專利名稱：禾谷鐮孢菌抗多菌靈檢測(cè)基因及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是禾谷鐮孢菌(Fusarium graminearum，有性態(tài)Gibberella zeae)抗多菌靈的檢測(cè)基因及其檢測(cè)方法，屬于植物病原菌抗藥性亞群體的檢測(cè)方法，專用于檢測(cè)抗多菌靈等苯并咪唑類殺菌劑的禾谷鐮孢菌。
二、技術(shù)背景小麥赤霉病是由禾谷鐮孢菌Fusarium graminearum引起的一種世界性病害，嚴(yán)重影響小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)。長(zhǎng)期以來采用苯并咪唑類殺菌劑或以這類藥劑為主的復(fù)配劑進(jìn)行化學(xué)防治。苯并咪唑類殺菌劑作為一類高效、廣譜內(nèi)吸性殺菌劑在生產(chǎn)上應(yīng)用，解決了保護(hù)性殺菌劑的環(huán)境毒性問題，提高了人類控制該病害的能力。苯并咪唑類殺菌劑包括多菌靈、苯菌靈、噻菌靈、甲基硫菌靈等。這些殺菌劑具有相同的抗菌譜和抗菌機(jī)制，它們也具有相同的抗藥性機(jī)制，相互之間存在正交互抗藥性。由于這類藥劑的高度?；裕饔梦稽c(diǎn)單一，加上施用頻率高，使用20年后許多植物病原真菌群體中就會(huì)出現(xiàn)抗藥性亞群體，使藥劑防治完全失去效果。對(duì)苯并咪唑類藥劑的殺菌機(jī)制和抗藥性機(jī)制研究表明，藥劑主要是結(jié)合在病菌的β-微管蛋白上從而阻止細(xì)胞的有絲分裂，達(dá)到抑制病菌生長(zhǎng)的目的。已有的對(duì)幾種植物病原菌的分子生物學(xué)研究表明，病菌對(duì)苯并咪唑類殺菌劑的抗藥性自然突變體主要是其β-微管蛋白196～202位氨基酸的改變，這些改變使該蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象發(fā)生改變，從而阻止了藥劑與靶標(biāo)結(jié)合，使病菌表現(xiàn)抗藥性。在人工誘變菌株中除上述位點(diǎn)外還涉及其它一些位點(diǎn)，如165,257等的氨基酸變異。通過定點(diǎn)突變也確認(rèn)了198和200位氨基酸類型與抗感性密切相關(guān)。但是禾谷鐮孢菌對(duì)多菌靈的抗藥性機(jī)制并非像其它絲狀真菌一樣由β-微管蛋白198位等氨基酸突變所致。
早期檢測(cè)病原群體中抗藥性亞群體/抗藥性基因的頻率，及早實(shí)施抗藥性治理策略，是延緩抗藥性亞群體的發(fā)展，防止抗藥性病害流行危害最有效的措施。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法需要分離培養(yǎng)病原菌，然后在含藥培養(yǎng)基上培養(yǎng)，再根據(jù)藥劑對(duì)菌絲生長(zhǎng)的效應(yīng)鑒別抗藥性。這種對(duì)藥劑的敏感性測(cè)定方法通常需要幾周時(shí)間，工作量大，測(cè)定樣本數(shù)量有限，難以早期發(fā)現(xiàn)抗藥性亞群體的存在，也不能用于當(dāng)年的抗藥性短期預(yù)測(cè)。在抗藥性機(jī)制研究基礎(chǔ)上，根據(jù)基因點(diǎn)突變的原理，應(yīng)用核酸技術(shù)如寡核苷酸-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(ASO-PCR技術(shù))等檢測(cè)病原真菌對(duì)多菌靈等苯并咪唑類殺菌劑的抗藥性，則能快速、準(zhǔn)確檢測(cè)大量樣本，使在早期檢測(cè)低頻率的抗藥性基因成為可能。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題 本發(fā)明的目的在于提供禾谷鐮孢菌抗多菌靈的檢測(cè)基因及一種快速檢測(cè)方法。現(xiàn)有研究中尚沒有用于禾谷鐮孢菌對(duì)多菌靈抗藥性監(jiān)測(cè)的基因；也沒有ASO-PCR技術(shù)用于禾谷鐮孢菌對(duì)多菌靈的抗藥性檢測(cè)。
技術(shù)方案 用于禾谷鐮孢菌對(duì)多菌靈抗藥性監(jiān)測(cè)的基因本專利發(fā)明人在已經(jīng)獲得禾谷鐮孢菌γ-，α-，α2-微管蛋白基因和微管相關(guān)蛋白基因全序列與該病原菌對(duì)多菌靈抗藥性無關(guān)，發(fā)現(xiàn)未命名微管蛋白基因發(fā)生基因突變從而導(dǎo)致該病原菌對(duì)多菌靈抗藥性，并將該未命名蛋白基因命名為β2-微管蛋白基因。
根據(jù)小麥赤霉病參考菌株NRRL31084的未命名微管蛋白全基因(基因編號(hào)FG06611.1)序列設(shè)計(jì)引物獲得了β2-微管蛋白基因全序列。β2-微管蛋白基因，長(zhǎng)度為997bp，相應(yīng)的編碼β2-微管蛋白的313個(gè)氨基酸。用于禾谷鐮孢菌對(duì)多菌靈抗藥性檢測(cè)的基因包含中抗菌株β2-微管蛋白基因編碼的第33位氨基酸的抗藥性基因突變位點(diǎn)由堿基TTT突變?yōu)閴A基TAT，由氨基酸Phe突變?yōu)榘被酺yr，基因全序列見SEQ ID NO.1?？剐跃甑摩?-微管蛋白基因還存在第64位谷氨酸密碼字GAG突變?yōu)榱涟彼崦艽a字CTG或者賴氨酸密碼字AAG和第66位苯丙氨酸TTC密碼字突變?yōu)槔野彼崦艽a字TAC的次要類型。β2-微管蛋白基因編碼33、64或66位氨基酸的密碼子發(fā)生點(diǎn)突變是導(dǎo)致禾谷鐮孢菌產(chǎn)生抗藥性的主要原因。
ASO-PCR技術(shù)用于禾谷鐮孢菌對(duì)多菌靈的抗藥性檢測(cè)提取的基因組DNA或病?？芍苯佑糜贏SO-PCR禾谷鐮孢菌對(duì)多菌靈中抗水平菌株的基因檢測(cè)，其β2-微管蛋白基因，長(zhǎng)度為997bp，相應(yīng)的編碼β2-微管蛋白的313個(gè)氨基酸，檢測(cè)基因包含中抗菌株β2-微管蛋白基因編碼的第33位氨基酸的抗藥性突變位點(diǎn)Phe(TTT)密碼字突變?yōu)門yr(TAT)密碼字，序列見SEQ ID NO.1。
待測(cè)樣品處理過程方法一將病穗上的病?；虿〗M織在無菌操作下挑至馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基上，25度條件下培養(yǎng)3-5天進(jìn)行基因組DNA提取配制提取緩沖液100mM LiCl；10mM EDTA；10mM Tris-HCl，PH8.0；10g/L SDS，蒸餾水補(bǔ)充到所需體積；配制抽提液苯酚∶氯仿∶異戊醇體積為25∶24∶1；TE緩沖液10mmol/L Tris-HCl，pH8.0；1mmol/L EDTA，pH8.0；20mg/L RNAase；基因組DNA的提取刮取在馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基生長(zhǎng)的氣生菌絲，加入1.0mL提取緩沖液和0.1～0.5g石英砂，充分研磨，60℃溫浴10min，10000rpm離心4min后，上清液用等體積上述抽提液抽提1～2次，上清液加等體積異丙醇沉淀干燥后溶于200μL TE，37℃水浴10min，取2μL用0.7g/100L的瓊脂糖電泳檢測(cè)全部有亮帶，說明已提取出該病穗的基因組DNA；紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其基因組DNA的含量，提取的基因組DNA直接用于ASO-PCR檢測(cè)。
方法二直接將長(zhǎng)有粉紅色分生孢子的病穗，輕輕挑取粉紅色部分放入0.1mL重蒸水，猛烈振蕩1min，取出病組織，將懸浮液煮沸15min，渦旋2min即可直接用于ASO-PCR檢測(cè)。即用上游引物MBCRF(5′-TCCCCGATCGCATGATGGCCACCTA-3′)MBCRR3(5′-CTTTCGCAGATCCGAGTTGAGCTGT-3′)直接用禾谷鐮孢菌的基因組DNA為模板擴(kuò)增β2-微管蛋白基因部分片段。50μL反應(yīng)體系中含100ng模板DNA或者5μL煮沸的分生孢子懸浮液，5μL 10×buffer，dNTP各0.2mmol/L，MgCl22mmol/L，引物各0.5μmol/L，TaqDNA聚合酶2U(上海Promaga公司)。反應(yīng)在PTC-100TM(MJ Research，Inc.)上進(jìn)行，反應(yīng)條件94℃ 5min； 56℃ 60s，72℃ 60s，94℃ 60s， 35個(gè)循環(huán)；72℃15min；4℃保存。取10μL PCR產(chǎn)物于1.5％(g/L)瓊脂糖TBE膠上電泳，紫外觀察照相。供試病穗100個(gè)，其中48個(gè)病穗用引物對(duì)MBCRF/MBCRR3能擴(kuò)增出281bp的條帶，為小麥赤霉病對(duì)多菌靈中抗的菌株。
同上利用上游引物MBCSF(5′-TCCCCGATCGCATGATGGCCACCTT-3′)和MBCRR3(5′-CTTTCGCAGATCCGAGTTGAGCTGT-3′)用于擴(kuò)增對(duì)多菌靈敏感的小麥赤霉病菌株。供試病穗100個(gè)，其中52個(gè)病穗用引物對(duì)MBCRF/MBCRR3能擴(kuò)增出281bp的條帶，為小麥赤霉病對(duì)多菌靈敏感的菌株。
有益效果 本發(fā)明禾谷鐮孢菌抗多菌靈檢測(cè)基因及其檢測(cè)方法，具有如下優(yōu)點(diǎn)和積極效果1、本發(fā)明是國(guó)際上首次報(bào)道的禾谷鐮孢菌的多菌靈抗藥性的檢測(cè)基因，其中包括β2-微管蛋白第33位氨基酸的突變位點(diǎn)(Phe突變?yōu)門yr)，為今后禾谷鐮孢菌的多菌靈抗藥性菌株檢測(cè)提供理論依據(jù)。
2、提供了兩種禾谷鐮孢菌的多菌靈抗藥性菌株檢測(cè)的方法。用煮沸的分生孢子懸浮液進(jìn)行ASO-PCR檢測(cè)僅需6h即可獲得結(jié)果；用基因組DNA為模板進(jìn)行ASO-PCR檢測(cè)則要經(jīng)過采集病穗、室內(nèi)分離培養(yǎng)4天、PS液體培養(yǎng)基(馬鈴薯200g，蔗糖20g，水1000mL)培養(yǎng)至少5天獲得菌絲方可獲得檢測(cè)結(jié)果。
3、目前國(guó)內(nèi)其他研究單位均采用菌絲生長(zhǎng)法檢測(cè)禾谷鐮孢菌抗藥性，但該方法涉及采樣、分離培養(yǎng)需要3d和室內(nèi)大量的藥劑敏感性測(cè)定實(shí)驗(yàn)至少要6天，周期較長(zhǎng)，工作繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。
隨著殺菌劑抗藥性分子機(jī)制研究的深入，利用分子生物學(xué)技術(shù)的檢測(cè)方法快速、簡(jiǎn)便、有效地檢測(cè)殺菌劑抗性成為研究熱點(diǎn)。本發(fā)明從基因組的提取到ASO-PCR整個(gè)檢測(cè)過程只需6h即可，且操作簡(jiǎn)單易學(xué)。因此ASO-PCR技術(shù)使快速、簡(jiǎn)便地檢測(cè)和監(jiān)測(cè)田間抗藥性菌株成為可能，且方法簡(jiǎn)便便于基層工作人員掌握。這對(duì)及時(shí)了解抗藥性病原群體的發(fā)展動(dòng)態(tài)，及時(shí)、合理地指導(dǎo)科學(xué)用藥，有效治理抗藥性，以及降低成本和減少環(huán)境污染具有現(xiàn)實(shí)意義。
4、發(fā)明對(duì)100個(gè)樣品的檢測(cè)結(jié)果表明，其中48個(gè)樣品為抗藥性菌株，52個(gè)為敏感菌株，檢測(cè)準(zhǔn)確率與菌絲生長(zhǎng)法相比高達(dá)99％。
本發(fā)明是禾谷鐮孢菌(Fusarium graminearum，有性態(tài)Gibberella zeae)抗多菌靈的檢測(cè)基因及其檢測(cè)方法，專用于抗苯并咪唑類殺菌劑的禾谷鐮孢菌的檢測(cè)。國(guó)際上首次報(bào)道禾谷鐮孢菌與抗多菌靈的β2-微管蛋白基因，全長(zhǎng)997個(gè)核苷酸，含有1個(gè)內(nèi)含子，編碼313aa，包含需檢測(cè)的抗藥性突變位點(diǎn)。直接從田間采集回來的病穗用ASO-PCR檢測(cè)整個(gè)過程只需6h，檢測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)99％，達(dá)到對(duì)多菌靈中等抗藥性菌株的快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)。該基因由申請(qǐng)者命名為β2-微管蛋白基因。
禾谷鐮孢菌的β2-微管蛋白基因編碼一種負(fù)責(zé)該菌對(duì)多菌靈敏感性的微管蛋白。14個(gè)敏感菌株和21個(gè)抗藥菌株的β2-微管蛋白基因序列分析表明，中抗菌株的β2-微管蛋白基因第33位苯丙氨酸密碼字TTT突變?yōu)槔野彼岬拿艽a字TAT，是田間對(duì)多菌靈抗藥性的主要突變類型，占田間多菌靈的抗藥性菌株群體的99％以上；抗性菌株的β2-微管蛋白基因還存在第64位谷氨酸密碼字GAG突變?yōu)榱涟彼崦艽a字CTG或者賴氨酸密碼字AAG和第66位苯丙氨酸TTC密碼字突變?yōu)槔野彼崦艽a字TAC的次要類型。
四

圖1禾谷鐮孢菌對(duì)多菌靈敏感菌株的β2-微管蛋白基因全序列。
注雙、單下劃線分別表示內(nèi)含子的5′和3′，左、右數(shù)字分別表示氨基酸和核苷酸數(shù)目。與禾谷鐮孢菌參考菌株NRRL31084相比較，差異的核苷酸用方框表示。
圖2禾谷鐮孢菌的β2-微管蛋白基因PCR擴(kuò)增片段電泳圖。
在(a)，(b)圖中的目標(biāo)片段分別由引物uktF1和uktF1，uktF2和uktR2擴(kuò)增?！癕”，“1”，“2”，“3”，“4”，“5”，“6”分別為DL2000(寶生物工程(大連)有限公司)，ZF43(S)，ZF2032(S)，ZF2054(MR)，ZF2052(MR)，ZF43-2-5(HR)，JT04(HR)。
圖3禾谷鐮孢菌用引物MBCRF/MBCRR3的PCR產(chǎn)物電泳圖譜M表Marker，1-17依次代表FQ1-FQ17，F(xiàn)Q12-17為敏感菌株，F(xiàn)Q1-12為對(duì)多菌靈中抗菌株。。
圖4禾谷鐮孢菌用引物MBCSF/MBCRR3的PCR產(chǎn)物電泳圖譜M表Marker，1-24依次代表YC1-YC24。YC1-YC12為敏感菌株，YC13-24為對(duì)多菌靈中抗菌株。
五具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 PCR擴(kuò)增獲得與禾谷鐮孢菌抗多菌靈性相關(guān)的β2-微管蛋白基因1、檢測(cè)基因的獲得根據(jù)小麥赤霉病參考菌株NRRL31084的未命名微管蛋白全基因(基因編號(hào)FG06611.1)序列設(shè)計(jì)引物。引物見表2。50μL擴(kuò)增體系中含d2H2O 37.5μL，dNTP 0.2μM，10×buffer(10mM Tris-HCl，50mM KCl，0.1％ Triton 100)5μL，MgCl22mM，primer X(所需擴(kuò)增片段的上游引物)1μM，primer Y(所需擴(kuò)增片段的下游引物)1μM，Taq(申能博彩生物技術(shù)有限公司)2.5U，模板DNA 100ng。引物對(duì)uktF1和uktR1擴(kuò)增條件為94℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，36次循環(huán)；72℃15min(去引物二級(jí)結(jié)構(gòu)，熱啟動(dòng))。引物對(duì)uktF2和uktR2擴(kuò)增條件為94℃5min；94℃1min，54℃1min，72℃1min，36次循環(huán)；72℃15min(去引物二級(jí)結(jié)構(gòu)，熱啟動(dòng))。
β2-微管蛋白基因，長(zhǎng)度為997bp，相應(yīng)的編碼313個(gè)氨基酸，中抗菌株第33位氨基酸的抗藥性基因突變位點(diǎn)由堿基TTT突變?yōu)閴A基TAT，由氨基酸Phe突變?yōu)榘被酺yr，基因全序列見SEQID NO.1?？剐跃甑摩?-微管蛋白基因還存在第64位谷氨酸密碼字GAG突變?yōu)榱涟彼崦艽a字CTG或者賴氨酸密碼字AAG和第66位苯丙氨酸TTC密碼字突變?yōu)槔野彼崦艽a字TAC的次要類型?？傊?-微管蛋白基因編碼33、64或66位氨基酸的密碼子發(fā)生點(diǎn)突變是導(dǎo)致禾谷鐮孢菌產(chǎn)生抗藥性的主要原因。
取10μL PCR產(chǎn)物于1.0％(g/L)瓊脂糖膠上電泳，電極緩沖液為0.5×TBE，標(biāo)準(zhǔn)分子量用DL2000(大連寶生工)。
從瓊脂糖凝膠上將目的條帶切割下來，用牙簽搗碎后，加300μL TE和300μL Tris飽和酚，混勻后在-20℃下凍融2次，離心后用等體積苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)和氯仿分別抽提1次，2倍無水乙醇沉淀，加20μL TE溶解?；厥占兓腜CR產(chǎn)物用pGEM-T Easy Vector(Promaga)連接，10μL反應(yīng)體系包括5μL 10×連接緩沖液(400mM Tris-HCl，100mM MgCl2，100mM DTT，5mM ATP)；1μL T4DNA連接酶(MBI公司)；100ng純化好的外源片段；40ng T-vector?；靹蚝?℃下放置過夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α，在含Amp(50μg/mL)、X-gal(1.6mg)和IPTG(1.6mg)的LB平板上篩選白色菌落，堿裂解法提取質(zhì)粒DNA驗(yàn)證陽(yáng)性克隆。重組DNA用M13測(cè)序引物進(jìn)行雙向測(cè)序，由上海聯(lián)合基因公司完成。
序列分析用DNAclub軟件，檢索GeneBank、EMBL基因數(shù)據(jù)庫(kù)，敏感菌株的β2-微管蛋白基因核苷酸序列與禾谷鐮孢菌參考菌株NRRL31084的未命名微管蛋白基因(基因編號(hào)FG06611.1)核苷酸序列同源性99.3％，存在7個(gè)位點(diǎn)核苷酸差異，氨基酸序列同源性100％，與15種常見真菌β-微管蛋白基因氨基酸序列同源性70～78％，因此命名為β2-微管蛋白基因。
2、禾谷鐮孢菌β2-微管蛋白基因編碼(申請(qǐng)者命名)序列分析利用2對(duì)引物(表2)對(duì)禾谷鐮孢菌β2-微管蛋白基因擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物見圖2，其測(cè)序結(jié)果(圖1)顯示禾谷鐮孢菌的β2-微管蛋白基因全長(zhǎng)997bp(圖3)。與該菌的其他微管蛋白基因相比，包含1個(gè)內(nèi)含子，55bp。外顯子G+C的mol％為53.86，有2個(gè)編碼區(qū)，分別位于1～548bp、604～997bp之間，共942bp，編碼313aa(圖2)。敏感菌株的β2-微管蛋白基因核苷酸序列與禾谷鐮孢菌參考菌株NRRL31084的未命名微管蛋白基因(基因編號(hào)FG06611.1)核苷酸序列同源性99.3％，存在7個(gè)位點(diǎn)核苷酸差異，氨基酸序列同源性100％；與該菌其他微管蛋白基因同源性比較，發(fā)現(xiàn)與TBB_GIBFU tubulin β chain氨基酸同源性高達(dá)78％，與其它成員氨基酸同源性僅為29-36％(表3)；與15種常見真菌β-微管蛋白基因氨基酸序列同源性70～78％(表4)，因此命名為β2-微管蛋白基因。比較了禾谷鐮孢菌對(duì)多菌靈的敏感和抗藥菌株β2-微管蛋白基因的全序列，表明禾谷鐮孢菌對(duì)多菌靈產(chǎn)生抗藥性可能是由于β2-微管蛋白基因第33位苯并氨酸(Phe)、第64位谷氨酸(Glu)和66苯并氨酸(Phe)密碼字為發(fā)生點(diǎn)突變所致(表1)。
3、禾谷鐮孢菌對(duì)多菌靈抗藥性機(jī)制禾谷鐮孢菌對(duì)多菌靈敏感性存在多個(gè)水平，在遺傳表型上表現(xiàn)為對(duì)多菌靈的中、高抗。不同遺傳表型菌株的β2-微管蛋白基因序列突變的位點(diǎn)不同(表1)。中抗菌株的第33位氨基酸苯丙氨酸密碼子突變成酪氨酸，前者是非極性氨基酸，它的非極性來自氨基酸的苯丙基，而它所突變的氨基酸酪氨酸是不帶電荷的極性氨基酸，極性來自于苯環(huán)上的對(duì)羥基，因此推斷中抗菌株對(duì)多菌靈的抗藥性可能是由于第33位氨基酸從疏水性變?yōu)橛H水性，造成微管蛋白三維構(gòu)象的改變，導(dǎo)致β2-微管蛋白基因編碼的蛋白與多菌靈親和性的改變，使其產(chǎn)生抗藥性。
高抗菌株的第64位谷氨酸突變成亮氨酸，在Ph為7的條件下，由于谷氨酸帶有第二個(gè)羧基，谷氨酸帶有凈負(fù)電荷并且具有很好的親水性，而亮氨酸是非極性的氨基酸。因此，高抗菌株對(duì)多菌靈的抗藥性可能是由于第64位氨基酸的突變導(dǎo)致微管蛋白三維構(gòu)象的改變，造成多菌靈作用環(huán)境的劇烈改變，使β2-微管蛋白基因編碼的蛋白與多菌靈親和性劇減，使其產(chǎn)生高抗表型。而有的高抗菌株在該位點(diǎn)由谷氨酸突變成賴氨酸，后者是在Ph為7的條件下帶有凈正電荷，它所引起的蛋白質(zhì)三維構(gòu)象的改變更大，使多菌靈的作用環(huán)境改變更為劇烈。第64位氨基酸從敏感菌株帶凈負(fù)電荷親水的谷氨酸→非極性疏水的亮氨酸(高抗菌株)→帶正電荷親水的賴氨酸(高抗菌株)突變?cè)斐啥嗑`的工作環(huán)境改變幅度依次增大。第66位苯并氨酸(Phe)氨基酸密碼字(TTC)突變?yōu)槔野彼?TAC)氨基酸，前者是非極性氨基酸，它的非極性來自氨基酸的苯丙基，而它所突變的氨基酸酪氨酸是不帶電荷的極性氨基酸，極性來自于苯環(huán)上的對(duì)羥基，因此推斷中抗菌株對(duì)多菌靈的抗藥性可能是由于第66位氨基酸從疏水性變?yōu)橛H水性，造成微管蛋白三維構(gòu)象的改變，導(dǎo)致未命名微管蛋白與多菌靈親和性的改變，使其產(chǎn)生抗藥性。這樣64和66位形成了一個(gè)類似于其他植物病原菌對(duì)多菌靈所形成的“苯并咪唑類殺菌劑抗性框”(“Benzimidazole-resistance Box”)，但是該閱讀框所包含的突變類型僅是小麥赤霉病菌對(duì)多菌靈等殺菌劑不同遺傳表型的一部分。
用dnaman軟件比較對(duì)多菌靈敏感和高度抗藥性的禾谷鐮孢菌的β2-微管蛋白基因序列，確定多菌靈的中等抗藥性的產(chǎn)生是由于β2-微管蛋白第33位氨基酸由Phe(TTT)突變?yōu)門yr(TAT)所致。因此根據(jù)突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行多菌靈的中等抗藥性菌株的ASO-PCR擴(kuò)增以檢測(cè)抗藥頻率。
實(shí)施例2 2004年江蘇省鹽城市小麥上的禾谷鐮孢菌對(duì)多菌靈中等抗藥性菌株和敏感菌株抗藥性的快速檢測(cè)將2004年采集回來的病穗，隨機(jī)選擇100個(gè)，每穗挑取一個(gè)粉紅色病麥粒直接放入0.1mL重蒸水，猛烈振蕩1min，取出病麥粒，將懸浮液煮沸15min，渦旋2min即可直接用于ASO-PCR檢測(cè)。
即用上游引物MBCRF(5′-TCCCCGATCGCATGATGGCCACCTA-3′)下游引物MBCRR3(5′-CTTTCGCAGATCCGAGTTGAGCTGT-3′)。50μL反應(yīng)體系中5μL煮沸的分生孢子懸浮液，5μL 10×buffer，dNTP各0.2mmol/L，MgCl22mmol/L，引物各0.5μmol/L，TaqDNA聚合酶2U(上海Promaga公司)。反應(yīng)在PTC-100TM(MJ Research，Inc.)上進(jìn)行，反應(yīng)條件94℃ 5min；56℃ 60s，72℃ 60s，94℃ 60s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 15min；4℃保存。取10μL PCR產(chǎn)物于1.5％(g/L)瓊脂糖TBE膠上電泳，紫外觀察照相。供試病穗100個(gè)，其中47個(gè)病穗用引物對(duì)MBCRF/MBCRR3能擴(kuò)增出281bp的條帶，為小麥赤霉病對(duì)多菌靈中抗的菌株。
同上利用上游引物MBCSF(5′-TCCCCGATCGCATGATGGCCACCTT-3’)和MBCRR3(5’-CTTTCGCAGATCCGAGTTGAGCTGT-3′)用于擴(kuò)增對(duì)多菌靈敏感的小麥赤霉病菌株。供試病穗100個(gè)，其中53個(gè)病穗用引物對(duì)MBCRF/MBCRR3能擴(kuò)增出281bp的條帶，為小麥赤霉病對(duì)多菌靈敏感的菌株。
傳統(tǒng)的菌絲生長(zhǎng)法相比準(zhǔn)確率達(dá)99％(表5)，且從基因組的提取到ASO-PCR整個(gè)檢測(cè)過程只需6h即可。
實(shí)施例3 2004年江蘇省鹽城等小麥上的禾谷鐮孢菌對(duì)多菌靈中等抗藥性菌株和敏感菌株抗藥性的快速檢測(cè)將2004年采集回來的病穗，隨機(jī)選擇80個(gè)，將病穗上的病?；虿〗M織在無菌操作下挑至馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基上，25度條件下培養(yǎng)3-5天進(jìn)行基因組DNA提取刮取在馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基生長(zhǎng)的氣生菌絲，加入1.0mL提取緩沖液和0.1～0.5g石英砂，充分研磨，60℃溫浴50min，10000rpm離心8min后，上清液用等體積上述抽提液抽提2次，上清液加等體積異丙醇沉淀干燥后溶于50μL TE，37℃水浴10min，取2μL用0.7g/100L的瓊脂糖電泳檢測(cè)全部有亮帶，說明已提取出該病菌的基因組DNA；紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其基因組DNA的含量，提取的基因組DNA直接用于ASO-PCR檢測(cè)。即用上游引物MBCRF(5′-TCCCCGATCGCATGATGGCCACCTA-3’)、MBCSF(5’-TCCCCGATCGCATGATGGCCACCTT-3′)和下游引物MBCRR3(5’-CTTTCGCAGATCCGAGTTGAGCTGT-3’)直接以禾谷鐮孢菌基因組DNA為模板擴(kuò)增β-微管蛋白基因部分片段。50μL反應(yīng)體系中含1μL模板DNA，5μL 10×buffer，dNTP各0.2mmol/L，MgCl22mmol/L，引物各0.5μmol/L，TaqDNA聚合酶2U(上海Promaga公司)。反應(yīng)在PTC-100TM(MJ Research，Inc.)上進(jìn)行，反應(yīng)條件94℃ 5min；56℃ 60s，72℃ 60s，94℃ 60s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 15min；4℃保存。取10μL PCR產(chǎn)物于1.5％(g/L)瓊脂糖TBE膠上電泳，紫外觀察照相。
實(shí)施例4 2004年江蘇省通州市小麥上的禾谷鐮孢菌對(duì)多菌靈中等抗藥性菌株和敏感菌株抗藥性的快速檢測(cè)將麥穗病變的部分分別切下一小塊(30～50mg)，3.5％(mg/L)NaClO3消毒5min；在消毒后的禾谷鐮孢病穗塊中加入1.5mL提取緩沖液(100mmol/L LiCl；10mmol/L EDTA；10mmol/LTris-HCl，pH8.0；10g/L SDS，其余為水，高壓滅菌)和0.2g已高壓滅菌的石英砂，充分研磨；60℃溫浴10min；10000rpm離心4min后；吸出700μL的上清液，用700μL的抽提液(苯酚、氯仿、異戊醇按體積比配制成25∶24∶1)抽提2次；再次吸出600μL的上清液，加600μL異丙醇；-20℃放置20min；10000rpm離心20min；棄上清液，干燥沉淀，溶于20μL的TE緩沖液(10mmol/LTris-HCl，pH8.0；1mmol/L EDTA，pH8.0；20 mg/L RNAase)，37℃水浴10min。3h內(nèi)完成從病穗中直接提取基因組DNA。
將以上從病穗中提取的基因組DNA直接用于ASO-PCR檢測(cè)。即用上游引物MBCRF(5′-TCCCCGATCGCATGATGGCCACCTA-3′)、MBCSF(5′-TCCCCGATCGCATGA TGGCCACC TT-3’)和下游引物MBCRR3(5’-CT TTCGCAGATCCGAGTTGAGCTGT-3′)直接以禾谷鐮孢菌基因組DNA為模板擴(kuò)增β-微管蛋白基因部分片段。50μL反應(yīng)體系中含5μL模板DNA，5μL 10×buffer，dNTP各0.2mmol/L，MgCl22mmol/L，引物各0.5μmol/L，TaqDNA聚合酶2U(上海Promaga公司)。反應(yīng)在PTC-100TM(MJ Research，Inc.)上進(jìn)行，反應(yīng)條件94℃ 5min；56℃60s，72℃60s，94℃ 60s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 15min；4℃保存。取10μL PCR產(chǎn)物于1.5％(g/L)瓊脂糖TBE膠上電泳，紫外觀察照相。傳統(tǒng)的菌絲生長(zhǎng)法相比準(zhǔn)確率達(dá)96.25％，且從基因組的提取到ASO-PCR整個(gè)檢測(cè)過程只需6h即可。
表1負(fù)責(zé)小麥赤霉病菌對(duì)多菌靈不同敏感性水平的β2-微管蛋白基因的突變類型

*S，MR和HR分別表示小麥赤霉病野生菌株對(duì)多菌靈敏感、中抗和高抗。
表2用于擴(kuò)增β2-微管蛋白基因的PCR引物

表3禾谷鐮孢菌β2-微管蛋白基因與該菌其他微管蛋白基因同源性比較

*http//www.broad.mit.edu/cgi-bin/antion/fusarium/findfeatures.cgi？page＝showfeatures&FEATURETYPES＝GENE&GENEBYHMMER＝1&GENEPFAMNAME＝tubulin
表4 禾谷鐮孢菌與其他重要真菌的β-微管蛋白基因的同源件比較

*，因沒有獲得該基因的全序列，沒有統(tǒng)計(jì)。**，對(duì)多菌靈的抗藥性基因。
表5 二種方法檢測(cè)禾谷鐮孢菌對(duì)多菌靈抗性的比較

*，多出的一個(gè)“敏感菌株”經(jīng)過擴(kuò)增，測(cè)序，確認(rèn)為β2-微管蛋白基因的第66位苯并氨酸(Phe)氨基酸密碼字(TTC)突變?yōu)槔野彼?TAC)氨基酸，是多菌靈的抗性菌株。
序列表<110>南京農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>禾谷鐮孢菌抗多菌靈的檢測(cè)基因及其檢測(cè)方法<130>說明書<140>0.0<141>2005-01-24<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>997<212>DNA<213>禾谷鐮孢菌(Fusarium graminearum，有性態(tài)Gibberella zeae)對(duì)多菌靈的中抗菌株<220>
<221>β2-微管蛋白基因<222>(1)..(997)<223>
<400>1atgacgcact ctctcggcgg tggtaccggt tccggtatgg gaacgcttct tctgtccaag60atccgcgagg agttccccga tcgcatgatg gccacctatt ccgttatgcc ctcgcccaag120gtttccgata ccgttgttga accttacaac gccactttgt ctctgaacca gctcgtcgag180aactctgacg agaccttctg tatcgataac gaggctctgt acgatatcta cgagaggacc240ctcaagatcg ccgatccttc gtacgccgat ctcaactacc tgatttctac cgtcatggcc300ggtgtgacga catgtttccg attccccgga cagctcaact cggatctgcg aaagctcgct360gttaacatga ttccgttccc ccgacttcac ttcttcatgg tcggatttgc ccctctgact420ggtcgcaaca tgaagacctt ccagcacgtt accgtccccg ggcttgctca gcagattttc480gacaacaaga acatcatggc cgctggcgat ttccgcaacg gacgatacct cgcttgttcc540gccatcttgt aagttttgaa actgaccaaa tttcaaaaac acaaaaacta atgaaattcc600cagccgtgga cgtctctcaa caaaggagat tgaggaccag atgctcaagg ttcagaccaa660gaactccgag tactttgtcg actggatccc caacaacgtc caaacttccg tctgttccgt720gcctccccgc ggtctcgaca tgtccgccac tttcgtcggc aactccaccg ccgtccagga780gatcttcaag cgtgtcgacg accagttctc agccatgttc cgtcgcaagg ctttcttgca840ttggtacaca agcgagggta tggacgagat ggaattcacc gaggcccagt ccaacttgca900cgacttggtt tccgagtacc agcaatacca agacgccgac atcgacgacg aggctgagga960gtacgaggag ggtgagcccg aggagtacga gggttga 99權(quán)利要求
1.禾谷鐮孢菌抗多菌靈檢測(cè)基因，長(zhǎng)度為997bp，由命名為β2-微管蛋白基因突變而來，相應(yīng)的編碼β2-微管蛋白的313個(gè)氨基酸，該基因包含中抗菌株β2-微管蛋白基因編碼的第33位氨基酸的抗藥性基因突變位點(diǎn)，其位點(diǎn)密碼子由堿基TTT突變?yōu)閴A基TAT，由氨基酸Phe突變?yōu)榘被酺yr，基因全序列見SEQ ID NO.1。
2.權(quán)利要求1所述禾谷鐮孢菌抗多菌靈檢測(cè)基因用于檢測(cè)對(duì)多菌靈抗藥性的方法，包括待測(cè)樣品處理、PCR擴(kuò)增程序，其特征在于將病穗上的病?；虿〗M織在無菌操作下挑至馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基上，25℃條件下培養(yǎng)3-5天進(jìn)行基因組DNA提取配制提取緩沖液100mM LiCl；10mM EDTA；10mM Tris-HCl，PH8.0；10g/L SDS，蒸餾水補(bǔ)充到所需體積；配制抽提液苯酚∶氯仿∶異戊醇體積為25∶24∶1；TE緩沖液10mmol/L Tris-HCl，pH8.0；1mmol/L EDTA，pH8.0；20mg/L RNAase；基因組DNA的提取刮取在馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基生長(zhǎng)的氣生菌絲，加入1.0mL提取緩沖液和0.1～0.5g石英砂，充分研磨，60℃溫浴10min，10000rpm離心4min后，上清液用等體積上述抽提液抽提1～2次，上清液加等體積異丙醇沉淀干燥后溶于200μL TE，37℃水浴10min，取2μL用0.7g/100L的瓊脂糖電泳檢測(cè)全部有亮帶，說明已提取出該菌基因組DNA；紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其基因組DNA的含量，提取的基因組DNA用于寡核苷酸-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ASO-PCR檢測(cè)；或者將長(zhǎng)有粉紅色分生孢子的病穗，輕輕挑取粉紅色部分放入0.1mL重蒸水，猛烈振蕩1min，取出病組織，將懸浮液煮沸15min，渦旋2min即可直接用于ASO-PCR檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明是禾谷鐮孢菌(Fusarium graminearum，有性態(tài)Gibberella zeae)抗多菌靈的檢測(cè)基因及其檢測(cè)方法，專用于抗苯并咪唑類殺菌劑的禾谷鐮孢菌的檢測(cè)。本發(fā)明在國(guó)際上首次報(bào)道并命名了禾谷鐮孢菌β
文檔編號(hào)C12N15/31GK1657627SQ20051003829
公開日2005年8月24日 申請(qǐng)日期2005年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月31日
發(fā)明者陳長(zhǎng)軍, 周明國(guó), 王建新, 李紅霞 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)