專(zhuān)利名稱(chēng)：納米生物酶電極的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)測(cè)試電化學(xué)變量的方法分析材料所用的生物化學(xué)電極，特別是一種含納米金屬顆粒增強(qiáng)的超靈敏的納米生物酶電極，以及它的制備方法。
背景技術(shù)：
生物傳感器由于其具有體積小、精度高、靈敏度好和便于現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定等優(yōu)點(diǎn)，在臨床診斷、工業(yè)控制、食品和藥物分析、生物藥物開(kāi)發(fā)、環(huán)境分析、軍事領(lǐng)域、生物技術(shù)和生物芯片等方面都有重要的用途。如利用葡萄糖氧化酶組裝的葡萄糖生物傳感器，可用于測(cè)量人的血糖、工業(yè)廢水、發(fā)酵或飲料中的糖份。但目前市售的葡萄糖、膽固醇等生物傳感器用的生物酶電極存在著背景電流大、響應(yīng)特性差、易受環(huán)境中氧濃度的影響以及易受電活性物質(zhì)干擾等諸多缺點(diǎn)，限制了其實(shí)際應(yīng)用。近年來(lái)，人們?cè)噲D將納米金屬粒子或納米金屬?gòu)?fù)合粒子等引入到生物傳感器的酶電極中，利用金屬納米顆粒的比表面積大、表面活性中心多、表面反應(yīng)活性高、催化效率高、吸附能力強(qiáng)，以及導(dǎo)電性好等優(yōu)異性質(zhì)，提高酶的穩(wěn)定性、催化活性和酶與電極之間電子傳遞，從而大幅度提高電極的電流響應(yīng)靈敏度。
中國(guó)專(zhuān)利CN 1427074A(2003)授權(quán)公告了一種含親水納米鉑顆粒和憎水二氧化硅顆粒的復(fù)合酶功能敏感膜及其制法和用途。它是將納米顆粒與氧化酶水溶液混合，然后再分散在高分子凝膠中，涂抹在電極表面制得納米顆粒和葡萄糖氧化酶的復(fù)合敏感膜，將電流響應(yīng)的敏感度提高了幾十倍。不足之處在于未能解決納米顆粒間易團(tuán)聚的問(wèn)題，而團(tuán)聚則會(huì)造成固定化后的酶相互間重疊，有效活性表面積下降，從而限制了酶膜敏感度的充分提高。
為了得到單分散的粒徑均勻的納米顆粒，在制備過(guò)程中選用合適的模板和穩(wěn)定劑是一種有效的方法。樹(shù)狀大分子的尺寸均一，其大小可通過(guò)生長(zhǎng)的代數(shù)來(lái)控制，尺度在幾納米的范圍內(nèi)，因此是制備納米顆粒的一種良好模板。近年來(lái)，美國(guó)的Crooks等人采用了一種新型的用樹(shù)狀大分子為模板制備單分散的過(guò)渡金屬納米簇的方法。具體做法是利用樹(shù)狀大分子聚酰胺-胺(PAMAM)內(nèi)部的氨基先與過(guò)渡金屬離子絡(luò)合，將過(guò)渡金屬捕獲在樹(shù)狀大分子中，再加入過(guò)量的還原劑將金屬離子還原成零價(jià)金屬，即可生成樹(shù)形高分子封裝的納米金屬簇，粒徑一般在5nm以?xún)?nèi)。但封裝后生成的納米金屬顆粒/樹(shù)狀大分子復(fù)合物被用作有機(jī)合成的催化劑，未涉及生物酶電極。
同時(shí)，樹(shù)狀大分子本身也是一種納米顆粒，將它組裝在傳感器上，在一定程度上也可提高傳感器的靈敏度。歐洲專(zhuān)利EP 1278061 A1(2001)公開(kāi)了一種由納米顆粒/樹(shù)狀大分子復(fù)合物構(gòu)成的化學(xué)傳感器。納米顆粒間通過(guò)功能化的樹(shù)形大分子連接而呈網(wǎng)狀排布，樹(shù)形大分子分枝可作為選擇性門(mén)戶(hù)，能夠有效攝取被分析物質(zhì)的分子，提高傳感器的靈敏度。并且樹(shù)形高分子表面富集的官能團(tuán)還為傳感器的化學(xué)選擇性提供了可能。但在此發(fā)明中，納米顆粒是存在于樹(shù)狀大分子間，團(tuán)簇粒徑大，同時(shí)此發(fā)明也未涉及酶生物傳感器。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提出一種樹(shù)形大分子封裝金屬納米粒子與酶自組裝形成多層膜傳感界面的納米生物酶電極；并公開(kāi)其制備方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案為本發(fā)明的納米生物酶電極是一種含有由樹(shù)狀大分子封裝金屬納米粒子/酶通過(guò)自組裝形成的多層膜傳感界面的生物傳感器，其特征在于，所述的納米生物酶電極包括電極，吸附在電極表面的、內(nèi)部封裝有金屬納米粒子的樹(shù)狀大分子和酶形成的多層傳感膜。
所說(shuō)的電極包括碳、鉑、銀、或金的電極；所說(shuō)的樹(shù)狀大分子是指具有樹(shù)枝狀結(jié)構(gòu)的不同代數(shù)的高分子聚合物，可以包括1-7代的聚酰胺-胺(PAMAM)，1-7代的聚丙烯亞胺(PPI)，最合適的是5代的PAMAM。
所說(shuō)的納米金屬顆粒是指過(guò)渡金屬，如銅，鉑，鈀，金，銀等單金屬納米顆?；蛩鼈兊幕旌衔镫p金屬納米顆粒。納米顆粒封裝在樹(shù)狀大分子內(nèi)部的空腔中，粒徑在0.5～5nm。每克樹(shù)狀大分子含有1.3～2.2mmol的納米金屬顆粒(1克G5.0樹(shù)狀大分子的分子量為18000，與金屬的物質(zhì)量的比是1∶25～1∶40)。
所說(shuō)的酶選用葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、辣根過(guò)氧化氫酶、膽固醇氧化酶、黃嘌呤氧化酶、乙酰膽堿酯酶、有機(jī)磷水解酶中的一種或幾種。
所說(shuō)的樹(shù)狀大分子封裝的金屬納米粒子和酶形成的多層傳感膜是由一層酶一層為封裝有納米金屬顆粒的樹(shù)狀大分子交替構(gòu)成序列層。例如ABABAB，其中A為酶，B為封裝有納米金屬顆粒的樹(shù)狀大分子。序列層數(shù)并不受限制，酶的有效吸附量逐層增加以提高傳感器的靈敏度，所以傳感器的靈敏度可以控制組裝層數(shù)進(jìn)行調(diào)節(jié)。也可選用兩種不同種類(lèi)的酶，依照相同的方法，構(gòu)建例如ABCBAB的有序列層，其中A，C為酶，B為封裝有納米金屬顆粒的樹(shù)狀大分子?；蛞来晤?lèi)推，生成不同排列的有序列層。成膜的方法是利用靜電自組裝技術(shù)，層與層之間靠靜電引力成膜。控制工藝條件，使得樹(shù)狀大分子封裝的金屬納米粒子和氧化酶帶有不同的電荷，如在溶液環(huán)境在pH值為6.8，葡萄糖氧化酶一般是帶負(fù)電荷的，而金屬納米粒子/樹(shù)狀大分子復(fù)合物則是帶正電荷的。
上述的超靈敏納米生物酶電極的制備方法包括如下步驟1)不同代數(shù)的樹(shù)狀大分子的制備采用發(fā)散法合成樹(shù)狀大分子，如聚酰胺-胺樹(shù)形高分子PAMAM是由乙二胺和丙烯酸甲酯通過(guò)Michael加成反應(yīng)和酰胺化反應(yīng)交替進(jìn)行，每完成一次完整的Michael加成反應(yīng)和酰胺化反應(yīng)，則樹(shù)狀大分子增加一代。
將整代的PAMAM(初始為乙二胺)用無(wú)水甲醇溶解，并通氮?dú)獬鹾?，?40℃～0℃下，最好是-30℃，滴加丙烯酸甲酯，反應(yīng)12～96小時(shí)后，減壓蒸餾，得到無(wú)色或淡黃色漿狀粘稠液，即得到半代的樹(shù)狀大分子PAMAM。
將乙二胺用無(wú)水甲醇溶解，通氮?dú)獬?，?40℃～0℃下，最好是-30℃，滴加半代PAMAM溶液。低溫反應(yīng)12～96小時(shí)后，將體系升至室溫，繼續(xù)反應(yīng)12～96小時(shí)后，對(duì)其減壓蒸餾(加入幾滴正丁醇作為過(guò)量乙二胺的共沸劑)，得到無(wú)色或淡黃色漿狀粘稠液，即得到整代的樹(shù)狀大分子PAMAM。
2)樹(shù)狀大分子中納米單金屬顆粒的封裝將步驟1)得到的樹(shù)狀大分子(如PAMAM)的水溶液，濃度為0.5～50μM，與含有一定濃度的金屬離子(如銅)的水溶液，濃度為1×10-6～5×10-1M，最好是0.1M，按一定的化學(xué)計(jì)量比(1∶12～64)混合，用弱酸，如檸檬酸，調(diào)節(jié)溶液的pH值在3～5間，使得金屬離子與樹(shù)狀大分子內(nèi)部的胺基絡(luò)合。再加入過(guò)量的還原劑，如水合肼、硼氫化鈉等，濃度為0.1～0.5M，最好是0.3M，還原樹(shù)狀大分子中的金屬鹽離子，即可制得封裝以有納米零價(jià)金屬的樹(shù)狀大分子復(fù)合物。樹(shù)狀大分子的粒徑一般為幾個(gè)納米，封裝在樹(shù)狀大分子內(nèi)的零價(jià)金屬的粒徑小于樹(shù)狀大分子的粒徑，因此也是幾個(gè)納米。一般四代的PAMAM封裝的鉑納米顆粒的粒徑在0.5～4nm。
樹(shù)狀大分子中雙金屬顆粒的封裝工藝基本同這一步驟，只是將與樹(shù)狀大分子混合的金屬離子溶液換成雙金屬離子的混合溶液，如鉑和鈀的二價(jià)離子的混合溶液，再經(jīng)過(guò)絡(luò)合、還原步驟進(jìn)行封裝。雙金屬離子間的化學(xué)計(jì)量比為1∶0.1～10，最好是1∶3。
3)樹(shù)狀大分子封裝的金屬納米粒子和酶形成的多層傳感膜的制備樹(shù)狀大分子封裝的金屬納米粒子和酶形成的多層傳感膜的制備是在碳、鉑、金或銀的電極上進(jìn)行的。先用鋁粉打磨鉑電極的下端部分，用體積比1∶3的硝酸與鹽酸的混合液加熱后，清洗電極表面，再放在乙醇，丙酮和氯仿的混合溶液超聲清洗電極，隨后用蒸餾水超聲沖洗，潔凈電極表面，再將金屬電極在2％氫氧化鉀的水溶液中超聲20分鐘，使金屬電極表面帶上負(fù)電荷。
在電極表面吸附樹(shù)狀大分子封裝的金屬納米粒子和酶形成的多層傳感膜的過(guò)程i)將步驟2)得到的封裝有納米金屬的樹(shù)狀大分子復(fù)合物配制成水溶液，納米金屬?gòu)?fù)合物濃度為2mg/mL，酶溶解在0.1M的緩沖液中，濃度調(diào)節(jié)在5～10mg/mL，得到封裝有納米金屬的樹(shù)狀大分子復(fù)合物水溶液A和氧化酶水溶液B。
ii)將潔凈后的鉑電極溶液豎直浸泡在封裝有納米金屬的樹(shù)狀大分子復(fù)合物的水溶液A中，水溶液的高度必須高于電極的潔凈表面處。室溫下吸附5～60min，最好是10～30min，在鉑電極表面形成一層封裝有納米金屬的樹(shù)狀大分子復(fù)合物膜。然后將鉑電極小心從吸附液中取出，用去離子水反復(fù)沖洗3～5遍氮?dú)獯蹈伞?br> iii)將步驟ii)中得到的表面已有一層封裝有納米金屬的樹(shù)狀大分子復(fù)合物膜的鉑電極再插入到氧化酶溶液B中，并按步驟ii)接下來(lái)的操作再進(jìn)行一次。用于吸附的氧化酶的量必須大于在封裝有納米金屬的樹(shù)狀大分子復(fù)合物膜表面吸附一個(gè)單分子層的量。
iv)將步驟iii)中得到鉑電極再插入到溶液A中，并按步驟ii)接下來(lái)的操作再進(jìn)行一次。如此循環(huán)多次，得到表面組裝有由樹(shù)狀大分子封裝的金屬納米粒子和酶形成的多層傳感膜的納米生物酶電極。
4)超靈敏的納米生物酶電極用于酶生物傳感器以步驟3)得到的表面含有樹(shù)狀大分子封裝的金屬納米粒子和酶，如葡萄糖氧化酶，形成的多層傳感膜的鉑電極為工作電極，鉑絲電極為對(duì)電極，Ag/AgCl電極或甘汞電極作為參比電極，組成酶生物傳感器，如葡萄糖氧化酶生物傳感器。將酶生物傳感器的三電極置于pH值為6～7的磷酸鹽緩沖溶液中，測(cè)定其響應(yīng)電流值，對(duì)應(yīng)于響應(yīng)的檢測(cè)組分濃度，如葡萄糖濃度，做出電極電流響應(yīng)曲線(xiàn)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及效果上述制得的納米生物酶電極具有如下特點(diǎn)(1)選用了結(jié)構(gòu)完整、粒徑均勻的納米級(jí)樹(shù)狀大分子作為模板制備零價(jià)納米金屬顆粒，得到的納米顆粒尺寸比較均勻，單分散性能更好；同時(shí)納米顆粒由于空間效應(yīng)被封裝在樹(shù)狀大分子內(nèi)部，仍然保持其活性；并且樹(shù)狀大分子的分支可作為選擇性門(mén)戶(hù)，小分子仍可接近被封裝的納米顆粒；(2)樹(shù)狀大分子表面富集的官能團(tuán)使得封裝了納米金屬顆粒的復(fù)合物的表面改性及與其他物質(zhì)的連接更加簡(jiǎn)單易行；(3)在鉑電極表面形成含有分散性好，粒徑在0.5～5nm的納米金屬顆粒的多層膜，納米金屬顆粒與酶的組裝有序排列，納米粒子的宏觀量子隧道效應(yīng)，可縮短響應(yīng)時(shí)間，提高酶?jìng)鞲衅鞯母袘?yīng)度，使酶?jìng)鞲衅鞯捻憫?yīng)電流成數(shù)量級(jí)地提高；并可拓寬生物傳感器測(cè)量的線(xiàn)性范圍；(4)采用靜電自組裝的方法制備由樹(shù)狀大分子封裝的金屬納米粒子和酶形成的多層傳感膜固定化酶，通過(guò)增加組裝層數(shù)可提高生物酶電極中被固定化酶的量，延長(zhǎng)了生物酶電極使用壽命，酶膜置冰箱0～4℃可保存一年以上；(5)在鉑電極表面制備由樹(shù)狀大分子封裝的金屬納米粒子和酶形成的多層傳感膜時(shí)，可根據(jù)不同的應(yīng)用需求選用不同種類(lèi)的氧化酶，制得多樣化的超靈敏的納米生物酶電極。
具體實(shí)施例方式
下面將結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但這些實(shí)施例并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例1步驟(1)將20g乙二胺溶解于100mL甲醇中，攪拌，通氮?dú)?5min，在-30℃下用恒流泵滴加1.36mol的丙烯酸甲酯，低溫下反應(yīng)48h后，將溫度升到室溫(20℃)讓其熟化48h。反應(yīng)完全后，在低于45℃，0.1MPa下減壓蒸餾除去溶劑甲醇和過(guò)量的丙烯酸甲酯，得到0.5G PAMAM。
將上述的25mmol的-0.5G PAMAM溶于100mL甲醇中，用恒流泵滴加含200mmol的乙二胺甲醇溶液中，48h低溫反應(yīng)后，再加48h室溫反應(yīng)。同樣待反應(yīng)完全后，在低于45℃，0.1MPa下減壓蒸餾，同時(shí)加入正丁醇與乙二胺組成共沸混合物后除去，得到1G PAMAM。
重復(fù)上述合成過(guò)程，可得到從0.5G到7G的不同代數(shù)的半代或整代PAMAM樹(shù)狀大分子。
將步驟(1)制備的5代樹(shù)狀大分子PAMAM配制成50μM的水溶液，用弱酸，如檸檬酸，調(diào)節(jié)溶液的pH值為5。量取20mL 5代PAMAM樹(shù)狀大分子水溶液倒入50mL的小燒杯中。
步驟(2)加入濃度為0.1M的K2PtCl4水溶液，樹(shù)狀大分子PAMAM與K2PtCl4的摩爾比為1∶30。攪拌，室溫下反應(yīng)72小時(shí)。
步驟(3)再加入相比較K2PtCl4的量20倍過(guò)量的，濃度為0.3M的還原劑NaBH4水溶液，用0.1M的鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至8，將絡(luò)合在樹(shù)狀大分子中金屬離子還原成零價(jià)納米顆粒。還原反應(yīng)迅速發(fā)生，然后將溶液倒入透析袋中，在大量水環(huán)境中透析24小時(shí)，其間經(jīng)多次換水。得到內(nèi)部封裝了納米金屬顆粒的樹(shù)狀大分子PAMAM的復(fù)合物。將此復(fù)合物配制成2mg/mL的水溶液，放置在50mL的小燒杯中。
步驟(4)將潔凈后的鉑電極溶液豎直浸泡在裝有5mg/mL的葡萄糖氧化酶溶液的50mL小燒杯中，溶液的高度必須高于電極的潔凈表面處。室溫下吸附30min，在鉑電極表面形成一層葡萄糖氧化酶的膜。然后將鉑電極小心從吸附液中取出，用磷酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗3～5遍。
步驟(5)將步驟(4)中得到的表面有一層葡萄糖氧化酶膜的鉑電極插入倒含有步驟(3)中得到的封裝有納米金屬的樹(shù)狀大分子復(fù)合物的水溶液中，并按步驟(4)接下來(lái)的操作再進(jìn)行一次，吸附時(shí)間為20min。
不斷重復(fù)步驟(4)、(5)，最后得到表面組裝有由樹(shù)狀大分子封裝的金屬納米粒子和酶形成的三個(gè)復(fù)層的傳感膜的納米生物酶電極。
步驟(6)將得到的表面含有樹(shù)狀大分子封裝的金屬Pt納米粒子和葡萄糖氧化酶形成的多層傳感膜的鉑電極為工作電極，鉑絲電極為對(duì)電極，Ag/AgCl電極作為參比電極，組成葡萄糖氧化酶生物傳感器。將酶生物傳感器的三電極置于pH值為6～7的磷酸鹽緩沖溶液中，掃描速率為50mV/S，電壓為0.6，實(shí)驗(yàn)溫度25℃。底液中葡萄糖濃度為1mM時(shí)，電極的靈敏度為450μA/mM·cm2，比未進(jìn)行增強(qiáng)的空白酶電極的靈敏度提高了750倍，在葡萄糖溶液濃度為5μM～7.5mM的范圍內(nèi)呈線(xiàn)性變化，響應(yīng)時(shí)間在5秒以?xún)?nèi)。
實(shí)施例2用體積比為3∶1的0.1M的K2PtCl4和0.1M的K2PdCl4混合溶液取代實(shí)施例1步驟(2)中的0.1M的K2PtCl4水溶液，重復(fù)實(shí)施例1中的各個(gè)步驟，最后得到表面含有樹(shù)狀大分子封裝的雙金屬Pt/Pd納米粒子和葡萄糖氧化酶形成的多層傳感膜的鉑電極，并用于葡萄糖氧化酶?jìng)鞲衅鞯臋z測(cè)。在相同的工藝條件下，測(cè)得底液中葡萄糖濃度為1mM時(shí)，電極的靈敏度為720μA/mM·cm2，比未進(jìn)行增強(qiáng)的空白酶電極的靈敏度提高了1200倍。
實(shí)施例3用過(guò)氧化氫酶取代實(shí)施例1步驟(4)中的葡萄糖氧化酶，用過(guò)氧化氫取代底液中的葡萄糖，重復(fù)實(shí)施例1中的各個(gè)步驟，最后得到表面含有樹(shù)狀大分子封裝的單金屬Pt納米粒子和過(guò)氧化氫酶形成的多層傳感膜的鉑電極，并用于過(guò)氧化氫的檢測(cè)。在相同的工藝條件下，測(cè)得底液中過(guò)氧化氫濃度為1mM時(shí)，電極的靈敏度為480μA/mM·cm2，比未進(jìn)行增強(qiáng)的空白酶電極的靈敏度(1.1μA/mM·cm2)提高了430倍。
對(duì)比例取相同活力單位和相同量的葡萄糖氧化酶溶液5mg/mL，利用重量百分比濃度為10％的戊二醛2mL進(jìn)行交聯(lián)處理，涂抹在潔凈的鉑電極表面，用于葡萄糖的檢測(cè)。在相同的工藝條件下，靈敏度僅為0.6μA/mM·cm2。
權(quán)利要求
1.一種納米生物酶電極，其特征在于，所述的納米生物酶電極包括電極，以及吸附在電極表面的、內(nèi)部封裝有金屬納米顆粒的樹(shù)狀大分子和酶形成的多層傳感膜；所說(shuō)的電極包括碳、鉑、銀、金電極中的一種；所說(shuō)的樹(shù)狀大分子是指具有樹(shù)枝狀結(jié)構(gòu)的不同代數(shù)的高分子聚合物，包括1-7代的聚酰胺-胺(PAMAM)，1-7代的聚丙烯亞胺(PPI)；所說(shuō)的納米金屬顆粒指過(guò)渡金屬中的單金屬納米顆粒或它們的混合物雙金屬納米顆粒，納米顆粒封裝在樹(shù)狀大分子內(nèi)部的空腔中，粒徑在0.5-5nm，每克樹(shù)狀大分子含有0.1-0.5μmol的納米金屬顆粒；所說(shuō)的酶選用葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、辣根過(guò)氧化氫酶、膽固醇氧化酶、黃嘌呤氧化酶、乙酰膽堿酯酶、有機(jī)磷水解酶中的一種或幾種。
2.如權(quán)利要求1所述的納米生物酶電極，其特征在于，所說(shuō)的多層傳感膜是由一層酶和一層封裝有納米金屬顆粒的樹(shù)狀大分子交替構(gòu)成的序列層，其序列層數(shù)不受限制。
3.如權(quán)利要求2所述的納米生物酶電極，其特征在于，所說(shuō)的構(gòu)成多層傳感膜的酶是單一酶。
4.如權(quán)利要求2所述的納米生物酶電極，其特征在于，所說(shuō)的構(gòu)成多層傳感膜的酶是一種以上的酶。
5.如權(quán)利要求1所述的納米生物酶電極，其特征在于，所說(shuō)的樹(shù)狀大分子為5代的聚酰胺-胺。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種樹(shù)狀大分子封裝金屬納米粒子與酶自組裝形成多層膜傳感界面的納米生物酶電極。納米顆粒由于空間效應(yīng)被封裝在樹(shù)狀大分子內(nèi)部，能保持其良好的活性；電極表面形成含有分散性好的含有納米金屬顆粒的多層膜，可縮短響應(yīng)時(shí)間，提高酶?jìng)鞲衅鞯母袘?yīng)度；本發(fā)明還延長(zhǎng)了生物酶電極使用壽命，并可根據(jù)不同的應(yīng)用需求選用不同種類(lèi)的氧化酶，制得多樣化的超靈敏的納米生物酶電極。
文檔編號(hào)C12Q1/00GK1766599SQ20051003008
公開(kāi)日2006年5月3日 申請(qǐng)日期2005年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月28日
發(fā)明者朱以華, 楊曉玲, 朱輝鈺, 郭飛 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)