專利名稱：一種黑曲霉脂肪酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及脂肪酶及其制備方法，尤其是微生物脂肪酶及其制備方法。
背景技術(shù)：
近年對微生物脂肪酶的研究顯著增加，因?yàn)槲⑸镏久冈谑称饭I(yè)、面粉工業(yè)、洗滌工業(yè)、制藥工業(yè)、紡織工業(yè)、飼料工業(yè)、生物化工工業(yè)及環(huán)保工業(yè)等工業(yè)中已被廣泛采用，其應(yīng)用發(fā)展空間相當(dāng)廣闊。目前，國內(nèi)外已報道的微生物脂肪酶產(chǎn)生菌已多達(dá)65個屬，其中細(xì)菌，28個屬；絲狀真菌，23個屬；酵母菌，10個屬；放線菌，4個屬。絲狀真菌在細(xì)胞外分泌酶，是一種優(yōu)異的脂肪酶生產(chǎn)菌種。目前所知產(chǎn)酶能力最強(qiáng)的菌株主要集中在根霉(Rhizopas)、曲霉(Aspergillus)、青霉(Penicillium)、毛霉(Mucor)、須霉(Phycomyces)等屬種。由黑曲霉(Aspergillus niger)制備作用最適pH值活性范圍在4.5-5.5的脂肪酶曾有報道[Torossian K.and Bell A.W.(1991)Biotechnol.Appl.Biochem.13，205-211]。美國專利US6534303公開了一種制備黑曲霉脂肪酶的方法，所制得酶的作用最適pH值范圍在2.0-3.0。這兩種方法所制得的黑曲霉脂肪酶的作用最適pH值范圍窄，且在堿性條件下不穩(wěn)定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種最適作用pH值范圍寬且能在寬的pH值范圍內(nèi)穩(wěn)定的黑曲霉脂肪酶及其制備方法。
本發(fā)明的黑曲霉脂肪酶采用黑曲霉(Aspergillns niger)單一菌株S-7749制備，菌株S-7749由篩選出的原始黑曲霉單一菌株(Aspergillns niger S-8341)經(jīng)誘變育種得到。菌株S-7749已于2005年3月23日在中國微生物菌種保存管理委員會普通微生物中心(CGMCC)進(jìn)行了保藏，保藏中心地址為北京市中關(guān)村中國科學(xué)院微生物所內(nèi)，郵政編碼為100080，保藏編號為CGMCC No.1334。
菌株S-7749經(jīng)種子制備，發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵液經(jīng)超濾，在酶保護(hù)劑作用下，通過噴霧干燥，獲得產(chǎn)品。
本發(fā)明所使用的黑曲霉為國家衛(wèi)生部和FDA公布的食品安全菌株，發(fā)酵培養(yǎng)基來源廣泛成本低，工藝簡單，所制得的黑曲霉脂肪酶活性高，適用pH值范圍寬，用途廣泛。


圖1為黑曲霉脂肪酶的制備過程框2為菌株S-7749的的誘變系譜。
圖3為本發(fā)明的黑曲霉脂肪酶作用的最適pH值及對pH值的穩(wěn)定性。
圖4為本發(fā)明的黑曲霉脂肪酶作用的最適溫度和對熱穩(wěn)定性。
具體實(shí)施例方式
菌種的篩選與誘變從榕樹土壤中分離篩選得到原始黑曲霉單一菌株(Aspergillns niger S-8341)，菌株S-8341在紫外線或紫外線與氯化鋰作誘變劑條件下，經(jīng)7代誘變獲得本發(fā)明所使用的生產(chǎn)菌株S-7749。菌株S-7749經(jīng)中國科學(xué)院微生物所鑒定為黑曲霉(Aspergillns niger)，并已于2005年3月23日在中國中國微生物菌種保存管理委員會普通微生物中心(CGMCC)進(jìn)行了保藏，保藏中心地址為北京市中關(guān)村中國科學(xué)院微生物所內(nèi)，郵政編碼為100080，保藏編號為CGMCC No.1334。
菌種的種子制備菌株S-7749在25℃-27℃溫度下，將培養(yǎng)好的馬鈴薯斜面種子擴(kuò)大到馬鈴薯培養(yǎng)基的茄子瓶中培養(yǎng)，然后，再擴(kuò)大到馬鈴薯培養(yǎng)基的K氏瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)時間均為80-120小時。
發(fā)酵包括一級種子罐發(fā)酵、二級種子罐發(fā)酵和發(fā)酵罐發(fā)酵，一級種子罐發(fā)酵和二級種子罐發(fā)酵的培養(yǎng)基2.6％的黃豆餅粉、0.5％的玉米淀粉、0.5％的硝酸鈉、0.05％的檸檬酸鈉和0.05％的硫酸鎂，培養(yǎng)基pH值為6.3-6.4。發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基6.0％的黃豆餅粉、0.4％玉米淀粉、0.2％的硝酸鈉、0.4％的磷酸氫鉀、0.2％的碳酸鈣、0.02％的硫酸鎂、0.1％的檸檬酸鈉，培養(yǎng)基pH值6.5-6.8。一級種子罐發(fā)酵溫度為25℃-27℃，發(fā)酵過程中空氣通氣量1∶1V/V，培養(yǎng)周期16-18小時。二級種子罐發(fā)酵溫度為25℃-27℃，發(fā)酵過程中空氣通氣量1∶1V/V，培養(yǎng)周期8-10小時，發(fā)酵罐發(fā)酵溫度為24℃-25℃，過程中空氣通氣量在1∶1.2-1∶1.6范圍內(nèi)分階段增大，保持罐壓0.1Mpa，發(fā)酵周期42-44小時。
后處理發(fā)酵結(jié)束后，過濾發(fā)酵液，固液分離，濾液超濾濃縮，分子量截留＜30Kda，加入本領(lǐng)域常用的保護(hù)劑及激活劑，噴霧干燥得到成品。
酶活測定以三丁酸甘油酯為底物，采用本領(lǐng)域常用的方法測定發(fā)酵液的發(fā)酵酶活。在一溫度36℃和pH9.4條件下，水解甘油三丁酯每分鐘生成1μmol脂肪酸的酶量，即為一個單位，以U/ml或者U/g表示。
以下將結(jié)合具體的實(shí)施例對本發(fā)明的方法進(jìn)行更具體的描述，但本發(fā)明并不限于具體實(shí)施例。
例1菌種黑曲霉菌株S-7749
菌種的種子制備菌株S-7749在27℃溫度下，將馬鈴薯斜面種子擴(kuò)大到茄子瓶中培養(yǎng)，再擴(kuò)大到K氏瓶中培養(yǎng)，每步培養(yǎng)時間皆為100小時。
發(fā)酵1)一級種子罐發(fā)酵培養(yǎng)基(％)黃豆餅粉2.6玉米淀粉0.5NaNo30.5檸檬酸鈉0.08MgSo40.04接種方法孢子接種法培養(yǎng)條件溫度 26℃通氣量1∶1V/VPH6.3-6.4培養(yǎng)周期 17小時2)二級種子罐發(fā)酵培養(yǎng)基(％)同一級種子罐發(fā)酵接種方法壓差移種法培養(yǎng)條件溫度 26℃通氣量1∶1V/VpH值 6.3-6.4
培養(yǎng)周期9小時3)發(fā)酵工藝培養(yǎng)基(％)黃豆餅粉6.0玉米淀粉0.4NaNo30.2K2HPO40.4CaCo30.2MgSo40.02檸檬酸鈉0.1PH 6.5-6.8種子移種量 15接種方法壓差移種法培養(yǎng)條件pH控制 6.8-7.8溫度24℃發(fā)酵周期43小時通氣量發(fā)酵開始空氣通氣量為控制為1∶1.2V/V，發(fā)酵16小時后增加為1∶1.4V/V，發(fā)酵32小時后增加為1∶1.6V/V。
發(fā)酵過程中保持罐壓0.1MPa。
發(fā)酵結(jié)束將發(fā)酵液體用40目濾布板框過濾，濾液經(jīng)5m3和1m3袋濾后，再用2萬分子量的中空纖維超濾膜超濾，分子量截留＜30Kda，超濾濃液加酶穩(wěn)定劑和激活劑，經(jīng)壓力式噴霧干燥，得成品，水份＜6％。
測定酶活測定發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵結(jié)束后液體的酶活為3478U/ml。
例2跟例1相似，不同之處在于菌種的種子制備過程中溫度為26℃，茄子瓶及K氏瓶中培養(yǎng)時間皆為120小時；一級種子罐中發(fā)酵溫度為27℃，培養(yǎng)周期為18小時；二級種子罐中發(fā)酵溫度為27℃，培養(yǎng)周期為10小時，發(fā)酵罐中發(fā)酵溫度為25℃，發(fā)酵周期為44小時；發(fā)酵開始空氣通氣量為控制為1∶1.2V/V，發(fā)酵18小時后增加為1∶1.4V/V，發(fā)酵35小時后增加為1∶1.6V/V。
測定發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵結(jié)束后液體的酶活為3216U/ml。
例3跟例1相似，不同之處在于菌種的種子制備過程中溫度為25℃，茄子瓶及K氏瓶中培養(yǎng)時間皆為80小時；一級種子罐中發(fā)酵溫度為25℃，培養(yǎng)周期為16小時；二級種子罐中發(fā)酵溫度為25℃，培養(yǎng)周期為8小時，發(fā)酵罐中發(fā)酵溫度為25℃，發(fā)酵周期為42小時；發(fā)酵開始空氣通氣量為控制為1∶1.2V/V，發(fā)酵15小時后增加為1∶1.4V/V，發(fā)酵30小時后增加為1∶1.6V/V。
測定發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵結(jié)束后液體的酶活為3016U/ml。
例4以三丁酸甘油酯為底物用領(lǐng)域內(nèi)常規(guī)的方法檢測pH值對例1制得的黑曲霉脂肪酶活性的影響，表明所產(chǎn)酶作用最適pH在6.5-8.0，不但在堿性區(qū)域保持較高的酶活力，而在酸性區(qū)域也保持有相當(dāng)?shù)拿富盍Γ哂袕V闊的pH作用范圍，其pH穩(wěn)定范圍在5.8-12.0，用途廣泛。檢測結(jié)果見圖3。
例5以三丁酶甘油酯為底物用領(lǐng)域內(nèi)常規(guī)的方法檢測例1制得的黑曲霉脂肪酶作用的最適溫度及熱穩(wěn)定性，檢測表明所制得的酶的最適作用溫度為25℃-35℃；超過40℃，酶活力開始明顯下降，而低于20℃，仍具有較好的酶活力，該酶屬于中溫偏低溫酶，對熱穩(wěn)定性稍差。檢測結(jié)果參見圖4。
例6將例1中得到的黑曲霉脂肪酶經(jīng)還原處理后，跟標(biāo)準(zhǔn)蛋白一起進(jìn)行SDS-GAPE.，用各標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量的對數(shù)(縱坐標(biāo))和相遷移率(橫坐標(biāo))畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出該脂肪酶的相對遷移率為0.509，由標(biāo)準(zhǔn)曲線再求出該堿性脂肪酶的分子量為29.2Kda.
例7用氨基酸序列測定儀測定例1制得的黑曲霉脂肪酶的N端氨基酸序列為ATADAAAFPDLHRAAKLSSA。
例8在日本廣島大學(xué)生物生產(chǎn)學(xué)部實(shí)驗(yàn)室采用專用酯鍵位置特異性測定儀測定例1制得的黑曲霉脂肪酶作用酯鍵位置特異性是一種水解Sn-1和Sn-3位置脂肪酶，適宜于食品用酶。
權(quán)利要求
1.一種黑曲霉脂肪酶，其酶學(xué)特性為以三丁酸甘油酯為底物，酶作用的最適pH值范圍為6.5-8.0，在pH值5.8-12.0范圍內(nèi)穩(wěn)定；以三丁酸甘油酯為底物，酶作用的最適溫度在25℃-35℃，熱穩(wěn)定溫度低于40℃；酶的分子量為29.2Kda；酶N端氨基酸序列為ATADAAAFPDLHRAAKLSSA；酶作用酯鍵位置特異性是一種水解Sn-1和Sn-3位置脂肪酶。
2.一種黑曲霉脂肪酶的制備方法，主要包括菌株的篩選與誘變育種、菌種的種子制備、發(fā)酵及后處理，其特征在于所使用的菌種是黑曲霉(Aspergillns niger)單一菌株S-7749。
3.權(quán)利要求2所述的黑曲霉脂肪酶制備方法，其中菌種的種子制備包括斜面種子的茄子瓶培養(yǎng)和斜面種子的K氏瓶培養(yǎng)，每步培養(yǎng)時間皆為80-120小時，培養(yǎng)溫度為25℃-27℃。
4.權(quán)利要求3所述的黑曲霉脂肪酶制備方法，其中的培養(yǎng)時間皆為100小時，培養(yǎng)溫度為27℃。
5.權(quán)利要求2或3所述的黑曲霉脂肪酶制備方法，其中發(fā)酵過程包括一級種子罐發(fā)酵、二級種子罐發(fā)酵和發(fā)酵罐發(fā)酵。
6.權(quán)利要求5所述的黑曲霉脂肪酶制備方法，其中一級種子罐發(fā)酵的培養(yǎng)基為2.6％的黃豆餅粉、0.5％的玉米淀粉、0.5％的硝酸鈉、0.08％的檸檬酸鈉和0.04％的硫酸鎂，培養(yǎng)基pH值為6.3-6.4，溫度為25℃-27℃，空氣通量為1∶1v/v，培養(yǎng)周期為16-18小時；二級種子罐發(fā)酵的培養(yǎng)基、pH值、溫度及空氣通量同一級種子罐發(fā)酵，培養(yǎng)周期為8-10小時；發(fā)酵罐發(fā)酵的培養(yǎng)基為6.0％的黃豆餅粉、0.4％的玉米淀粉、0.2％的硝酸鈉、0.4％的磷酸氫二鉀、0.2％的碳酸鈣、0.02％的硫酸鎂和0.1％的檸檬酸鈉，培養(yǎng)基pH值為6.5-6.8，溫度24℃-25℃，空氣通量分階段在1∶1.2-1∶1.6V/V范圍內(nèi)增大，發(fā)酵周期42-44小時。
7.權(quán)利要求6所述的黑曲霉脂肪酶制備方法，其中發(fā)酵罐中發(fā)酵過程中空氣通量根據(jù)發(fā)酵進(jìn)行的時間分階段增大，發(fā)酵開始空氣通量為1∶1.2V/V，發(fā)酵15-18小時后空氣通量增加為1∶1.4V/V，發(fā)酵30-35小時后空氣通量增加為1∶1.6V/V。
8.權(quán)利要求6所述的黑曲霉脂肪酶制備方法，其中一級種子罐發(fā)酵溫度為26℃，培養(yǎng)周期為17小時；二級種子罐發(fā)酵溫度為26℃，培養(yǎng)周期為9小時；發(fā)酵罐發(fā)酵溫度為24℃，發(fā)酵周期為43小時。
9.權(quán)利要求6所述的黑曲霉脂肪酶制備方法，其中發(fā)酵過程保持罐壓為0.1Mpa。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及黑曲霉脂肪酶及其制備方法。從自然界中分離篩選出黑曲霉(Aspergillus niger)野生型菌株S－8341，采用工業(yè)微生物誘變育種得到優(yōu)良的生產(chǎn)菌株S－7749，該菌株經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)和低溫高氧發(fā)酵工藝制得黑曲霉脂肪酶。所制得黑曲霉脂肪酶的酶學(xué)特性酶作用的最適pH值范圍為6.5－8.0，在pH值5.8－12.0范圍內(nèi)穩(wěn)定；酶作用的最適溫度為25℃－35℃，熱穩(wěn)定溫度低于40℃；酶的分子量為29.2Kda；酶N端氨基酸序列為ATADAAAFPDLHRAAKLSSA；酶作用酯鍵位置特異性是一種水解Sn－1和Sn－3位置脂肪酶。本發(fā)明的制備方法簡單、成本低，所制得的黑曲霉脂肪酶活性高、作用pH值范圍寬，用途廣泛。
文檔編號C12N1/14GK1730653SQ200510035099
公開日2006年2月8日 申請日期2005年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月2日
發(fā)明者吳松剛, 施巧琴, 王劍英, 張清輝, 趙燕玉 申請人:深圳市綠微康生物工程有限公司