專利名稱：制備人淋巴細(xì)胞模擬物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來(lái)自動(dòng)物的血紅細(xì)胞醫(yī)用配制技術(shù)，特別是涉及利用動(dòng)物的血紅細(xì)胞制備人淋巴細(xì)胞模擬物的技術(shù)。
背景技術(shù)：
人外周白細(xì)胞主要由淋巴、單核、粒細(xì)胞3群細(xì)胞組成，他們?cè)隗w積上是一個(gè)連續(xù)分布的整體，其測(cè)試主要通過(guò)血液細(xì)胞分析儀進(jìn)行，細(xì)胞在儀器測(cè)試的分布情況如圖1所示。為了保證測(cè)試儀器的準(zhǔn)確，需要制造長(zhǎng)期穩(wěn)定的質(zhì)控和校準(zhǔn)物對(duì)測(cè)試儀器進(jìn)行質(zhì)量控制和校準(zhǔn)維護(hù)。在多參數(shù)的質(zhì)控物中，含有一定的大小的細(xì)胞粒子，稱為人細(xì)胞模擬物或類細(xì)胞。這些粒子一般為塑膠粒子或固定后的動(dòng)物紅細(xì)胞粒子。美國(guó)專利US3541137、US4179398、US4264470、US4704364等描述了3分群血液細(xì)胞分析儀質(zhì)控的白細(xì)胞和血小板研制方法，其中人粒細(xì)胞模擬物可以從爬行類、魚類紅細(xì)胞經(jīng)過(guò)固定后獲得；人單核細(xì)胞模擬物使用火雞紅細(xì)胞固定處理后獲得；淋巴細(xì)胞模擬物由人或其他哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞處理后獲得，而血小板模擬物使用山羊紅細(xì)胞處理后獲得等等。
人淋巴細(xì)胞分布具有兩個(gè)特點(diǎn)一是體積小，二是分布窄?，F(xiàn)有人淋巴細(xì)胞模擬物存在一定的不足使用塑膠粒子成本比較高，分布范圍比較寬，不適合降低臨床工作的成本，廣泛應(yīng)用受到限制；而使用動(dòng)物源的固定紅細(xì)胞粒子一般不容易使其處于人淋巴細(xì)胞正常分布范圍，其中重要的一個(gè)因素就是由于淋巴細(xì)胞體積小，處于血液細(xì)胞分析儀的白細(xì)胞測(cè)定域值附近，如果其分布不佳，會(huì)導(dǎo)致白細(xì)胞測(cè)定出現(xiàn)較大誤差，所以容易產(chǎn)生數(shù)據(jù)變異較大而使質(zhì)控失敗，或產(chǎn)生無(wú)意義的報(bào)警信息。為了盡量縮小淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)誤差，一個(gè)很好的方法就是增加血液細(xì)胞分析儀測(cè)定的淋巴細(xì)胞中央分布區(qū)域的細(xì)胞數(shù)量，這樣就會(huì)在儀器測(cè)定的淋巴細(xì)胞分布的最左側(cè)區(qū)域(最小的淋巴細(xì)胞區(qū)域)出現(xiàn)小的上升沿臺(tái)階，由于這部分細(xì)胞在整個(gè)白細(xì)胞分布中所占比例非常微小，儀器域值變化對(duì)白細(xì)胞計(jì)數(shù)影響也就非常小，因而進(jìn)一步提高了質(zhì)控的穩(wěn)定性。但是，使用人紅細(xì)胞或其他哺乳動(dòng)物來(lái)源的紅細(xì)胞不容易達(dá)到以上要求，儀器測(cè)定的淋巴細(xì)胞分布缺乏小的上升沿，容易出現(xiàn)細(xì)胞碎片報(bào)警信息，也不容易提高計(jì)數(shù)穩(wěn)定性。而且在混合白細(xì)胞粒子中，淋巴細(xì)胞的分布過(guò)寬也會(huì)將單核區(qū)域細(xì)胞掩蓋，因?yàn)閱魏说臄?shù)量很少，儀器測(cè)定的淋巴細(xì)胞分布右側(cè)細(xì)胞多時(shí)就會(huì)明顯影響單核細(xì)胞的分布曲線。這些變化如圖2所示圖2-1中的I1部分曲線顯示小淋巴粒子處于儀器測(cè)定域值附近，圖2-2中的I2部分曲線顯示大淋巴粒子影響單核區(qū)細(xì)胞的分布曲線，圖中R2為報(bào)警信息。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于避免上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提出一種制備人淋巴細(xì)胞模擬物的方法，解決淋巴細(xì)胞模擬物的體積大小問(wèn)題和儀器測(cè)定的淋巴細(xì)胞分布問(wèn)題，使人淋巴細(xì)胞模擬物的體積長(zhǎng)期保持穩(wěn)定。
本發(fā)明解決所述技術(shù)問(wèn)題可以通過(guò)采用以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)提出一種制備人淋巴細(xì)胞模擬物的方法，取得動(dòng)物紅細(xì)胞后，將所述紅細(xì)胞進(jìn)行體積固定處理；所述紅細(xì)胞是有核紅細(xì)胞，將該有核紅細(xì)胞進(jìn)行體積固定處理時(shí)，通過(guò)滲透壓調(diào)節(jié)所述有核紅細(xì)胞的體積使其處于人淋巴細(xì)胞正常分布范圍；將有核紅細(xì)胞體積調(diào)小時(shí)所述滲透壓值高于該有核紅細(xì)胞的生理滲透壓值，將有核紅細(xì)胞體積調(diào)大時(shí)所述滲透壓值低于該有核紅細(xì)胞的生理滲透壓值。
經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，使用含細(xì)胞核的紅細(xì)胞的分布具有良好的前上升沿，而且分布比人或其他哺乳動(dòng)物窄，可以更好模擬淋巴細(xì)胞的形態(tài)，這類紅細(xì)胞如禽、鳥類紅細(xì)胞。但這類紅細(xì)胞體積大小和人淋巴差異明顯，所以必須考慮將細(xì)胞體積調(diào)節(jié)到人淋巴細(xì)胞范圍。
使用滲透壓可以有效解決這個(gè)問(wèn)題。使用低滲透壓可以使細(xì)胞體積漲大，使用高滲透壓可以使細(xì)胞體積縮小，再配合固定試劑作用，這樣處理后的細(xì)胞粒子體積在儀器試劑作用下符合人淋巴細(xì)胞體積區(qū)域，而且保持了動(dòng)物有核紅細(xì)胞的分布特征。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的技術(shù)效果在于1、被處理的紅細(xì)胞分布良好，小粒子所占比例少，而且穩(wěn)定性強(qiáng)，不容易產(chǎn)生異常報(bào)警信息，滿足質(zhì)量控制要求；2、樣本來(lái)源豐富而且沒(méi)有限制，成本低廉。


圖1是正常人外周血液白細(xì)胞測(cè)試分布情況示意圖；圖2是現(xiàn)有技術(shù)中人外周白細(xì)胞測(cè)試分布情況由于淋巴細(xì)胞體積變化引起變化的示意圖，其中圖2-1著重示意出測(cè)試分布的左側(cè)變化，圖中的I1部分曲線顯示小淋巴粒子處于儀器測(cè)定域值附近；圖2-2著重示意出測(cè)試分布的右側(cè)變化，圖中的I2部分曲線顯示大淋巴粒子影響單核區(qū)細(xì)胞的分布曲線；圖3是禽類紅細(xì)胞使用滲透壓調(diào)節(jié)固定的測(cè)試分布差異情況示意圖，其中圖3-1是未經(jīng)滲透壓調(diào)節(jié)直接固定禽類紅細(xì)胞體積的測(cè)試分布情況示意圖，圖3-2是經(jīng)滲透壓調(diào)節(jié)固定禽類紅細(xì)胞體積的測(cè)試分布情況示意圖。
圖中，橫坐標(biāo)單位為細(xì)胞體積單位飛升(f1)，縱坐標(biāo)單位為細(xì)胞數(shù)量單位；R2為報(bào)警信息。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合附圖所示之最佳實(shí)施例作進(jìn)一步詳述。
采用動(dòng)物細(xì)胞固定后模擬人白細(xì)胞已經(jīng)有多年歷史，但由于動(dòng)物紅細(xì)胞不容易符合人細(xì)胞的正常分布，所以對(duì)細(xì)胞模擬物的處理和保存提出了很高要求。即使這樣，目前也缺乏非常穩(wěn)定不變的紅細(xì)胞源性的細(xì)胞模擬物。
人淋巴細(xì)胞使外周血液中最小的一群細(xì)胞，其小細(xì)胞群體測(cè)定處于儀器測(cè)定域值附近，如果這部分細(xì)胞很多，就會(huì)帶來(lái)白細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果的較大變化。所以對(duì)于儀器質(zhì)量控制產(chǎn)品提出了更高的要求。就是要盡量縮小這部分淋巴細(xì)胞在整個(gè)白細(xì)胞粒子中的數(shù)量。同樣為了減少對(duì)單核區(qū)域細(xì)胞的分布影響，必須同時(shí)盡量減少右側(cè)大淋巴細(xì)胞粒子的數(shù)量，否則單核區(qū)細(xì)胞分布情況變差，容易出現(xiàn)報(bào)警信息。上面兩點(diǎn)要求淋巴細(xì)胞模擬物必須盡量增加中央細(xì)胞的比率。人淋巴細(xì)胞分布比較窄，使用人或其他哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞加工不容易滿足要求。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，含細(xì)胞核的動(dòng)物紅細(xì)胞如禽類或鳥類的紅細(xì)胞分布就比較窄，但體積大小往往偏離人淋巴細(xì)胞體積范圍，此時(shí)使用滲透壓控制調(diào)節(jié)該類動(dòng)物紅細(xì)胞的體積范圍，結(jié)合固定計(jì)數(shù)就可以制造比較好的淋巴細(xì)胞模擬物。
本發(fā)明制備人淋巴細(xì)胞模擬物的方法，是在取得動(dòng)物紅細(xì)胞后，將所述紅細(xì)胞進(jìn)行固定處理；所述紅細(xì)胞是有核紅細(xì)胞，將該有核紅細(xì)胞進(jìn)行體積固定處理時(shí)，通過(guò)調(diào)節(jié)滲透壓使所述有核紅細(xì)胞的體積處于人淋巴細(xì)胞正常分布范圍；將有核紅細(xì)胞體積調(diào)小時(shí)所述滲透壓值高于該有核紅細(xì)胞的生理滲透壓值，將有核紅細(xì)胞體積調(diào)大時(shí)所述滲透壓值低于該有核紅細(xì)胞的生理滲透壓值。通過(guò)試驗(yàn)證明，將有核紅細(xì)胞體積調(diào)小時(shí)，一般來(lái)說(shuō)，滲透壓值須高于350mOsm/kgH2O，由于在高滲透壓條件下細(xì)胞不會(huì)受損，因而高滲透壓值在理論上沒(méi)有上限；而將有核紅細(xì)胞體積調(diào)大時(shí)，一般來(lái)說(shuō)，滲透壓值低于250mOsm/kgH2O，低滲透壓值的下限高于細(xì)胞明顯破裂的臨界滲透壓值即可，對(duì)于不同的動(dòng)物細(xì)胞該臨界滲透壓值不同，但該臨界滲透壓值可以通過(guò)簡(jiǎn)單的試驗(yàn)即可確定，如觀察細(xì)胞是否破裂釋放出內(nèi)容物。對(duì)應(yīng)每一種具體動(dòng)物紅細(xì)胞選定滲透壓時(shí)，首先，根據(jù)細(xì)胞需要調(diào)大還是調(diào)小來(lái)確定選擇低滲透壓還是高滲透壓；然后，從需要調(diào)節(jié)的細(xì)胞生理滲透壓值起，降低或加大滲透壓值，直至得到能將細(xì)胞體積調(diào)節(jié)到處于人淋巴細(xì)胞正常分布范圍的具體滲透壓值。
用滲透壓調(diào)控制備人淋巴細(xì)胞模擬物的方法具體步驟如下1、配制試劑。
抗凝劑生理鹽水加入1％的乙二胺四乙酸二鈉(EDTA2鈉鹽)；基礎(chǔ)試劑1-5g聚乙二醇(PEG)1～5g葡萄糖0.5-5g檸檬酸鈉0.1～2g青霉素0.1-2g鏈霉素
0.5-5g硫柳汞1～9g 氯化鈉將上述成份加入蒸餾水配制為1L，使用氯化鈉調(diào)節(jié)滲透壓到300mOsm/kgH2O(人正常滲透壓為300mOsm/kgH2O)，可以使用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)試劑ph范圍。
固定試劑1在基礎(chǔ)試劑中加入氯化鈉，將滲透壓調(diào)節(jié)到所需滲透壓值；動(dòng)物紅細(xì)胞不同所需滲透壓值不同，各種動(dòng)物細(xì)胞所需滲透壓值可以通過(guò)一般試驗(yàn)得出。如經(jīng)過(guò)試驗(yàn)證明，對(duì)于三皇雞紅細(xì)胞，所需滲透壓值為600mOsm/kgH2O，即在600mOsm/kgH2O這個(gè)數(shù)值下，三皇雞紅細(xì)胞體積可以縮小到處于人淋巴細(xì)胞正常分布范圍。
固定試劑2濃度大于5％甲醛溶液，實(shí)際操作中可選用市售的37％甲醛溶液。
2、處理過(guò)程(1)從禽類或鳥類動(dòng)物取血，如三皇雞，并將取得的動(dòng)物血液使用抗凝劑抗凝；(2)使用基礎(chǔ)試劑對(duì)抗凝后的血液進(jìn)行離心洗滌1～3次，去掉上清中的血漿蛋白成分?？梢詫⒍鄠€(gè)樣本進(jìn)行混合以增加處理樣本總量，再次離心濃縮；(3)去掉上清液，使用固定試劑1懸浮經(jīng)過(guò)離心處理后的紅細(xì)胞，加入的固定試劑1體積大于經(jīng)過(guò)離心后的紅細(xì)胞體積；(4)樣本靜置10-30分鐘；(5)加入固定試劑2，直至甲醛終濃度為2-5％，靜置固定30分鐘以上時(shí)間；(6)使用基礎(chǔ)試劑或者生理鹽水充分離心洗滌去掉甲醛，靜置沉淀紅細(xì)胞，得到人淋巴細(xì)胞模擬物。
使用本發(fā)明方法處理后的禽類細(xì)胞體積縮小情況如圖3所示，圖3-1是未經(jīng)滲透壓調(diào)節(jié)直接固定禽類紅細(xì)胞體積的測(cè)試分布情況示意圖，圖3-2是經(jīng)滲透壓調(diào)節(jié)固定禽類紅細(xì)胞體積的測(cè)試分布情況示意圖。兩兩比較圖3-2、圖3-1和圖1，明顯可以看出，經(jīng)滲透壓調(diào)節(jié)固定的禽類紅細(xì)胞體積分布已經(jīng)處于人淋巴細(xì)胞正常分布范圍。而且，洗滌保存后的處理細(xì)胞穩(wěn)定期長(zhǎng)，不含固定試劑，不會(huì)被試劑中的表面活性劑溶解，可以與其他粒子配合形成多參數(shù)質(zhì)控產(chǎn)品。
權(quán)利要求
1.一種制備人淋巴細(xì)胞模擬物的方法，取得動(dòng)物紅細(xì)胞后，將所述紅細(xì)胞進(jìn)行固定處理；其特征在于所述紅細(xì)胞是有核紅細(xì)胞，將該有核紅細(xì)胞進(jìn)行體積固定處理時(shí)，通過(guò)調(diào)節(jié)滲透壓使所述有核紅細(xì)胞的體積處于人淋巴細(xì)胞正常分布范圍；將有核紅細(xì)胞體積調(diào)小時(shí)所述滲透壓值高于該有核紅細(xì)胞的生理滲透壓值，將有核紅細(xì)胞體積調(diào)大時(shí)所述滲透壓值低于該有核紅細(xì)胞的生理滲透壓值。
2.如權(quán)利要求1所述的制備人淋巴細(xì)胞模擬物的方法，其特征在于取得動(dòng)物有核紅細(xì)胞，用滲透壓調(diào)控技術(shù)制備人淋巴模擬物具體包括以下步驟下述基礎(chǔ)試劑是指1～5g聚乙二醇、1～5g葡萄糖、0.5～5g檸檬酸鈉、0.1～2g青霉素、0.1～2g鏈霉素、0.5～5g硫柳汞和1～9g氯化鈉，使用蒸餾水配制為1L，使用氯化鈉調(diào)節(jié)滲透壓到人正常滲透壓水平；下述固定試劑1是指在基礎(chǔ)試劑中加入氯化鈉，將滲透壓調(diào)節(jié)到所需滲透壓值；下述固定試劑2是指甲醛溶液；①將取得的動(dòng)物血液使用抗凝劑抗凝；使用基礎(chǔ)試劑對(duì)抗凝后的血液進(jìn)行離心洗滌，去掉上清中的血漿蛋白成分；②去掉上清液，使用固定試劑1懸浮離心處理過(guò)的紅細(xì)胞，靜置10～30分鐘；③加入固定試劑2，甲醛最終濃度為2～5％，靜置超過(guò)30分鐘；④使用基礎(chǔ)試劑或者生理鹽水充分離心洗滌去掉甲醛，靜置沉淀，得到人淋巴細(xì)胞模擬物。
3.如權(quán)利要求2所述的制備人淋巴細(xì)胞模擬物的方法，其特征在于所述抗凝劑是指生理鹽水加入1％的乙二胺四乙酸二鈉。
4.如權(quán)利要求2所述的制備人淋巴細(xì)胞模擬物的方法，其特征在于所述固定試劑2采用市售的濃度為37％的甲醛溶液。
5.如權(quán)利要求1或2所述的制備人淋巴細(xì)胞模擬物的方法，其特征在于所述有核紅細(xì)胞從禽類或鳥類動(dòng)物取得。
6.如權(quán)利要求2所述的制備人淋巴細(xì)胞模擬物的方法，其特征在于所述有核紅細(xì)胞從三皇雞中取得。
7.如權(quán)利要求6所述的制備人淋巴細(xì)胞模擬物的方法，其特征在于所述固定試劑1的滲透壓值調(diào)節(jié)到600mOsm/kgH2O。
8.如權(quán)利要求1所述的制備人淋巴細(xì)胞模擬物的方法，其特征在于將有核紅細(xì)胞體積調(diào)小時(shí)所述滲透壓值高于350mOsm/kgH2O，將有核紅細(xì)胞體積調(diào)大時(shí)所述滲透壓值低于250mOsm/kgH2O。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備人淋巴細(xì)胞模擬物的方法，取得動(dòng)物紅細(xì)胞后，將所述紅細(xì)胞的體積固定；所述紅細(xì)胞是有核紅細(xì)胞，將該有核紅細(xì)胞的體積固定時(shí)，通過(guò)調(diào)節(jié)滲透壓使所述有核紅細(xì)胞的體積處于人淋巴細(xì)胞正常分布范圍；將有核紅細(xì)胞體積調(diào)小時(shí)所述滲透壓值高于該有核紅細(xì)胞的生理滲透壓值，將有核紅細(xì)胞體積調(diào)大時(shí)所述滲透壓值低于該有核紅細(xì)胞的生理滲透壓值。本發(fā)明的技術(shù)效果在于1.被處理的紅細(xì)胞分布良好，小粒子所占比例少，而且穩(wěn)定性強(qiáng)，不容易產(chǎn)生異常報(bào)警信息，滿足質(zhì)量控制要求；2.樣本來(lái)源豐富而且沒(méi)有限制，成本低廉。
文檔編號(hào)C12N5/06GK1891816SQ200510035800
公開日2007年1月10日 申請(qǐng)日期2005年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月4日
發(fā)明者劉牧龍, 徐祖越, 張暉 申請(qǐng)人:深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司