專利名稱：Is256基因在制備鑒別病原菌性質(zhì)的分子標(biāo)志物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)和臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域，涉及一種用于鑒別病原菌性質(zhì)的分子標(biāo)志物，具體涉及IS256基因用于鑒別表皮葡萄球菌侵襲性和正常性菌株的新的分子標(biāo)志物用途。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，隨著導(dǎo)管等高分子材料留置物在醫(yī)院中的廣泛使用，表皮葡萄球菌已成為與醫(yī)療器械相關(guān)的醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌。但同時(shí)，表皮葡萄球菌也是人體皮膚和粘膜表面的正常菌。因此，在臨床檢驗(yàn)中，正確地鑒別所獲得的標(biāo)本是引起感染的病原菌還是在臨床標(biāo)本收集過(guò)程中污染的正常菌株，對(duì)于采取有效的治療措施具有重要的意義。
很多實(shí)驗(yàn)表明生物膜的形成是表皮葡萄球菌致病的主要因素(Christensen，G.D.，W.A.Simpson，A.L.Bisno，and E.H.Beachey.1982.Infect Immun37318-26；Deighton，M.A.，R.Borland，and J.A.Capstick.1996.Epidemiol Infect 117267-80；Huebner，J.，and D.A.Goldmann.1999.AnnuRev Med 50223-36；von Eiff，C.，G.Peters，and C.Heilmann.2002.Lancet Infect Dis 2677-85.)。因此，人們希望用是否形成生物膜作為區(qū)分侵襲性菌株和正常菌株的標(biāo)志。Ziebuhr等發(fā)現(xiàn)87％的臨床菌株在組織培養(yǎng)板上形成了生物膜，而只有11％的皮膚來(lái)源菌株可形成生物膜(Ziebuhr，W.，C.Heilmann，F(xiàn).Gotz，P.Meyer，K.Wilms，E.Straube，and J.Hacker.1997.Infect Immun 65890-6.)。但由于生物膜的形成會(huì)受到許多條件的影響，生物膜的測(cè)定方法尚需標(biāo)準(zhǔn)化(Ziebuhr，W.，C.Heilmann，F(xiàn).Gotz，P.Meyer，K.Wilms，E.Straube，and J.Hacker.1997.Infect Immun 65890-6；Deighton，M.，and R.Borland.1993.Regulation of slime production in Staphylococcusepidermidis by iron limitation.Infect Immun 614473-9.)。因此，以生物膜為表型標(biāo)志并不是一個(gè)準(zhǔn)確、穩(wěn)定的方法。許多研究探討了以與生物膜形成相關(guān)的基因作為鑒別表皮葡萄球菌侵襲性菌株的分子標(biāo)志的可能性，包括有ica、atlE、fbe、app、agr、sar和mec等基因(Frebourg，N.B.，S.Lefebvre，S.Baert，and J.F.Lemeland.2000.J Clin Microbiol 38877-80.；Galdbart，J.O.，J.Allignet，H.S.Tung，C.Ryden，and N.El Solh.2000.J Infect Dis 182351-5.；Vandecasteele，S.J.，W.E.Peetermans，R.M.R，B.J.Rijnders，and J.Van Eldere.2003.Clin Microbiol Infect9114-9.)。其中，以ica基因研究得最為深入。ica操縱子編碼的基因調(diào)控生物膜形成必不可少的多糖細(xì)胞間粘附素(polysaccharide intercellularadhesion，PIA)的合成(Ziebuhr，W.，C.Heilmann，F(xiàn).Gotz，P.Meyer，K.Wilms，E.Straube，and J.Hacker.1997.Infect Immun 65890-6.)。但ica基因在侵襲性菌株中的分布存在很大的差異，由43％到88％，在正常菌株中則從0至38％(1，2，10，11，15，18)，以ica基因作為分子標(biāo)志并不理想。因此，有必要尋找新的鑒別表皮葡萄球菌侵襲性菌株的分子標(biāo)志。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于鑒別病原菌性質(zhì)的分子標(biāo)志物，具體涉及IS256基因用于鑒別表皮葡萄球菌侵襲性和正常性菌株的新的分子標(biāo)志物用途。
本發(fā)明通過(guò)比較臨床致病菌株RP62A和正常菌株ATCC12228的全基因組，從中發(fā)現(xiàn)細(xì)菌插入序列IS256可以作為一個(gè)新的區(qū)分侵襲性和正常性表皮葡萄球菌的分子標(biāo)志物。
本發(fā)明從全基因組水平挑選出特異地存在于致病菌株中的基因，研究分析它們?cè)诓煌瑏?lái)源菌株中的分布，進(jìn)而找出與致病菌株密切相關(guān)的基因，研究它們作為鑒別表皮葡萄球菌侵襲性菌株分子標(biāo)志的敏感性和特異性。結(jié)果為細(xì)菌插入序列IS256可以作為區(qū)分表皮葡萄球菌侵襲性和正常性菌株的分子標(biāo)志，同時(shí)，它與icaA基因共同使用可以明顯降低侵襲性菌株的假陽(yáng)性率。
本發(fā)明通過(guò)下述方法和步驟進(jìn)行，1、基因組比對(duì)將表皮葡萄球菌菌株ATCC12228的全基因組序列(Zhang，Y.Q.，S.X.Ren，等.2003.Mol Microbiol 491577-93.)與TIGR的RP62A的全基因組序列(http://www.tigr.org)進(jìn)行比較。通過(guò)blast N軟件進(jìn)行基因組比對(duì)，并用ACT軟件進(jìn)行分析(http://www.sanger.ac.uk)，得到特異地存在于RP62A基因組上的DNA片段，并用blast X軟件在NCBI nr數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索相對(duì)應(yīng)的基因。
2、菌株采集收集了117株表皮葡萄球菌菌株，分為三個(gè)組。第一組為侵襲性菌株，共40株，分別來(lái)源于上海華山醫(yī)院病人的導(dǎo)管、血液以及尿液標(biāo)本；第二組為正常菌株，共55株，分離自復(fù)旦大學(xué)學(xué)生的皮膚表面，這些學(xué)生至少半年內(nèi)沒(méi)有到過(guò)醫(yī)院；第三組來(lái)源于醫(yī)務(wù)人員，共22株，采集自華山醫(yī)院醫(yī)務(wù)人員的皮膚表面。所有菌株都經(jīng)Api-Staph(BioMérieux，里昂，法國(guó))檢驗(yàn)為表皮葡萄球菌。
3、提取表皮葡萄球菌基因組DNA提取方法參考Flamm等的方法(Flamm，R.K.，等.1984.Infect Immun 44157-61.)離心收集培養(yǎng)過(guò)夜的菌液，收集的細(xì)胞重懸于100μl 0.01M的磷酸鈉緩沖液中，其中含有20％的蔗糖及2.5mg/ml的溶菌酶。在37℃孵育45分鐘后，加入500μl的溶解緩沖液(含10mM Tris-HClpH8.0，1mM EDTA，1％SDS)和5μl 20mg/ml的蛋白酶K溶液，繼續(xù)孵育30分鐘。用酚和氯仿處理后，無(wú)水乙醇沉淀DNA。
4、PCR擴(kuò)增反應(yīng)依據(jù)RP62A的基因組序列，分別設(shè)計(jì)六對(duì)引物用于擴(kuò)增IS256，IS257，bhp，kdp，icaA和16S rRNA基因。其中16S rRNA基因用作內(nèi)對(duì)照。引物的核酸序列和PCR反應(yīng)條件見(jiàn)表一。PCR反應(yīng)用PCR MasterMix(天為時(shí)代公司，北京)在GeneAmp-9700 PCR反應(yīng)儀(Applied Biosystems，美國(guó))上完成，并用瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。同時(shí)隨機(jī)挑選PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。
5、鑒別重復(fù)片段序列PCR(Repetitive element sequence-based PCR，rep-PCR)用于rep-PCR的引物RW3A(5’-TCGCTCAAAACAACGACACC-3’)由Del Vecchio等人設(shè)計(jì)(Del Vecchio，等.1995.J Clin Microbiol 332141-4.)。Rep-PCR反應(yīng)用PCR MasterMix在GeneAmp-9700 PCR反應(yīng)儀上完成。PCR反應(yīng)條件如下94℃預(yù)熱3min，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的反應(yīng)(94℃下變性1min，54℃下退火復(fù)性1min，72℃下延伸2min)，最后在72℃下繼續(xù)延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳分析。
結(jié)果表明，IS256可以作為分子標(biāo)志有效地鑒別表皮葡萄球菌侵襲性菌株，而IS256和icaA基因的聯(lián)合使用可以明顯降低檢測(cè)侵襲性菌株的假陽(yáng)性率。


圖1是不同基因片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果。以表皮葡萄球菌RP62A基因組DNA作為模板。
圖2是不同表皮葡萄球菌菌株的代表性rep-PCR指紋圖譜。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例11)基因組比對(duì)為了找出特異地存在于表皮葡萄球菌侵襲性菌株上的基因，本發(fā)明將PR62A和ATCC12228的全基因組序列進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，除了與生物膜形成密切相關(guān)的ica操縱子外，還有一些基因、操縱子和插入序列特異地存在于RP62A的基因組中。主要有編碼耐甲氧西林的蛋白基因(mecA)，耐氨基糖苷類的蛋白基因，抗?jié)B透壓蛋白基因(kdp)，bap樣蛋白基因(bhp)及葡萄球菌插入序列IS256，IS257。
2)表皮葡萄球菌菌株的Rep-PCR分型為了排除收集菌株過(guò)程中出現(xiàn)的污染，或是所選標(biāo)本來(lái)自同一菌株爆發(fā)流行的可能性，本發(fā)明采用rep-PCR鑒定了所有菌株的基因型。結(jié)果表明，這些菌株的rep-PCR圖譜的條帶數(shù)目和大小都各不相同，說(shuō)明是不同的菌株，排除了污染及爆發(fā)流行的可能。(rep-PCR的代表性指紋圖譜見(jiàn)圖二)3)初步篩查結(jié)果為了鑒別由全基因組比對(duì)得到的4個(gè)特異性基因是否可以作為表皮葡萄球菌侵襲性菌株的分子標(biāo)志，本發(fā)明用PCR的方法檢測(cè)了這些基因在7株侵襲性菌株及5株正常菌株的分布，結(jié)果顯示bhp、kdp、IS257和IS256基因在侵襲性菌株中的分布分別為2/7、0/7、7/7及6/7，而在正常菌株中的分布分別為2/5、0/5、4/5及1/5。表明bhp、kdp和IS257基因在兩種菌株中的分布沒(méi)有明顯差異，而IS256基因在侵襲性菌株中的分布明顯高于正常菌株。
4)IS256在菌株中的分布本發(fā)明檢測(cè)了IS256在117株表皮葡萄球菌菌株中的分布。結(jié)果為，IS256在侵襲性菌株中的陽(yáng)性率為85％(34/40)，在正常菌中的陽(yáng)性率為16％(9/55)，而其在醫(yī)務(wù)人員來(lái)源的菌株中的陽(yáng)性率則居于前兩者之間，為41％(9/22)(見(jiàn)表二)。卡方檢驗(yàn)的結(jié)果表明IS256的分布在三組之間都具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見(jiàn)表三)。結(jié)果驗(yàn)證IS256是可用作鑒別表皮葡萄球菌侵襲性菌株和正常性菌株的分子標(biāo)志，
5)icaA在菌株中的分布本發(fā)明同時(shí)檢測(cè)了icaA在菌株中的分布情況。結(jié)果為，icaA在侵襲性菌株中的陽(yáng)性率為60％(24/40)，在正常菌株中的陽(yáng)性率為13％(7/55)，而在醫(yī)務(wù)人員來(lái)源的菌株中的陽(yáng)性率則居于前兩者之間，為27％(6/22)(見(jiàn)表二)?？ǚ綑z驗(yàn)的結(jié)果表明icaA的陽(yáng)性率在正常菌株組及醫(yī)務(wù)人員來(lái)源組之間不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但它們都顯著低于侵襲性菌株組(見(jiàn)表三)。
6)IS256和icaA作為分子標(biāo)志的比較本發(fā)明比較了IS256和icaA作為表皮葡萄球菌侵襲性菌株分子標(biāo)志的敏感性和特異性。
所述敏感性是指侵襲性菌株被鑒定為陽(yáng)性的比例，特異性是指正常菌株被鑒定為陰性的比例。
侵襲性菌株組和正常菌株組比較顯示，IS256的敏感性和特異性分別為85％(34/40)和84％(46/55)，而ica的敏感性和特異性則分別為60％(24/40)和87％(48/55)(見(jiàn)表二)。表明以IS256作為表皮葡萄球菌侵襲性菌株的分子標(biāo)志，其特異性與icaA基本相同，但敏感性卻明顯提高。而且，在正常菌株組中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何菌株同時(shí)存在IS256和icaA基因。
以上結(jié)果表明IS256可以作為分子標(biāo)志有效地鑒別表皮葡萄球菌侵襲性菌株，而IS256和icaA基因的聯(lián)合使用可以明顯降低檢測(cè)侵襲性菌株的假陽(yáng)性率。
表1.PCR反應(yīng)的引物及擴(kuò)增條件


表2.IS256和icaA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

表3.IS256和icaA基因在侵襲性，醫(yī)務(wù)人員及正常性三組菌株中存在情況的比較

RR(relative risk，即相對(duì)風(fēng)險(xiǎn))是指發(fā)現(xiàn)相應(yīng)基因在特定組別中較其他組別的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)。95％CI(95％ confidence interval，即95％可信區(qū)間)是指相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)值RR的95％可信區(qū)間.P-value，P值給出了相應(yīng)基因在兩組來(lái)源中存在性之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
權(quán)利要求
1.IS256基因在制備鑒別病原菌性質(zhì)的分子標(biāo)志物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述的病原菌是表皮葡萄球菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述的鑒別病原菌性質(zhì)是鑒別侵襲性表皮葡萄球菌和正常性表皮葡萄球菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述的IS256基因和icaA基因聯(lián)合使用可降低檢測(cè)侵襲性菌株的假陽(yáng)性率。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)和臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域，涉及一種用于鑒別病原菌性質(zhì)的分子標(biāo)志物，具體涉及IS256基因用于鑒別表皮葡萄球菌侵襲性和正常性菌株的新的分子標(biāo)志物用途。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較臨床致病菌株RP62A和正常菌株ATCC12228的全基因組序列，找出特異地存在于致病菌株中的基因IS256，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示細(xì)菌插入序列IS256可以作為鑒別表皮葡萄球菌侵襲性菌株的分子標(biāo)志，而且它和icaA基因的聯(lián)合使用可以明顯降低檢測(cè)侵襲性菌株的假陽(yáng)性率。本發(fā)明可用于臨床檢驗(yàn)，正確地鑒別所獲得的標(biāo)本的性質(zhì)，對(duì)于采取有效的治療措施具有重要的意義。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK1936018SQ20051002999
公開(kāi)日2007年3月28日 申請(qǐng)日期2005年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月23日
發(fā)明者高謙, 聞?dòng)衩? 顧家峰, 李華林, 李敏 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)