專利名稱：一種動物細胞高密度連續(xù)灌注培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動物細胞大規(guī)模、高密度、無血清連續(xù)灌注培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
生物反應(yīng)器中動物細胞的培養(yǎng)過程可以有不同的操作方式，如分批培養(yǎng)(Batch)、連續(xù)培養(yǎng)(Continuous)、灌注培養(yǎng)(Perfusion)以及流加培養(yǎng)(Fed-batch)等，不同的操作方式有其不同的特點。
連續(xù)灌注培養(yǎng)，就是在培養(yǎng)過程中以一定速率加入新鮮營養(yǎng)液，并以相同速率排出上清液，同時通過反應(yīng)器上附加的細胞截留系統(tǒng)將大多數(shù)活細胞與上清液及死細胞、細胞碎片等分離，活細胞返回至反應(yīng)器內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。連續(xù)灌注培養(yǎng)不僅保持了較恒定的培養(yǎng)狀態(tài)，避免了有害代謝副產(chǎn)物的積累，而且使反應(yīng)器內(nèi)的細胞達到比較高的密度。
近年來動物細胞培養(yǎng)在細胞生理學研究，特別是在認識影響細胞生長與活力的不利因素方面已經(jīng)取得了很大的進步。通過分子遺傳控制，細胞更易于在不含動物蛋白的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在工程研究中，得到高細胞密度和高細胞活性逐漸成為普遍的話題。關(guān)于補料培養(yǎng)和灌注培養(yǎng)中補料的控制方案，越來越多的努力投向過程控制和監(jiān)測，這對于保證產(chǎn)品質(zhì)量和過程的連貫性是有益的。大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)中由于大量細胞的代謝，培養(yǎng)過程中細胞培養(yǎng)環(huán)境迅速改變，在線過程監(jiān)控十分重要。在線測定反應(yīng)器中培養(yǎng)條件、代謝產(chǎn)物和目的產(chǎn)物等大量數(shù)據(jù)，并對測定結(jié)果進行分析處理，及時對培養(yǎng)系統(tǒng)進行反饋控制，才能成功地進行大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)。
對于任何給定的動物細胞，目標產(chǎn)物濃度與細胞密度和培養(yǎng)時間的積分成正比，即P＝q∫Xvdt，因此要提高產(chǎn)物濃度及其產(chǎn)率有兩個途徑，首先是提高活細胞的密度，其次是維持盡可能長的培養(yǎng)時間，而這與培養(yǎng)基組成和細胞培養(yǎng)環(huán)境密切相關(guān)。眾所周知，動物細胞維持生長、成活并進行產(chǎn)物合成需要三十多種營養(yǎng)成分，包括葡萄糖、必需氨基酸、維生素、某些血清成分和無機鹽等，其中葡萄糖和谷氨酰胺是細胞生長、代謝和產(chǎn)物合成中最主要的碳源和能源物質(zhì)，同時動物細胞還需要適宜的培養(yǎng)環(huán)境，包括pH、滲透壓、溶解氧和溫度等。在細胞培養(yǎng)過程中只要有一種營養(yǎng)物被耗竭，就會限制細胞生長、代謝和產(chǎn)物合成，因此細胞培養(yǎng)過程中各種營養(yǎng)物的供給往往決定了生物反應(yīng)器的產(chǎn)率。然而，動物細胞生長除了要消耗營養(yǎng)物之外，還會生成許多代謝副產(chǎn)物，如氨、乳酸、非必需氨基酸和CO2等。這些副產(chǎn)物積累到一定程度往往會對細胞產(chǎn)生毒性作用或改變培養(yǎng)環(huán)境的pH和滲透壓，從而抑制細胞生長和產(chǎn)物合成?，F(xiàn)有大量研究證明動物細胞培養(yǎng)過程中營養(yǎng)物耗竭和代謝副產(chǎn)物積累的矛盾是限制細胞密度、產(chǎn)物濃度和培養(yǎng)過程產(chǎn)率的主要因素。為了消除營養(yǎng)限制，有人曾試圖在滲透壓許可范圍內(nèi)對培養(yǎng)基進行濃縮或添加營養(yǎng)成分，然而最終的結(jié)果是雖然營養(yǎng)物仍大量富余，但收效卻甚微，究其原因是培養(yǎng)基中的高濃度葡萄糖和谷氨酰胺等營養(yǎng)物質(zhì)促使了乳酸、氨和丙氨酸等代謝副產(chǎn)物的大量積累所致。為了減少乳酸和氨的生成與積累，近幾年有研究者也作了多種嘗試。例如有學者用果糖、麥芽糖和半乳糖作為碳源代替葡萄糖，雖然乳酸生成顯著減少，但細胞的能量代謝更多的轉(zhuǎn)向谷氨酰胺，從而生成更多的氨。另一方面，有研究者使用通過水解能生成谷氨酰胺的二肽(丙氨?！劝滨０泛透拾滨！劝滨０?來代替培養(yǎng)基中游離的谷氨酰胺，雖然在培養(yǎng)基高溫消毒和長期保存方面有一定優(yōu)勢，但未能達到預期的降氨效果，相反導致了大量的丙氨酸和甘氨酸積累，使培養(yǎng)基滲透壓顯著升高至對細胞生長有害的水平。其它在降氨方面的嘗試還包括通過誘導使細胞完全不需要谷氨酰胺，克隆谷氨酰胺合成酶至細胞中，以及使用滲透膜和電解等手段選擇性去除氨或銨離子等，但所有這些努力至今仍未獲任何理想結(jié)果。
事實上，動物細胞在培養(yǎng)過程中對營養(yǎng)物質(zhì)的代謝途徑受到培養(yǎng)環(huán)境和營養(yǎng)物濃度的嚴格調(diào)控，營養(yǎng)物代謝途徑不同，能量利用率和副產(chǎn)物生成具有顯著差異，最典型的是細胞對葡萄糖和谷氨酰胺的代謝。在一般批式培養(yǎng)過程中，由于葡萄糖濃度比較高，促使大部分(大于70％)葡萄糖通過糖酵解途徑代謝，導致乳酸的大量積累，且只能生成2mmolATP/mmol葡萄糖；谷氨酰胺代謝也是如此，高濃度的谷氨酰胺將加速脫氨降解使谷氨酸和氨大量積累，同時高濃度的谷氨酸又通過谷氨酸—丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶途徑生成α-酮戊二酸進入三羧酸循環(huán)，導致丙氨酸大量積累，使培養(yǎng)基滲透壓升高，且只生成9mmolATP/mmol谷氨酰胺。細胞代謝過程生化反應(yīng)動力學研究表明，細胞對葡萄糖的消耗主要受易化擴散控制，細胞膜上的葡萄糖濃度梯度是其唯一的推動力。當葡萄糖濃度較低時，細胞也可通過由Na+離子梯度推動的高親和性(米氏常數(shù)Km低于0.2mM)同向轉(zhuǎn)運過程攝取葡萄糖。另外，轉(zhuǎn)化細胞的線粒體己糖激酶活性高，且不受葡萄糖-6-P的反饋調(diào)節(jié)，因此高濃度的葡萄糖-6-P往往會強化糖酵解途徑。同樣，培養(yǎng)基中高濃度谷氨酰胺也導致細胞對谷氨酰胺的高速攝取，谷氨酰胺脫氨降解的第一步與谷氨酰胺酶同功酶的米氏常數(shù)Km相對較高(2.2至4.5mM)有關(guān)，且這一步在熱力學上是相當有利的(平衡常數(shù)K＝320)，但它同時對降低胞內(nèi)谷氨酰胺濃度非常敏感。糖酵解和谷氨酰胺脫氨降解途徑的終點都在丙酮酸，致使它在線粒體兩側(cè)積聚。當過量的丙酮酸積累超過了線粒體的氧化能力時，將迫使細胞以乳酸和丙氨酸形式分泌過剩的碳源。動物細胞的上述代謝特點就是導致為什么在批式培養(yǎng)中不可能解決營養(yǎng)物耗竭和副產(chǎn)物積累這一矛盾的根本原因。
采用葡萄糖和谷氨酰胺限制的流加培養(yǎng)或灌注培養(yǎng)，可望消除批式培養(yǎng)中一開始濃度過高而后耗竭的缺陷，通過加料使培養(yǎng)基中的葡萄糖和谷氨酰胺濃度控制在比較低的水平并得到不斷補充，代謝副產(chǎn)物不斷被稀釋或排除，近幾年國外許多研究者的實驗結(jié)果預示這種培養(yǎng)方式可為調(diào)控細胞進入高能代謝途徑并減少副產(chǎn)物積累提供幫助。例如，Glacken等人(1998，Biotechnol. Bioeng.32491-506)通過流加谷氨酰胺使其濃度在MDCK細胞的微載體培養(yǎng)中維持低水平，結(jié)果氨的生成減少了60％，同樣，Ljunggren和Haggestrom(1992，Cytotechnology 845-56)在骨髓瘤細胞培養(yǎng)中采用谷氨酰胺限制的流加培養(yǎng)，使氨生成降低了50％。進而，他們研究了在雜交瘤細胞培養(yǎng)中同時限制葡萄糖和谷氨酰胺的流加培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳酸、氨和丙氨酸生成顯著減少，而能量利用率、細胞密度和產(chǎn)物濃度得到顯著提高(1994，Biotechnol. Bioeng.44808-818)。然而，這些學者的研究工作尚存在一些不足，主要是他們往往只考慮了葡萄糖和/或谷氨酰胺，流加的培養(yǎng)基是非平衡培養(yǎng)基，限制補料一段時間后其它營養(yǎng)物質(zhì)成為細胞生長的限制性因素，最后往往是造成細胞大量死亡，死細胞數(shù)大于活細胞數(shù)，而活細胞密度和產(chǎn)物濃度的提高仍然有限。雖然培養(yǎng)基連續(xù)灌注培養(yǎng)比流加培養(yǎng)更有優(yōu)勢，除了能不斷補充營養(yǎng)物之外還能及時排去代謝副產(chǎn)物，因此所獲得的細胞密度可比批式培養(yǎng)提高一至二個數(shù)量級，但是目前所研究和應(yīng)用的灌注培養(yǎng)，由于其培養(yǎng)基是非平衡的，因此往往以高速率培養(yǎng)基灌注為代價，且使產(chǎn)物濃度大量稀釋，在經(jīng)濟上得不償失。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是公開一種動物細胞高密度連續(xù)灌注培養(yǎng)方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，滿足有關(guān)方面的需要。
本發(fā)明的方法包括如下步驟(1)目標細胞株在初始培養(yǎng)基中進行批培養(yǎng)；(2)計算培養(yǎng)過程中的細胞生長、培養(yǎng)基中各種營養(yǎng)物消耗和代謝副產(chǎn)物生成以及目標產(chǎn)物生成等動力學參數(shù)；(3)根據(jù)計算結(jié)果重新設(shè)計灌注培養(yǎng)過程中的初始培養(yǎng)基和灌注培養(yǎng)基的營養(yǎng)物組成，并進行灌注培養(yǎng)；重復(3)～(4)步驟對計算結(jié)果進行迭代優(yōu)化，并根據(jù)培養(yǎng)過程所需達到的細胞密度和生產(chǎn)能力設(shè)定培養(yǎng)基連續(xù)灌注的速率，以獲得高的細胞密度和目標產(chǎn)物濃度。動力學方程及計算批培養(yǎng)參數(shù)計算動力學方程細胞dXVdt=μXV]]>或μ=1t2-t1lnXV2XV1]]>(計算細胞的比生長速率)營養(yǎng)物dSdt=-qSXV]]>或qS=-1XVdSdt=-dSdXV]]>(計算營養(yǎng)物的比消耗速率)產(chǎn)物dPdt=qP·XV]]>或qP=1XVdPdt=μdPdXV]]>(計算細胞產(chǎn)生代謝副產(chǎn)物的比生成速率)產(chǎn)物濃度P＝qP∫Xvdt灌注培養(yǎng)參數(shù)計算動力學方程物料進出速率相等，大部分細胞截留在反應(yīng)器中，總稀釋率D＝F/V，上清流出率Ds＝Fs/V，細胞流出率Db＝Fb/V。
細胞dXvdt=(μ-kd-Db)Xv;dXddtkdXv-DbXd]]>營養(yǎng)物dSdt=D(Sf-S)-qsXv]]>產(chǎn)物dPdt=qPXv-DP]]>在穩(wěn)定狀態(tài)下，μ＝kd+Db，qs=D(Sf-S)Xv,qP=DPXv.]]>其中目標產(chǎn)物濃度可表示為P=qPXvD.]]>符號說明Xv 活細胞密度(106cells/mL)Xt 總細胞密度(106cells/mL)Viability 細胞活性(％)
μ細胞比生長速率(day-1)D 灌注速率或稱稀釋率(day-1)F 流加速率(mL/day)Gluc，Gln 底物濃度(mM)Lac，Amm 副產(chǎn)物濃度(mM)MAb單抗?jié)舛?mg/L)qGlucqGln或qs底物比消耗速率(mmol/109cells/day)pLacpAmmpAla副產(chǎn)物比生成速率(mmol/109cells/day)pMAb單抗比生產(chǎn)速率(mg/109cells/day)Yx/GlueYx/Gln單位底物消耗的細胞產(chǎn)率(109cells/mmol)Ylac/GlucYAmm/Gln單位營養(yǎng)物消耗的副產(chǎn)物產(chǎn)率(mmol/mmol)V 培養(yǎng)體積(mL)更具體的包括如下步驟(1)將需要培養(yǎng)的細胞在無血清培養(yǎng)基中采用常規(guī)的方法進行傳代適應(yīng)后，接種于生物反應(yīng)器中，接種密度為1.5～3.0×105細胞/ml；(2)反應(yīng)器設(shè)置為溫度37℃，pH為7.2，溶氧50％，攪拌轉(zhuǎn)速40～80轉(zhuǎn)/分鐘。在無血清初始培養(yǎng)基中，培養(yǎng)50～60小時后，將無血清灌注培養(yǎng)基以灌注速率D＝1.0v/vday-1的速度進入生物反應(yīng)器進行灌注培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為30～60天，從第10天起開始收液，細胞密度可達1.0～2.40×107cells/ml，產(chǎn)物濃度可達批培養(yǎng)的10倍以上；所說的細胞包括雜交瘤細胞、重組CHO細胞、293細胞、昆蟲細胞、NSO等工程細胞無血清初始培養(yǎng)基的組分和含量如下



無血清灌注培養(yǎng)基的組分和含量如下



本發(fā)明的方法具有以下特點1.本發(fā)明中所用的培養(yǎng)基是無血清培養(yǎng)基；2.在無血清培養(yǎng)基中添加了葡萄糖、谷氨酰胺、必需氨基酸以及細胞生長所需的其它營養(yǎng)物質(zhì)；3.無血清培養(yǎng)基中所添加的物質(zhì)是根據(jù)培養(yǎng)過程中細胞生長和代謝的特性，對動力學參數(shù)進行分析、計算和優(yōu)化后，形成營養(yǎng)平衡的無血清培養(yǎng)基，既避免了營養(yǎng)物不足造成限制，也避免了營養(yǎng)物過剩造成代謝副產(chǎn)物的大量積累；4.利用本發(fā)明優(yōu)化的培養(yǎng)基和優(yōu)化的灌注策略，可以在較低的灌注速率下獲得較高的細胞密度，從而使產(chǎn)物濃度得到顯著提高，避免了高灌注速率下目標產(chǎn)物的稀釋。
動物細胞培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基除無機鹽外還有葡萄糖、谷氨酰胺、各種氨基酸、各種生長因子、調(diào)節(jié)和運輸?shù)鞍椎?0多種營養(yǎng)成分組成，任何一種營養(yǎng)物的缺乏都會造成細胞生長受到限制甚至導致細胞死亡；而營養(yǎng)物過度豐富則會使代謝副產(chǎn)物如氨和乳酸的大量積累，同樣可導致細胞停止生長或死亡。研究表明，要有效地降低氨和乳酸的產(chǎn)量，必需降低葡萄糖和谷氨酰胺的濃度。本發(fā)明通過研究細胞生長、營養(yǎng)物消耗和代謝副產(chǎn)物積累的動力學特性，來研究細胞生長和營養(yǎng)物消耗和代謝副產(chǎn)物積累之間的代謝規(guī)律，確定和控制細胞生長的最佳營養(yǎng)環(huán)境，通過化學計量關(guān)系和灌注培養(yǎng)策略滿足細胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)量，從而解決了營養(yǎng)物耗竭和副產(chǎn)物積累之間的矛盾。采用本發(fā)明所形成的工藝可將各種營養(yǎng)物控制在一個較低的合適濃度，既可保證細胞的營養(yǎng)供應(yīng)，不會限制細胞的生長，又可降低有毒廢物的產(chǎn)生，從而可獲得高的細胞密度和產(chǎn)物濃度。


圖1為雜交瘤細胞連續(xù)灌注培養(yǎng)細胞生長與產(chǎn)物表達；圖2為CHO細胞連續(xù)灌注培養(yǎng)細胞生長與產(chǎn)物表達；具體實施方式
實施例1將HB58雜交瘤細胞(從ATCC獲得)在無血清培養(yǎng)基中采用？？？文獻公開的方法進行傳代適應(yīng)后，在50升生物反應(yīng)器中接種，接種密度2.0×105cells/ml。
(2)在37℃、pH為7.2的條件下在無血清初始培養(yǎng)基中，培養(yǎng)60小時后，將無血清灌注培養(yǎng)基以1.0v/v day-1的灌注速率灌注進入生物反應(yīng)器進行灌注培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為60天，從第10天起開始收液，細胞密度可達2.40×107cells/ml，產(chǎn)物濃度可達624mg/ml；培養(yǎng)過程的細胞變化見圖1，圖中，曲線1為活細胞密度，曲線2為單抗?jié)舛取?br> 通過本發(fā)明對培養(yǎng)過程的優(yōu)化，細胞對于葡萄糖、谷氨酰胺以及其它各種氨基酸等營養(yǎng)物的利用率得到了極大的提高，乳酸、氨、丙氨酸等代謝副產(chǎn)物的生成速率大幅下降，細胞密度和產(chǎn)物濃度都獲得了顯著提高。與批培養(yǎng)的結(jié)果相比，反應(yīng)器中細胞密度是批培養(yǎng)的11.32倍，產(chǎn)物濃度為9.18倍，過程產(chǎn)率為38.24倍(見表1)。


實施例2將重組CHO細胞(rCHO SS3 A2，表達人抗凝血因子III)在B.BRAUN 2升生物反應(yīng)器中接種，接種密度2.75×105cells/ml。
(2)在37℃、pH為7.2的條件下在無血清初始培養(yǎng)基中，培養(yǎng)40小時后，將無血清灌注培養(yǎng)基以0.58v/v day-1的灌注速率灌注進入生物反應(yīng)器進行灌注培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為28天，從第8天起開始收液，最高細胞密度可達1.1×107cells/ml，產(chǎn)物濃度可達390U/ml；培養(yǎng)過程的細胞變化見圖2，圖中，曲線3為活細胞密度，曲線4為總細胞密度，曲線5為產(chǎn)物(ATIII)表達量。
通過本發(fā)明對培養(yǎng)基和培養(yǎng)過程的優(yōu)化，培養(yǎng)基中各種營養(yǎng)物被控制在較低的合適水平，使代謝副產(chǎn)物的生成速率大幅下降，因此細胞密度和產(chǎn)物濃度都獲得了顯著提高。與普通培養(yǎng)基批培養(yǎng)的結(jié)果相比，細胞密度和產(chǎn)物濃度分別提高6倍和5倍。
權(quán)利要求
1.一種動物細胞高密度連續(xù)灌注培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下步驟(1)目標細胞株在初始培養(yǎng)基中進行批培養(yǎng)；(2)計算培養(yǎng)過程中的細胞生長、培養(yǎng)基中各種營養(yǎng)物消耗和代謝副產(chǎn)物生成以及目標產(chǎn)物生成等動力學參數(shù)；(3)根據(jù)計算結(jié)果重新設(shè)計灌注培養(yǎng)過程中的初始培養(yǎng)基和灌注培養(yǎng)基的營養(yǎng)物組成，并進行灌注培養(yǎng)；重復(3)～(4)步驟對計算結(jié)果進行迭代優(yōu)化，并根據(jù)培養(yǎng)過程所需達到的細胞密度和生產(chǎn)能力設(shè)定培養(yǎng)基連續(xù)灌注的速率，以獲得高的細胞密度和目標產(chǎn)物濃度。動力學方程及計算批培養(yǎng)參數(shù)計算動力學方程細胞dXVdt=μXV]]>或μ=1t2-t1lnXV2XV1]]>(計算細胞的比生長速率)營養(yǎng)物dSdt=-qSXV]]>或qS=-1XVdSdt=-μdSdXV]]>(計算營養(yǎng)物的比消耗速率)產(chǎn)物dPdt=qPXV]]>或qP=1XVdPdt=μdPdXV]]>(計算細胞產(chǎn)生代謝副產(chǎn)物的比生成速率)產(chǎn)物濃度P＝qP∫Xvdt灌注培養(yǎng)參數(shù)計算動力學方程物料進出速率相等，大部分細胞截留在反應(yīng)器中，總稀釋率D＝F/V，上清流出率Ds＝Fs/V，細胞流出率Db＝Fb/V。細胞dXvdt=(μ-kd-Db)Xv;dXddt=kdXv-DbXd]]>營養(yǎng)物dSdt=D(Sf-S)-qsXv]]>產(chǎn)物dPdt=qPXv-DP]]>在穩(wěn)定狀態(tài)下，μ=kd+Db,qs=D(Sf-S)Xv,qP=DPXv.]]>其中目標產(chǎn)物濃度可表示為P=qPXvD]]>符號說明Xv 活細胞密度(106cells/mL)Xt 總細胞密度(106cells/mL)Viability 細胞活性(％)μ 細胞比生長速率(day-1)D 灌注速率或稱稀釋率(day-1)F 流加速率(mL/day)Gluc，Gln 底物濃度(mM)Lac，Amm副產(chǎn)物濃度(mM)MAb 單抗?jié)舛?mg/L)qGlucqGln或qs底物比消耗速率(mmol/109cells/day)pLacpAmmpAla副產(chǎn)物比生成速率(mmol/109cells/day)pMAb單抗比生產(chǎn)速率(mg/109cells/day)Yx/GlucYx/Gln單位底物消耗的細胞產(chǎn)率(109cells/mmol)Ylac/GlucYAmm/Gln單位營養(yǎng)物消耗的副產(chǎn)物產(chǎn)率(mmol/mmol)V 培養(yǎng)體積(mL)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)將需要培養(yǎng)的細胞在無血清培養(yǎng)基中采用常規(guī)的方法進行傳代適應(yīng)后，接種于生物反應(yīng)器中，接種密度為1.0～3.0×105細胞/ml；(2)反應(yīng)器設(shè)置為溫度37℃，pH為7.0～7.2，溶氧40～60％，攪拌轉(zhuǎn)速40～80轉(zhuǎn)/分鐘。在無血清初始培養(yǎng)基中，培養(yǎng)50～60小時后，將無血清灌注培養(yǎng)基以灌注速率D＝1.0v/v day-1的速度進入生物反應(yīng)器進行灌注培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為10～60天。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所說的細胞包括雜交瘤細胞、重組CHO細胞、293細胞、昆蟲細胞或NSO細胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，無血清初始培養(yǎng)基的組分和含量如下
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，無血清灌注培養(yǎng)基的組分和含量如下
全文摘要
本發(fā)明公開了一種動物細胞高密度連續(xù)灌注培養(yǎng)方法。其特點是通過研究細胞生長、營養(yǎng)物消耗和代謝副產(chǎn)物積累的動力學特性來研究細胞生長和營養(yǎng)物消耗及代謝副產(chǎn)物積累之間的代謝規(guī)律，確定和控制細胞生長的最佳營養(yǎng)環(huán)境，通過化學計量關(guān)系和灌注培養(yǎng)策略滿足細胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)量。從而解決了營養(yǎng)物耗竭和副產(chǎn)物積累之間的矛盾。采用本發(fā)明所形成的工藝可將各種營養(yǎng)物控制在一個較低的合適濃度，既可保證細胞的營養(yǎng)供應(yīng)，不會限制細胞的生長，又可降低有毒廢物的產(chǎn)生，從而可獲得高的細胞密度和產(chǎn)物濃度。
文檔編號C12N5/06GK1778903SQ200510030199
公開日2006年5月31日 申請日期2005年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月29日
發(fā)明者譚文松, 朱明龍, 牛紅星, 周燕, 華平, 顧小華 申請人:華東理工大學