專利名稱：天麻特異dna分子標記序列及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種植物DNA序列，具體涉及天麻的DNA分子標記序列。
背景技術：
天麻是我國四大名貴中藥之一，具有平肝息風、止痙之功效。最新研究發(fā)現(xiàn)它還具有增智、健腦、治療老年性癡呆癥、延緩衰老、抗炎、增強免疫功能、調節(jié)心血管的作用，而且毒副作用很小，具有重要研究開發(fā)和應用價值。近十多年來，科研工作者對天麻進行了廣泛的研究。但天麻的分子遺傳學背景尚不清楚。經(jīng)國際互聯(lián)網(wǎng)查詢，在幾個國際知名的基因數(shù)據(jù)庫中，均無有關天麻的DNA序列資料，更無任何有關天麻分子遺傳學標志序列和與其有效成分天麻素相關的DNA分子標志序列。而研究與天麻有效成分天麻素含量和天麻特性相關的天麻特異DNA分子標志序列及其應用是充分開發(fā)天麻藥用價值的重要工作。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是從天麻基因組中分離出與有效成分天麻素含量和天麻特性相關的DNA分子遺傳學標記，并用于天麻品種選育和真?zhèn)舞b別。
實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術方案是本發(fā)明是經(jīng)克隆、測序和鑒定獲得的，并被美國基因數(shù)據(jù)庫Genbank登記注冊的2個DNA分子標記序列，登錄號分別為序列1AY905620，序列2AY905621。DNA序列1為360堿基對，DNA序列2為790堿基對。
特異DNA序列1用于天麻真?zhèn)舞b別和相似物種鑒定的方法為根據(jù)其兩端核苷酸序列設計一對引物，其上游序列為5′-catagccatccaaatctgcaaa-3′；下游序列為5′-aggataatattggagtgttccc-3′。用該引物擴增各種新鮮或干制天麻基因組DNA樣本，得到340bp特異擴增條帶，該DNA序列可用作分子遺傳學標志，開發(fā)檢測試劑(如DNA探針)，用于天麻真?zhèn)舞b別和相似物種鑒定。
特異DNA序列2用于天麻品種選優(yōu)與鑒定的方法為根據(jù)其兩端核苷酸序列設計一對引物，其上游序列是5′-ctaaaatatgcattggtcaatt-3′下游序列是5′-tgaacataaattctatgcatag-3′。用該引物擴增各種天麻樣本，天麻素含量高的天麻品種有770bp特異擴增條帶。該DNA序列及其引物可用于天麻品種選優(yōu)與鑒定下面結合附圖進一步詳述本發(fā)明。


圖1、用DNA序列1設計合成的一對引物擴增9種天麻基因組DNA樣本得到的擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。
M為DNA分子標記1、2、3、4、5、6、7、8、9為9種天麻基因組DNA樣本擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。
圖2、用DNA序列1設計合成的一對引物擴增馬鈴薯、菊科羊角天麻、紫茉莉、大麗菊、羽裂蟹甲草、芭蕉芋、澤蘭和大九腹牛的基因組DNA樣本的瓊脂糖凝膠電泳圖。
M為DNA分子標記10、11、12、13、14、15、16、17依次為上述8種植物的基因組DNA樣本擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。、本發(fā)明克隆天麻特異DNA分子標記序列及其應用的具體方法與步驟如下1、測定不同天麻品種樣本的有效成分天麻素含量應用索氏提取器、超聲波處理器和無水乙醇∶異丙醇(1∶1)混合液從天麻中萃取天麻素。采用高效液相色譜儀，以水∶乙腈(91∶9)為流動相，以天麻素標準品作對照；以221和270nm波長紫外光為檢測光源，測定不同天麻品種樣本的有效成分天麻素含量。
2、應用FLORACLEANTMPlant Genomic DNA Isolation kit從天麻塊莖中提取基因組DNA；3、構建天麻DNA指紋圖譜運用PCR儀、優(yōu)化的RAPD擴增條件(預變性溫度94℃3分鐘，PCR循環(huán)中的變性溫度94℃1分鐘，退火溫度38℃1分鐘，延伸溫度72℃1.5分鐘，循環(huán)40次，最后72℃延伸10分鐘)和優(yōu)化的參數(shù)[模板DNA濃度2mg/L、TaqDNA聚合酶2U，引物濃度0.4μmol/L，dNTP各0.2mmol/L，10×緩沖液(Tris-HCl 100mM，KCl 500mM，MgCl215mM)2.5μl，無菌雙蒸水補足至25μl]，以及2種隨機引物(非針對性引物)對9種天麻樣本基因組DNA進行擴增，擴增產(chǎn)物用1.4％瓊脂糖凝膠電泳分離，溴乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)照相。
4、運用DNA凝膠回收試劑盒，選擇回收天麻各品種共有的DNA序列和各品種特有的DNA序列；5、應用DNA重組技術克隆和鑒定回收的DNA序列(1)按照T載體試劑盒說明將回收DNA序列與T載體連接，其方法與步驟為在含3μl DNA溶液的0.5ml離心管中，按順序加入5μl 2×快速連接緩沖液[Tris-HCl(pH7.8)60mM，MgCl220mM，DTT20mM，ATP2mM，10％聚乙二醇]，以及1μl T載體，1μlT4 DNA連接酶，混勻，20℃左右室溫過夜。
(2)轉化DH5a大腸桿菌，其方法與步驟在含有300μl感受態(tài)細胞的1.5ml離心管中，加入10μl DNA連接物，置冰上20分鐘，置42℃水浴中45-50秒鐘，移至冰上2分鐘后加入LB(-)培養(yǎng)基700μl，于37℃中振搖培養(yǎng)1小時，離心濃縮細菌至100μl)；
(3)、運用藍白篩選法鑒定陽性重組子克隆，方法與步驟將100μl細菌涂布于含X-gal和IPTG的瓊脂培養(yǎng)基(+)平板上，置37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)14-18小時，挑1個白色菌落接種于5ml LB(+)液體培養(yǎng)基中，于37℃振搖培養(yǎng)過夜；(4)應用PCR技術對陽性重組子克隆作進一步鑒定，方法與步驟陽性菌液置沸水中水浴處理5分鐘。在0.5ml離心管中按順序加入雙蒸無菌水19.8μl、10×緩沖液[Tris-HCl(ph8.3)100mM，KCl 500mM，MgCl215mM]2.5μl、dNTPs 0.5μl、T7引物(根據(jù)T載體上游T7啟動子序列設計的引物，其序列為5′-TAATACGACTCACTATAGGGCGA-3′)0.5μl、Sp6引物(根據(jù)T載體下游Sp6啟動子序列設計的引物，其序列為5′-CATACGATTTAGGTGACACTATAG-3′)0.5μl、TaqDNA聚合酶1U、菌液1μl，混勻，置PCR儀中擴增94℃預變性3分鐘，94℃變性1分鐘、55℃退火1分鐘、72℃延伸1.5分鐘，循環(huán)35次，最后，延伸10分鐘。瓊脂糖凝膠分離檢測，根據(jù)擴增的DNA片段長度與回收的DNA長度相一致的確定為陽性克隆。
6、運用DNA自動測序儀測定陽性克隆DNA片段的核苷酸序列，根據(jù)T載體克隆位點兩惻的核苷酸序列，剪切與拼接成完整的DNA序列；根據(jù)克隆DNA片段兩端的頭10個核苷酸序列與原擴增引物是否相同，進一步確定陽性克隆的真實性。
7、將DNA序列數(shù)據(jù)輸入美國國家生物技術信息中心(NCBI)基因數(shù)據(jù)庫作BLASTN搜索，確定為新發(fā)現(xiàn)DNA序列，并申請美國NCBI基因數(shù)據(jù)庫登記注冊。
8、DNA序列標記用于天麻真?zhèn)舞b別與品種選育。
根據(jù)新發(fā)現(xiàn)的DNA序列兩端核苷酸順序設計合成引物(為了減少原隨機擴增引物可能錯配引起的誤差，設計引物從DNA序列兩端的第10個核苷酸開始)，并用于擴增天麻不同品種基因組DNA，其方法是根據(jù)引物的TM值確定退火溫度，即退火溫度比TM值低5℃左右，在0.5ml離心管中按順序加入雙蒸無菌水18.8μl、10×緩沖液[Tris-HCl(ph8.3)100mM，KCl 500mM，MgCl215mM]2.5μl、dNTPs 0.5μl、上游引物0.5μl、下游引物0.5μl、Taq DNA聚合酶1.5U、模板DNA2μl，混勻，置PCR儀中擴增94℃預變性3分鐘，94℃變性1分鐘、退火1分鐘(退火溫度依引物TM值下降5℃)、72℃延伸1.5分鐘，循環(huán)35次，最后，延伸10分鐘。然后用瓊脂糖凝膠分離檢測。根據(jù)各個天麻品種有無特異DNA條帶，確定DNA序列為天麻共有的特異DNA分子標記或某一品種的特異DNA分子標記。根據(jù)天麻DNA分子標記與天麻素含量高的相關性，確定該DNA分子標記為含天麻素高的優(yōu)良天麻品種的特異分子標記。這些DNA序列標記可用于天麻真?zhèn)舞b別、品種選育、基因分型、品種鑒定和系統(tǒng)分類。
本發(fā)明的DNA分子標記序列是利用下列隨機引物擴增3個天麻品種9個樣本的基因組DNA，構建天麻DNA指紋圖譜，然后，回收不同天麻品種的共有DNA序列和特有DNA序列，加以克隆、鑒定和篩選得到的。與天麻真?zhèn)舞b別和品種選育有關的兩個序列的隨機引物如下DNA序列1來自烏桿天麻2，它的隨機引物序列是5′-gtttcgctcc-3′；DNA序列2來自烏桿天麻1，其隨機引物序列是5′-tgctctgccc-3′。
對克隆和鑒定的DNA序列加以測序和拼接，構成完整的DNA序列，然后，檢索美國NCBI基因數(shù)據(jù)庫，確定為新發(fā)現(xiàn)的DNA序列。根據(jù)新發(fā)現(xiàn)DNA序列的兩端核苷酸序列設計兩對引物，對3個天麻品種9個樣本基因組DNA進行PCR擴增分析。
2對引物的序列構成和擴增結果分別是1、根據(jù)DNA序列1設計的一對引物為上游引物序列是5′-catagccatccaaatctgcaaa-3′；下游引物序列是5′-aggataatattggagtgttccc-3′。
用這對引物和PCR技術擴增各種天麻基因組DNA樣本和天麻偽品的結果為所測天麻不同品種DNA樣本(無論新鮮還是干制天麻)都有340bp(堿基對)特異擴增條帶，而天麻偽品沒有該特異條帶。因此，DNA序列1可作為分子遺傳學標記和檢測試劑(如DNA探針)，用于天麻真?zhèn)舞b別和類似物種鑒定。
2、根據(jù)DNA序列2設計的一對引物為上游引物序列是 5′-ctaaaatatgcattggtcaatt-3′下游引物序列是 5′-tgaacataaattctatgcatag-3′用這對引物和PCR技術擴增各種天麻基因組DNA樣本的結果為只有天麻素含量最高的紅桿天麻3和烏桿天麻1有770bp特異擴增條帶。DNA序列2及其引物可用于天麻品種選育與鑒定。
本發(fā)明利用2個特異DNA分子標記序列開發(fā)相關產(chǎn)品，如DNA探針、PCR擴增引物，用于天麻真?zhèn)舞b別和發(fā)現(xiàn)天麻優(yōu)良品種，為充分開發(fā)名貴中藥資源—天麻的藥用價值提供了有廣闊前景的技術。
具體實施例實施例1、采用植物基因組DNA提取試劑盒，按說明從天麻及其偽品中提取基因組DNA；根據(jù)本專利DNA序列1的核苷酸序列，從其兩端的第10個核苷酸開始設計和合成引物，上游引物是5′-catagccatccaaatctgcaaa-3′，下游引物是5′-aggataatattggagtgttccc-3′，(由于引物設計是從第10個核苷酸開始的，該引物擴增的條帶長度比原序列要少20個核苷酸)，然后，以天麻及其偽品基因組DNA為模板，用這對引物進行PCR擴增。擴增方法是在0.5ml離心管中按順序加入雙蒸無菌水18.8μl、10×緩沖液[Tris-HCl(ph8.3)100mM，KCl 500mM，MgCl215mM]2.5μl、dNTPs 0.5μl、上游引物0.5μl、下游引物0.5μl、Taq DNA聚合酶0.3μl(1.5U)、模板DNA2μl，混勻，置PCR儀中擴增94℃預變性3分鐘，94℃變性1分鐘、54℃退火1分鐘、72℃延伸1.5分鐘，循環(huán)35次，最后，延伸10分鐘。然后用1.4％瓊脂糖凝膠分離檢測，根據(jù)擴增結果有無特異條帶，以鑒別天麻樣本真?zhèn)?。如圖1和圖2所示，擴增的9種天麻基因組DNA樣本都有340bp的特異條帶；而馬鈴薯、菊科羊角天麻、紫茉莉、大麗菊、羽裂蟹甲草、芭蕉芋、澤蘭、大九腹牛等天麻偽品都沒有340bp的特異擴增條帶。因此，可以鑒別天麻真?zhèn)巍?br> 應用該引物擴增不同天麻品種得到340bp特異DNA片段，然后，測定該DNA片段的核苷酸序列；再比較分析不同天麻品種該DNA片段的單核苷酸序列差異，可從單核苷酸水平對天麻進行系統(tǒng)分類。
實施例2、用DNA序列2設計合成DNA引物，上游引物序列是5′-ctaaaatatgcattggtcaatt-3′，下游引物序列是5′-tgaacataaattctatgcatag-3′，用該引物擴增不同品種天麻基因組DNA。具體方法在0.5ml離心管中按順序加入雙蒸無菌水18.8μl、10×緩沖液[Tris-HCl(ph8.3)100mM，KCl 500mM，MgCl215mM]2.5μl、dNTPs 0.5μl、上游引物0.5μl、下游引物0.5μl、Taq DNA聚合酶0.3μl(1.5U)、模板DNA2μl，混勻，置PCR儀中擴增94℃預變性3分鐘，94℃變性1分鐘、40℃退火1分鐘、72℃延伸1.5分鐘，循環(huán)35次，最后，延伸10分鐘。然后用1.4％瓊脂糖凝膠分離檢測，根據(jù)擴增結果有無770bp特異DNA條帶，確定樣本是否為天麻素含量高的天麻品種。有770bp特異DNA條帶的為天麻素含量高的天麻品種，天麻素含量高達0.318～0.385％，比其他天麻品種高15～36％。還可以用DNA回收試劑盒回收該DNA片段，再以該DNA片段為模板，制成地高辛標記DNA探針。具體方法是在反應管中，加入1μg模板DNA，加無菌雙蒸水至15μl，沸水浴5～10分鐘，冰浴驟冷。然后，加1μl合成引物和4μl地高辛標記試劑，混勻后離心數(shù)秒鐘，37℃水浴10小時左右，65℃加熱10分鐘終止反應。該DNA探針，可作為生化檢驗試劑，通過與樣本DNA進行點雜交和根據(jù)有無雜交斑點，可檢測優(yōu)良天麻遺傳類型。
<210>1<211>360<212>DNA<213>天麻特異DNA分子標記序列<220>
<400>1gtttcgctcc catagccatc caaatctgca aaccagctca acctttcaat ttttaatcag 60cccaaactat acatacagct tgccagatcg ttacaatacc ttatcatcac ctatctaggc 120cttagcctca caattaacaa aatacgacaa tatatgaata atcctacaca agctcatttt 180gatcggctaa agtgcatctt gtggtatgtc aagggaaccc ttcacaatgg acttcactca 240ccacggacaa cctacatcta tgggcctatg cagattttga ttgggccaga gacactgatg 300gccgcaagtt cactactgca tccttctggg aacactccaa tattatcctg gagcgaaaca 360<210>2<211>790<212>DNA<213>天麻特異DNA分子標記序列<220>
<400>1tgctctgccc ctaaaatatg cattggtcaa ttgagtggat caactgccac ccaactaact 60aactgatcag tcggtgccaa ttatagtttt aaactgaatt aaagagcatg tgttaaatac 120taacacatga ttaaagccat ccacctctat agttggagag atctagggaa aagttactgg 180taaaaccatg ttgcctcgtg ggttcgagtc catcatgtaa tccacatatt ttcattttcc 240atgtccgctc ccctccacac ttctactaga agacaattag ttttcaaatt catacgcgtg 300caataagctt gtggaaagga gaagggaaat atgcacgtga gttaccatat ttttgtgatc 360cacaacatct agtaaatatt tttcctccaa tggaagcaaa gaagttgcaa acatttttta 420tccaaccaat atgattgagg gaaaggagtg caaatctgac aacaatttgc aaattctgct 480
tagcatttga tatgtgcata atgccctaga gttgtatcac gcctccgcat attatggata 540attgtcatcc acatccatta aactaatatt tacaaaaaat attcaaatta cttgatttta 600catatccaat atttcgtata tttttttaat atcaaatact tttagtaatg ttttgtaatt 660atcctaattt taataggaat gaatcataaa tcaagacatc tgatgaacat tgtcacaaat 720ctaagcactc tatataactc aaacccaccc tagcatacta tgcatagaat ttatgttcag 780ggcagagcaa790
權利要求
1.一種與天麻特性及天麻素含量相關的天麻特異DNA分子標記序列，其特征在于該天麻特異DNA分子的核苷酸序列為序列1gtttcgctcc catagccatc caaatctgca aaccagctca acctttcaat ttttaatcag 60cccaaactat acatacagct tgccagatcg ttacaatacc ttatcatcac ctatctaggc 120cttagcctca caattaacaa aatacgacaa tatatgaata atcctacaca agctcatttt 180gatcggctaa agtgcatctt gtggtatgtc aagggaaccc ttcacaatgg acttcactca 240ccacggacaa cctacatcta tgggcctatg cagattttga ttgggccaga gacactgatg 300gccgcaagtt cactactgca tccttctggg aacactccaa tattatcctg gagcgaaaca 360序列2tgctctgccc ctaaaatatg cattggtcaa ttgagtggat caactgccac ccaactaact 60aactgatcag tcggtgccaa ttatagtttt aaactgaatt aaagagcatg tgttaaatac 120taacacatga ttaaagccat ccacctctat agttggagag atctagggaa aagttactgg 180taaaaccatg ttgcctcgtg ggttcgagtc catcatgtaa tccacatatt ttcattttcc 240atgtccgctc ccctccacac ttctactaga agacaattag ttttcaaatt catacgcgtg 300caataagctt gtggaaagga gaagggaaat atgcacgtga gttaccatat ttttgtgatc 360cacaacatct agtaaatatt tttcctccaa tggaagcaaa gaagttgcaa acatttttta 420tccaaccaat atgattgagg gaaaggagtg caaatctgac aacaatttgc aaattctgct 480tagcatttga tatgtgcata atgccctaga gttgtatcac gcctccgcat attatggata 540attgtcatcc acatccatta aactaatatt tacaaaaaat attcaaatta cttgatttta 600catatccaat atttcgtata tttttttaat atcaaatact tttagtaatg ttttgtaatt 660atcctaattt taataggaat gaatcataaa tcaagacatc tgatgaacat tgtcacaaat 720ctaagcactc tatataactc aaacccaccc tagcatacta tgcatagaat ttatgttcag 780ggcagagcaa790。
2.一種如權利要求1所述的與天麻特性及天麻素含量相關的特異DNA分子標記序列的應用，其特征在于該特異DNA序列1用于天麻真?zhèn)舞b別和相似物種鑒定的方法為根據(jù)其兩端核苷酸序列設計的一對引物上游序列 5′-catagccatccaaatctgcaaa-3′下游序列 5′-aggataatattggagtgttccc-3′用該引物擴增各種新鮮或干制天麻基因組DNA樣本，得到340bp特異擴增條帶，有該特異擴增條帶的為真天麻樣本；特異DNA序列2用于天麻品種選優(yōu)與鑒定的方法為根據(jù)其兩端核苷酸序列設計的一對引物上游序列是 5′-ctaaaatatgcattggtcaatt-3′下游序列是 5′-tgaacataaattctatgcatag-3′用該引物擴增各種天麻樣本，有770bp特異擴增條帶的為天麻素含量高的天麻品種。
全文摘要
本發(fā)明涉及天麻的特異DNA序列。它們的長度DNA序列1為360bp，DNA序列2為790bp；根據(jù)DNA序列的兩端核苷酸序列設計的引物擴增各種天麻樣本，以特異擴增條帶鑒別各種天麻樣本。本發(fā)明應用隨機引物和PCR技術從不同天麻品種擴增得到天麻共有和特有DNA序列；應用DNA重組技術對得到的DNA序列進行克隆和鑒定，測序與拼接，基因庫搜索，確定為新發(fā)現(xiàn)的DNA序列，根據(jù)該序列的兩端核苷酸設計引物，運用PCR技術擴增不同天麻樣本基因組DNA，驗證為特異DNA分子標記?；诓煌炻槠贩N共有的特異DNA分子標記和與天麻素含量相關的DNA分子標記，用于天麻真?zhèn)舞b別、品種選育、基因分型與品種鑒定等，為充分開發(fā)天麻資源提供了技術。
文檔編號C12N15/29GK1657623SQ20051003134
公開日2005年8月24日 申請日期2005年3月21日 優(yōu)先權日2005年3月21日
發(fā)明者陶鈞, 羅志勇, 陶垚, 胡維新, 劉水平 申請人:長沙理工大學