而CD34、VEGFR-2未見陽性表達(dá)。CD34是未分化細(xì)胞的標(biāo)志，VWF和PECAM-1又名CD31，是成熟內(nèi)皮細(xì)胞主要標(biāo)志之一。
結(jié)果表明分離得到的非誘導(dǎo)細(xì)胞細(xì)胞表達(dá)CD34，(內(nèi)皮祖細(xì)胞的標(biāo)志之一)，是內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)。在合適的培養(yǎng)條件下轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化為VWF陽性、PECAM-1陽性(成熟內(nèi)皮細(xì)胞)。從另一角度說明“梭形”細(xì)胞能轉(zhuǎn)化為內(nèi)皮細(xì)胞。是對形態(tài)學(xué)的補(bǔ)充，表明“梭形”細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞(即其祖細(xì)胞)。
3.流式細(xì)胞儀檢測檢測細(xì)胞為第二代誘導(dǎo)組與非誘導(dǎo)組細(xì)胞。0.05％胰酶消化收集細(xì)胞；PBS洗兩遍；分裝入Eppendorf管，分別加熒光標(biāo)記的鼠抗人CD34、CD45(DAKO公司)，CD133(R&D SYSTEMS公司)，VEGFR-2、PECAM-1(Sigma公司)抗體，一管加入熒光標(biāo)記的非特異IgG作為同型對照，37℃孵育30min；PBS洗三遍；4％多聚甲醛固定，流式細(xì)胞儀檢測。
結(jié)果見表1和圖3，第2代非誘導(dǎo)組細(xì)胞有70％以上表達(dá)未分化細(xì)胞的標(biāo)志CD34，誘導(dǎo)后祖細(xì)胞標(biāo)志CD34消失，卻有67.41±13.35％細(xì)胞表達(dá)成熟內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志CD31。
表1其中的數(shù)值是陽性率(％)

**誘導(dǎo)組與非誘導(dǎo)組差異具有顯著性(P＜0.01)◇誘導(dǎo)組較之非誘導(dǎo)組，差異沒有顯著性(P＞0.01)結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)體系具有很高的誘導(dǎo)效率。梭形細(xì)胞表達(dá)CD34，而不表達(dá)CD45(目的是為了排除所得到的細(xì)胞是造血干細(xì)胞，因?yàn)樵煅杉?xì)胞CD34、CD45同時為陽性)。PECAM-1同圖2的免疫熒光一樣證明了在合適的培養(yǎng)條件下EPC轉(zhuǎn)化為成熟內(nèi)皮，陽性率高達(dá)67.41±13.35％。
圖3為統(tǒng)計(jì)分析，表明EPC同成熟內(nèi)皮細(xì)胞不一樣。盡管EPC是其前體細(xì)胞。表現(xiàn)在EPC表達(dá)CD34而不表達(dá)CD31，而成熟內(nèi)皮細(xì)胞卻相反。
4.內(nèi)皮細(xì)胞功能檢測用培養(yǎng)液稀釋DiI-ac-LDL(Biomedical Technologies Inc.公司)至10μg/ml，細(xì)胞換液；37℃培養(yǎng)箱孵育4h；PBS洗3次；熒光顯微鏡觀察。
結(jié)果見圖4，誘導(dǎo)祖細(xì)胞熒光顯微鏡觀察可見攝取DiI-ac-LDL后發(fā)出紅色熒光(×200)；非誘導(dǎo)組未見陽性結(jié)果，(圖4)。
形態(tài)學(xué)改變和細(xì)胞免疫熒光證明了誘導(dǎo)后的細(xì)胞具有成熟內(nèi)皮細(xì)胞的表型，但不能說明這些細(xì)胞是否具有內(nèi)皮細(xì)胞的功能，攝取低密度脂蛋白(LDL)是內(nèi)皮細(xì)胞的功能之一，結(jié)果表明EPC轉(zhuǎn)化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞后具有內(nèi)皮細(xì)胞的功能。
5.三維培養(yǎng)配制含0.09％甲基纖維素的半固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)的細(xì)胞以1×104個/mL接種在此培養(yǎng)基中，3天后倒置偏光顯微鏡觀察。
統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示，應(yīng)用配對t檢驗(yàn)分析。
結(jié)果見圖5，第二代細(xì)胞接種在甲基纖維素的半固體培養(yǎng)基內(nèi)3天后形成“樹枝樣”分叉結(jié)構(gòu)(圖5)。
細(xì)胞平面培養(yǎng)難以說明內(nèi)皮細(xì)胞形成血管樣結(jié)構(gòu)的情況，設(shè)置三維培養(yǎng)模型，使細(xì)胞在立體情況下生長，模擬體內(nèi)血管生成，甲基纖維素培養(yǎng)基是一種半固體培養(yǎng)基，EPC能夠在其內(nèi)成“樹枝樣”生長，結(jié)果觀察到誘導(dǎo)組細(xì)胞在型，使細(xì)胞在立體情況下生長，模擬體內(nèi)血管生成，甲基纖維素培養(yǎng)基是一種半固體培養(yǎng)基，EPC能夠在其內(nèi)成“樹枝樣”生長，結(jié)果觀察到誘導(dǎo)組細(xì)胞在三維培養(yǎng)時形成“樹枝樣”分叉結(jié)構(gòu)。表明EPC轉(zhuǎn)化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞后具有內(nèi)皮細(xì)胞的功能。
權(quán)利要求
1.一種內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離方法，其特征在于，從脂肪組織中分選，步驟包括(1)將脂肪組織用膠原酶消化，從而解離脂肪組織中的細(xì)胞；(2)對步驟(1)中解離的細(xì)胞在800-1500g離心3-10分鐘，去除上層的脂肪獲得下層細(xì)胞；(3)將步驟(2)中獲得的下層細(xì)胞，以1×104-5×104個/cm2接種于纖維粘連蛋白(FN)包被的培養(yǎng)皿，在含1％-3％胎牛血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)3-8小時；(4)去除步驟(3)中培養(yǎng)物中游離的細(xì)胞，從而獲得通過纖維粘連蛋白固定于培養(yǎng)皿的固定細(xì)胞，即為內(nèi)皮祖細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于，所述的脂肪組織是人脂肪組織。
3.如權(quán)利要求1所述的分離方法，其特征在于，還包括步驟(5)將獲得的內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行傳代，傳代如下進(jìn)行0.05％胰酶消化，待細(xì)胞收縮變圓，終止消化；細(xì)胞收集離心；細(xì)胞計(jì)數(shù)按密度為2×104個/cm2接種。
4.如權(quán)利要求1或2所述的分離方法，其特征在于，用II型膠原酶消化。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括步驟檢測分離獲得的內(nèi)皮祖細(xì)胞上標(biāo)志物CD34+。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法得到的內(nèi)皮祖細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求6所述的內(nèi)皮祖細(xì)胞的用途，其特征在于，用于分化產(chǎn)生內(nèi)皮細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法得到的內(nèi)皮祖細(xì)胞在組織工程中作為內(nèi)皮種子細(xì)胞的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離方法得到的內(nèi)皮祖細(xì)胞在制備內(nèi)皮移植物中的應(yīng)用。
10.纖維粘連蛋白(FN)在從脂肪組織中獲得內(nèi)皮祖細(xì)胞的應(yīng)用。
全文摘要
一種分離人脂肪組織中內(nèi)皮祖細(xì)胞的方法，涉及組織工程學(xué)中獲得種子細(xì)胞的方法。形態(tài)學(xué)改變和細(xì)胞免疫熒光證明了誘導(dǎo)后的細(xì)胞具有成熟內(nèi)皮細(xì)胞的表型，而且具有攝取低密度脂蛋白(LDL)的功能。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明本誘導(dǎo)體系具有很高的誘導(dǎo)效率。誘導(dǎo)組細(xì)胞在三維培養(yǎng)時形成“樹枝樣”分叉結(jié)構(gòu)。
文檔編號C12N5/08GK1932010SQ200510029628
公開日2007年3月21日 申請日期2005年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月14日
發(fā)明者崔磊, 曹誼林, 劉偉, 劉波 申請人:上海國睿生命科技有限公司