專利名稱：纖溶酶原激活劑的仿生親和純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體地說，是一種纖溶酶原激活劑的仿生親和純化方法。
背景技術(shù)：
組織型纖溶酶原激活劑是一種絲氨酸蛋白酶，與纖維蛋白具有很高的親和性，在循環(huán)系統(tǒng)中與纖維蛋白結(jié)合后表現(xiàn)出活性，可激活纖溶酶原成為纖溶酶，溶解血栓。組織型纖溶酶原激活劑有天然形式，也有人工設(shè)計的部分結(jié)構(gòu)域缺失的形式，如缺失纖維蛋白指環(huán)區(qū)、表皮生長因子(E)區(qū)和/或Kringle-1區(qū)的改構(gòu)形式，以延長體內(nèi)半衰期，加快擴散入和溶解血液凝塊的速度。組織型纖溶酶原激活劑是高效溶血栓藥物，是美國市場上六大類基因重組藥物之一。纖溶酶原激活劑常用的純化方法有離子交換層析，疏水層析，反相層析，以及金屬螯合，賴氨酸，苯脒等親和層析的方法。對于纖溶酶原激活劑純化來講，這些方法，專一性差，生產(chǎn)中需要多種方法組合，因此生產(chǎn)步驟多，生產(chǎn)成本高；利用天然大分子配體如蛋白酶抑制劑、抗體和凝集素的親和層析方法雖然克服了對纖溶酶原激活劑專一性差和效率低的缺點，但這些生物配體本身制備困難，成本昂貴、性質(zhì)不穩(wěn)定，不適合大規(guī)模生產(chǎn)用。
經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)文獻的檢索發(fā)現(xiàn)，Patel A在《層析期刊》上發(fā)表的《用過渡態(tài)類似物親和純化組織型纖溶酶原激活劑》(Affinity purification of tissueplasminogen activator using transition-state analogues J.Chromatogr.1990，51083-93.)。該論文通過在瓊脂糖上固相合成含精氨酸的三肽，用尿激酶和組織型纖溶酶原激活劑，發(fā)現(xiàn)D-Phe-D-Phe-Argal能夠有效純化組織型纖溶酶原激活劑。但該方法利用的D-Phe-D-Phe-Argal物質(zhì)需用固相多肽合成的方法合成，制備步驟繁瑣，成本高；此外D-Phe-D-Phe-Argal含多個多肽連接，性質(zhì)不穩(wěn)定，不能耐受在線清洗的苛刻條件。雖然可以使復雜的純化工藝簡化，但是以上缺點限制了大規(guī)模應用。因此，有必要開發(fā)高效率、低成本、步驟簡便的大規(guī)模生產(chǎn)天然或改構(gòu)人組織型纖溶酶原激活劑的方法和材料，促進產(chǎn)業(yè)化步伐。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種纖溶酶原激活劑的仿生親和純化方法，使其純化步驟少，成本低，效率高，快速、簡便、低成本、大批量純化天然或改構(gòu)人組織型纖溶酶原激活劑和尿型纖溶酶原激活劑。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，本發(fā)明以基礎(chǔ)層析介質(zhì)為原料合成仿生親和分離材料，用制備的仿生親和分離材料純化天然或改構(gòu)的人組織型纖溶酶原激活劑及片段。
所述的改構(gòu)的人組織型纖溶酶原激活劑，是指通過人工設(shè)計，保留催化結(jié)構(gòu)域、而纖維蛋白指環(huán)區(qū)、表皮生長因子(E)區(qū)和/或Kringle-1區(qū)部分或全部缺失的組織型纖溶酶原激活劑形式。
本發(fā)明包括以下步驟(1)基礎(chǔ)層析介質(zhì)與三氯三氮嗪反應活化后，與對氨基苯甲脒反應，合成仿生親和分離材料；所述的步驟(1)，是指以帶氨基的基礎(chǔ)層析介質(zhì)，與三氯三氮嗪反應活化；或者用常規(guī)化學方法對不帶氨基的基礎(chǔ)層析介質(zhì)進行活化，與氨水或氨基化合物反應生成氨基后，再與三氯三氮嗪反應活化；所述的不帶氨基的基礎(chǔ)層析介質(zhì)包括葡聚糖凝膠、交聯(lián)的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚物、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖與葡聚糖的交聯(lián)共聚物、聚丙烯酰胺/瓊脂糖復合物珠、纖維素珠和涂有化學活性基團的硅膠、多孔玻璃與陶瓷。
所述的常規(guī)化學方法指C.R.Lowe在《親和色譜導論》(洛(C.R.Lowe)著；劉毓秀譯.科學出版社，1983年5月第1版，第61-84頁)中提到的基質(zhì)活化與功能化方法，如多糖基及含羥基的其它基質(zhì)，可用鹵化氰、三嗪(均二氯三嗪或三氯三嗪)、高碘酸氧化，環(huán)氧乙烷(1，4-二羥基正丁烷雙縮水甘油醚)，環(huán)氧氯丙醇，環(huán)氧溴丙醇，雙氮丙啶，二乙烯砜，苯醌類化合物如醌，溴乙酰溴進行活化和功能化；聚丙烯酰胺基質(zhì)可用無水乙二胺，酰肼化后水解，直接堿水解進行活化和功能化；硅膠、多孔玻璃與陶瓷可用硅烷化試劑進行活化和功能化；從而在基礎(chǔ)層析介質(zhì)上介紹需要的基團。
所述的仿生親和分離材料含有兩個4-氨基苯甲脒的結(jié)構(gòu)。
(2)用上述合成的親和分離材料制備成親和層析柱，將含天然或改構(gòu)的人組織型纖溶酶原激活劑的樣品流過該親和層析柱，天然或改構(gòu)的人組織型纖溶酶原激活劑吸附在親和層析柱上，沖洗親和層析柱，不吸附在親和層析柱上的雜蛋白被除去，然后變換緩沖液條件，再沖洗親和層析柱，將結(jié)合的天然或改構(gòu)人組織型纖溶酶原激活劑洗脫下來，得到純化的天然或改構(gòu)的人組織型纖溶酶原激活劑。
所述的步驟(2)中，親和分離材料吸附纖溶酶原激活劑的條件為pH5-8，離子強度為0.05-0.2M的緩沖液；洗脫條件為pH1.0-12，離子強度為0.05-0.5M的緩沖液。
本發(fā)明既克服了親和分離材料合成步驟多，操作復雜，成本高，性質(zhì)不穩(wěn)定，的缺點，又減少了纖溶酶原激活劑大規(guī)模純化的步驟，降低了生產(chǎn)成本，可快速、簡便、低成本、大批量純化纖溶酶原激活劑。樣品比活力提高5倍以上，回收率80％以上。
具體實施例方式
實施例1一、制備分離材料取NH2-Sepharose(250ml)，用5倍體積的1M的NaCl洗滌，再用去離子水充分洗滌后，抽去水分，倒入反應器皿中，加入200ml去離子水，放于冰鹽浴中預冷。待溫度降至5℃，開始攪拌。用預冷丙酮溶解三氮嗪(45g)后加入反應容器中。用飽和NaHCO3使溶液的pH保持在6～7之間，5℃下反應3h，取出，3×10倍體積的水/丙酮(1∶1，1∶3，0∶1，1∶1，3∶1，1∶0)依次洗滌，得到得到1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(190ml)。
取1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(200ml)，稱取氨基苯甲脒(20g)用去離子水(150ml)溶解，與1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪混勻，置于溫度50℃中攪拌反應24小時，然后升溫至95℃中攪拌再反應24小時。反應結(jié)束后，取出反應物，然后用12倍體積的去離子水洗滌。得到1-氨基Sepharose-3-(4-氨基苯甲脒)-5-(4-氨基苯甲脒)-2，4，6-三氮嗪(180ml)，用20％乙醇儲存待用。
二、用親和純化改構(gòu)人組織型纖溶酶原激活劑(N-PA)將1-氨基Sepharose-3-(4-氨基苯甲脒)-5-(4-氨基苯甲脒)-2，4，6-三氮嗪親和分離材料(5ml)，裝入層析柱(1.5×5.0cm)中，用50ml Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.25M NaCl，0.05％Tween-80，pH7.5)平衡后，把溶于10ml Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.25M NaCl，0.05％Tween-80，pH7.5)中的0.3g改構(gòu)組織型纖溶酶原激活劑酶的粗品加到柱上。用Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.25M NaCl，0.05％Tween-80，pH7.5)洗去未吸附的物質(zhì)后，用50ml 50mM醋酸銨緩沖液(pH5.0)洗結(jié)合的雜蛋白，之后用50ml 0.5M醋酸銨緩沖液(pH3.4)進行洗脫，再用50ml 0.1M醋酸溶液洗脫，分步收集洗脫組分。用lowery法測定蛋白濃度，發(fā)色底物測定組織型纖溶酶原激活劑酶的活力，樣品比活力提高10倍，回收率100％。12％還原SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳分析純度，不含高分子量的雜蛋白。
實施例2一、制備分離材料取NH2-Sepharose(250ml)，用5倍體積的1M的NaCl洗滌，再用去離子水充分洗滌后，抽去水分，倒入反應器皿中，加入200ml去離子水，放于冰鹽浴中預冷。待溫度降至5℃，開始攪拌。用預冷丙酮溶解三氮嗪(45g)后加入反應容器中。用飽和NaHCO3使溶液的pH保持在6～7之間，5℃下反應3h，取出，3×10倍體積的水/丙酮(1∶1，1∶3，0∶1，1∶1，3∶1，1∶0)依次洗滌，得到得到1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(190ml)。
取1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(200ml)，稱取氨基苯甲脒(20g)用去離子水(150ml)溶解，與1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪混勻，置于溫度50℃中攪拌反應24小時，然后升溫至95℃中攪拌再反應24小時。反應結(jié)束后，取出反應物，然后用12倍體積的去離子水洗滌。得到1-氨基Sepharose-3-(4-氨基苯甲脒)-5-(4-氨基苯甲脒)-2，4，6-三氮嗪(180ml)，用20％乙醇儲存待用。
二、親和純化組織型纖溶酶原激活劑酶將1-氨基Sepharose-3-(4-氨基苯甲脒)-5-(4-氨基苯甲脒)-2，4，6-三氮嗪親和分離材料(5ml)，裝入層析柱(1.5×5.0cm)中，用50ml Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.1M NaCl，0.05％Tween-80，pH5.0)平衡后，把溶于10ml Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.1M NaCl，0.05％Tween-80，pH5.0)中的0.25克組織型纖溶酶原激活劑酶的粗品加到柱上。用Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.1M NaCl，0.05％Tween-80，pH5.0)洗去未吸附的物質(zhì)后，用50ml 50mM醋酸銨緩沖液(pH5.0)洗結(jié)合的雜蛋白，之后用50ml 0.5M醋酸銨緩沖液(pH2.0)進行洗脫，分步收集洗脫組分。用lowery法測定蛋白濃度，發(fā)色底物測定組織型纖溶酶原激活劑酶的活力，樣品比活力提高5倍，回收率大于70％。
實施例3一、制備分離材料取NH2-Sepharose(250ml)，用5倍體積的1M的NaCl洗滌，再用去離子水充分洗滌后，抽去水分，倒入反應器皿中，加入200ml去離子水，放于冰鹽浴中預冷。待溫度降至5℃，開始攪拌。用預冷丙酮溶解三氮嗪(45g)后加入反應容器中。用飽和NaHCO3使溶液的pH保持在6～7之間，5℃下反應3h，取出，3×10倍體積的水/丙酮(1∶1，1∶3，0∶1，1∶1，3∶1，1∶0)依次洗滌，得到得到1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(190ml)。
取1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(200ml)，稱取氨基苯甲脒(20g)用去離子水(150ml)溶解，與1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪混勻，置于溫度50℃中攪拌反應24小時，然后升溫至95℃中攪拌再反應24小時。反應結(jié)束后，取出反應物，然后用12倍體積的去離子水洗滌。得到1-氨基Sepharose-3-(4-氨基苯甲脒)-5-(4-氨基苯甲脒)-2，4，6-三氮嗪(180ml)，用20％乙醇儲存待用。
二、親和純化組織型纖溶酶原激活劑酶將1-氨基Sepharose-3-(4-氨基苯甲脒)-5-(4-氨基苯甲脒)-2，4，6-三氮嗪親和分離材料(5ml)，裝入層析柱(1.5×5.0cm)中，用50ml Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，0.05％Tween-80，pH9.0)平衡后，把溶于10ml Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，0.05％Tween-80，pH9.0)中的0.2g組織型纖溶酶原激活劑酶的粗品加到柱上。用Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.5M NaCl，0.05％Tween-80，pH9.0)洗去未吸附的物質(zhì)后，用50ml 50mM醋酸銨緩沖液(pH5.0)洗結(jié)合的雜蛋白，之后用50ml 0.5M醋酸銨緩沖液(pH2.4)進行洗脫，分步收集洗脫組分。用lowery法測定蛋白濃度，發(fā)色底物測定組織型纖溶酶原激活劑酶的活力，樣品比活力提高7倍，回收率大于80％。
實施例4一、制備分離材料取NH2-Sepharose(250ml)，用5倍體積的1M的NaCl洗滌，再用去離子水充分洗滌后，抽去水分，倒入反應器皿中，加入200ml去離子水，放于冰鹽浴中預冷。待溫度降至5℃，開始攪拌。用預冷丙酮溶解三氮嗪(45g)后加入反應容器中。用飽和NaHCO3使溶液的pH保持在6～7之間，5℃下反應3h，取出，3×10倍體積的水/丙酮(1∶1，1∶3，0∶1，1∶1，3∶1，1∶0)依次洗滌，得到得到1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(190ml)。
取1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(200ml)，稱取氨基苯甲脒(20g)用去離子水(150ml)溶解，與1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪混勻，置于溫度50℃中攪拌反應24小時，然后升溫至95℃中攪拌再反應24小時。反應結(jié)束后，取出反應物，然后用12倍體積的去離子水洗滌。得到1-氨基Sepharose-3-(4-氨基苯甲脒)-5-(4-氨基苯甲脒)-2，4，6-三氮嗪(180ml)，用20％乙醇儲存待用。
二、親和純化尿纖溶酶原激活劑(尿激酶)將1-氨基Sepharose-3-(4-氨基苯甲脒)-5-(4-氨基苯甲脒)-2，4，6-三氮嗪親和分離材料(5ml)，裝入層析柱(1.5×5.0cm)中，用50ml Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl 0.25M NaCl 0.05％Tween-80 pH7.5)平衡后，把溶于10ml Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl 0.25M NaCl 0.05％Tween-80 pH7.5)中的尿激酶25,0000活力單位(約60mg)的粗品加到柱上。用Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl 0.25M NaCl 0.05％Tween-80 pH7.5)洗去未吸附的物質(zhì)后，用50ml 50mM醋酸銨緩沖液(pH5.0)洗結(jié)合的雜蛋白，之后用50ml 0.5M醋酸銨緩沖液(pH3.4)洗脫尿激酶，分步收集洗脫組分。用lowery法測定蛋白濃度，發(fā)色底物測定尿激酶活力，樣品比活力提高7倍，回收率大于80％。電泳分析表明純化出了低分子量尿激酶(33KD)。尿激酶樣品比活力提高43倍，總活力回收率100％。
實施例5-、制備分離材料取NH2-Sepharose(250ml)，用5倍體積的1M的NaCl洗滌，再用去離子水充分洗滌后，抽去水分，倒入反應器皿中，加入200ml去離子水，放于冰鹽浴中預冷。待溫度降至5℃，開始攪拌。用預冷丙酮溶解三氮嗪(45g)后加入反應容器中。用飽和NaHCO3使溶液的pH保持在6～7之間，5℃下反應3h，取出，3×10倍體積的水/丙酮(1∶1，1∶3，0∶1，1∶1，3∶1，1∶0)依次洗滌，得到得到1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(190ml)。
取1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(200ml)，稱取氨基苯甲脒(20g)用去離子水(150ml)溶解，與1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪混勻，置于溫度50℃中攪拌反應24小時，然后升溫至95℃中攪拌再反應24小時。反應結(jié)束后，取出反應物，然后用12倍體積的去離子水洗滌。得到1-氨基Sepharose-3-(4-氨基苯甲脒)-5-(4-氨基苯甲脒)-2，4，6-三氮嗪(180ml)，用20％乙醇儲存待用。
二、親和純化組織型纖溶酶原激活劑酶將1-氨基Sepharose-3-(4-氨基苯甲脒)-5-(4-氨基苯甲脒)-2，4，6-三氮嗪親和分離材料(5ml)，裝入層析柱(1.5×5.0cm)中，用50ml Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.25M NaCl，0.05％Tween-80，pH5.0)平衡后，把溶于10ml Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.25M NaCl，0.05％Tween-80，pH5.0)中的0.3g改構(gòu)組織型纖溶酶原激活劑酶的粗品加到柱上。用Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.25M NaCl，0.05％Tween-80，pH5.0)洗去未吸附的物質(zhì)后，用50ml 50mM醋酸銨緩沖液(pH5.0)洗結(jié)合的雜蛋白，之后用50ml 0.5M甘氨酸-鹽酸(pH1.0)進行洗脫，分步收集洗脫組分。用lowery法測定蛋白濃度，發(fā)色底物測定組織型纖溶酶原激活劑酶的活力，樣品比活力提高7.5倍，回收率80％。
實施例6
一、制備分離材料取NH2-Sepharose(250ml)，用5倍體積的1M的NaCl洗滌，再用去離子水充分洗滌后，抽去水分，倒入反應器皿中，加入200ml去離子水，放于冰鹽浴中預冷。待溫度降至5℃，開始攪拌。用預冷丙酮溶解三氮嗪(45g)后加入反應容器中。用飽和NaHCO3使溶液的pH保持在6～7之間，5℃下反應3h，取出，3×10倍體積的水/丙酮(1∶1，1∶3，0∶1，1∶1，3∶1，1∶0)依次洗滌，得到得到1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(190ml)。
取1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪(200ml)，稱取氨基苯甲脒(20g)用去離子水(150ml)溶解，與1-氨基-Sepharose-3，5-二氯-2，4，6-三氮嗪混勻，置于溫度50℃中攪拌反應24小時，然后升溫至95℃中攪拌再反應24小時。反應結(jié)束后，取出反應物，然后用12倍體積的去離子水洗滌。得到1-氨基Sepharose-3-(4-氨基苯甲脒)-5-(4-氨基苯甲脒)-2，4，6-三氮嗪(180ml)，用20％乙醇儲存待用。
二、親和純化組織型纖溶酶原激活劑酶將1-氨基Sepharose-3-(4-氨基苯甲脒)-5-(4-氨基苯甲脒)-2，4，6-三氮嗪親和分離材料(5ml)，裝入層析柱(1.5×5.0cm)中，用50ml Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.25M NaCl，0.05％Tween-80，pH8.0)平衡后，把溶于10ml Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.25M NaCl，0.05％Tween-80，pH8.0)中的0.3g改構(gòu)組織型纖溶酶原激活劑酶的粗品加到柱上。用Tris-HCl平衡溶液(50mM Tris-HCl，0.25M NaCl，0.05％Tween-80，pH8.0)洗去未吸附的物質(zhì)后，用50ml 0.05M甘氨酸-氫氧化鈉(pH12.0)進行洗脫，分步收集洗脫組分。用lowery法測定蛋白濃度，發(fā)色底物測定組織型纖溶酶原激活劑酶的活力，樣品比活力提高8.5倍，回收率85％。
權(quán)利要求
1.一種纖溶酶原激活劑的仿生親和純化方法，其特征在于，以基礎(chǔ)層析介質(zhì)為原料合成仿生親和分離材料，用制備的仿生親和分離材料純化天然或改構(gòu)人組織型纖溶酶原激活劑及片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的纖溶酶原激活劑的仿生親和純化方法，其特征是，包括以下步驟(1)基礎(chǔ)層析介質(zhì)與三氯三氮嗪反應活化后，與對氨基苯甲脒反應，合成仿生親和分離材料；(2)用上述合成的親和分離材料制備成親和層析柱，將含天然或改構(gòu)的人組織型纖溶酶原激活劑的樣品流過該親和層析柱，天然或改構(gòu)的人組織型纖溶酶原激活劑吸附在親和層析柱上，沖洗親和層析柱，不吸附在親和層析柱上的雜蛋白被除去，然后變換緩沖液條件，再沖洗親和層析柱，將結(jié)合的天然或改構(gòu)人組織型纖溶酶原激活劑洗脫下來，得到純化的天然或改構(gòu)的人組織型纖溶酶原激活劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的纖溶酶原激活劑的仿生親和純化方法，其特征是，所述的步驟(1)中，以帶氨基的基礎(chǔ)層析介質(zhì)，與三氯三氮嗪反應活化。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的纖溶酶原激活劑的仿生親和純化方法，其特征是，所述的步驟(1)中，用常規(guī)化學方法對不帶氨基的基礎(chǔ)層析介質(zhì)進行活化，與氨水或氨基化合物反應生成氨基后，再與三氯三氮嗪反應活化；所述的不帶氨基的基礎(chǔ)層析介質(zhì)包括葡聚糖凝膠、交聯(lián)的葡聚糖珠、烯丙基葡聚糖和N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚物、瓊脂糖凝膠、瓊脂糖與葡聚糖的交聯(lián)共聚物、聚丙烯酰胺/瓊脂糖復合物珠、纖維素珠和涂有化學活性基團的硅膠、多孔玻璃與陶瓷。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的纖溶酶原激活劑的仿生親和純化方法，其特征是，所述的仿生親和分離材料含有兩個4-氨基苯甲脒的結(jié)構(gòu)。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的纖溶酶原激活劑的仿生親和純化方法，其特征是，所述的步驟(2)中，親和分離材料吸附纖溶酶原激活劑的條件為pH5-8，離子強度為0.05-0.2M的緩沖液。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的纖溶酶原激活劑的仿生親和純化方法，其特征是，所述的步驟(2)中，洗脫條件為pH1.0-12，離子強度為0.05-0.5M的緩沖液。
全文摘要
一種纖溶酶原激活劑的仿生親和純化方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明包括以下步驟(1)基礎(chǔ)層析介質(zhì)與三氯三氮嗪反應活化后，與對氨基苯甲脒反應，合成仿生親和分離材料；(2)用上述合成的親和分離材料制備成親和層析柱，將含天然或改構(gòu)的人組織型纖溶酶原激活劑的樣品流過該親和層析柱，天然或改構(gòu)的人組織型纖溶酶原激活劑吸附在親和層析柱上，沖洗親和層析柱，然后變換緩沖液條件，再沖洗親和層析柱，將結(jié)合的天然或改構(gòu)人組織型纖溶酶原激活劑洗脫下來，得到純化的天然或改構(gòu)的人組織型纖溶酶原激活劑。本發(fā)明純化步驟少，成本低，效率高，快速、簡便、低成本、大批量純化天然或改構(gòu)人組織型纖溶酶原激活劑和尿型纖溶酶原激活劑。
文檔編號C12N9/50GK1786161SQ20051003065
公開日2006年6月14日 申請日期2005年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月20日
發(fā)明者李榮秀, 吳方, 龐艷萍 申請人:上海交通大學