專利名稱：一株產(chǎn)復(fù)合酶的菌株及用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)復(fù)合酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一株產(chǎn)復(fù)合酶的菌株及用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)復(fù)合酶的方法，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)復(fù)合酶(包括β-葡聚糖酶和蛋白酶)的菌株及發(fā)酵生產(chǎn)復(fù)合酶的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在國(guó)外，β-葡聚糖酶最早應(yīng)用于啤酒工藝，它可分解大麥及麥芽中的β-葡聚糖凝膠，降低麥汁粘度，提高麥汁的過(guò)濾速度、麥汁浸出率，減少膠狀沉淀物，改善啤酒的混濁度，提高產(chǎn)品質(zhì)量。而我國(guó)此工藝的大規(guī)模應(yīng)用只是在20世紀(jì)末才開始的，效益顯著。近年來(lái)，隨著麥類飼料的發(fā)展，對(duì)含大麥的家畜、家禽飼料，大麥中的β-葡聚糖是一類非淀粉粘性多糖抗?fàn)I養(yǎng)因子，在添加β-葡聚糖酶后，不僅可消除抗?fàn)I養(yǎng)因子的影響，提高這些飼料的營(yíng)養(yǎng)效價(jià)，而且可獲得較好的社會(huì)效益。利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)復(fù)合酶具有原料成本低、來(lái)源廣泛等許多優(yōu)點(diǎn)，引起了研究者廣泛的興趣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一株產(chǎn)復(fù)合酶的菌株及用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)復(fù)合酶的方法，本發(fā)明能夠制備具有較高酶活性的復(fù)合酶(包括β-葡聚糖酶和蛋白酶)。
本發(fā)明的技術(shù)方案一株產(chǎn)包括β-葡聚糖酶及蛋白酶的復(fù)合酶的菌株，該菌株為淀粉液化芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)SYB-001，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.1314。
利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)包括β-葡聚糖酶及蛋白酶的復(fù)合酶的方法為斜面和種子培養(yǎng)基以g/L計(jì)蛋白胨10.0，牛肉膏5，NaCl 5，斜面培養(yǎng)再加瓊脂20，pH7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基以g/L計(jì)玉米粉36-44，大麥粉18-22，豆餅粉36-44，控制玉米粉與大麥粉的質(zhì)量比為2∶1，Na2HPO48，(NH4)2SO44，NH4Cl 0.75，CaCl21.0，pH7.0；培養(yǎng)條件為
搖瓶發(fā)酵，250mL錐形瓶中發(fā)酵培養(yǎng)基為25mL，溫度為35～40℃(最佳37℃)，培養(yǎng)基初始pH4.0～10.0(最佳7.0)，轉(zhuǎn)速150～200r/min(最佳200 r/m)，發(fā)酵時(shí)間為60h；發(fā)酵罐發(fā)酵，5L發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基體積為3L，接種量為8％(v/v)，溫度為37℃，通氣量3L/L·min，攪拌轉(zhuǎn)速為600r/min，發(fā)酵時(shí)間為35-40h。
以玉米粉和大麥粉以2∶1(質(zhì)量比)復(fù)配作為培養(yǎng)基碳源時(shí)發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶的活力較高。
以4％豆餅粉為氮源時(shí)發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶的活力較高。
CGMCC No.1314在5L發(fā)酵罐產(chǎn)酶，從斜面上接一環(huán)CGMCC No.1314菌種入種子培養(yǎng)基(25mL/250mL錐形瓶)，在37℃、200r/min下培養(yǎng)12h后，以8％的接種量(v/v)接入5L罐中。5L罐中體積為3L，通氣量為3L/L·min，攪拌轉(zhuǎn)速為600r/mim，發(fā)酵溫度為37℃。發(fā)酵設(shè)備為上海保興生物設(shè)備工程有限公司的5L自動(dòng)控制發(fā)酵罐(Biotech-2001)。發(fā)酵時(shí)間為35-40h，β-葡聚糖酶酶活最高值為123U/mL，蛋白酶最高酶活為3800U/mL。
在發(fā)酵液中添加不同的表面活性劑對(duì)產(chǎn)酶有一定影響，以大麥粉2％、玉米粉4％和豆餅粉4％及無(wú)機(jī)鹽離子組成的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別加入1％含量的不同表面活性劑SDS、Tween-80、聚乙二醇或消泡劑聚醚，搖瓶培養(yǎng)，結(jié)果表明，Tween-80，聚乙二醇或消泡劑聚醚均能促進(jìn)β-葡聚糖酶的生成，尤以消泡劑聚醚的效果最為顯著，比對(duì)照酶活提高了約20％。
分析方法將含有4mL發(fā)酵液的塑料離心管置于臺(tái)式高速離心機(jī)(TGL-16G)中，于10000r/min下離心5min，取上清夜備用。
β-葡聚糖酶分析方法0.1mL稀釋酶液加0.4mL底物，于40℃反應(yīng)10min，每個(gè)樣品中加入3ml沉淀液，離心，測(cè)清液在590nm處的吸收值A(chǔ)，同樣以0.1mL蒸餾水代替酶液做空白。
酶活計(jì)算公式酶活(u/mL)＝[(A590+0.001238)/0.8903]×nn-發(fā)酵液稀釋倍數(shù)β-葡聚糖酶定義1ml發(fā)酵液于40℃、pH6.5，每分鐘分解大麥β-葡聚糖產(chǎn)生1μmol還原糖定義為1個(gè)酶活單位。
中性蛋白酶分析方法Folin-酚法測(cè)定。
本發(fā)明的有益效果所提供的復(fù)合酶產(chǎn)生菌CGMCC No.1314，能以大麥粉、玉米粉、豆餅粉等廉價(jià)原料為發(fā)酵基質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)生具有高β-葡聚糖酶酶活性的復(fù)合酶，降低了生產(chǎn)成本；5L罐試驗(yàn)中通過(guò)提高轉(zhuǎn)速大大縮短了發(fā)酵周期。以上發(fā)現(xiàn)為指導(dǎo)設(shè)計(jì)育種和通過(guò)代謝調(diào)控優(yōu)化發(fā)酵條件提高產(chǎn)量奠定了基礎(chǔ)，亦為降低復(fù)合酶的生產(chǎn)成本提供了可能，促進(jìn)了復(fù)合酶在工業(yè)生產(chǎn)中的實(shí)際應(yīng)用進(jìn)程。


圖1不同的表面活性劑對(duì)CGMCC No.1314產(chǎn)酶的影響圖2 CGMCC No.1314在5L發(fā)酵罐中的產(chǎn)酶過(guò)程曲線。酶活單位為U/mL。生物材料樣品保藏一株產(chǎn)包括β-葡聚糖酶及蛋白酶的復(fù)合酶的菌株，該菌株為淀粉液化芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)SYB-001，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.1314，保藏日期為2005年2月2日。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)例更為詳細(xì)地解釋了本發(fā)明中的某些關(guān)鍵點(diǎn)，為更好的理解本發(fā)明提供了依據(jù)。
實(shí)施例1分別選取幾種不同的碳源，在其發(fā)酵工藝中(如說(shuō)明書所述)相同的情況下進(jìn)行發(fā)酵，CGMCC No.1314產(chǎn)β-葡聚糖酶和蛋白酶的結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 不同碳源對(duì)CGMCC No.1314產(chǎn)β-葡聚糖酶及蛋白酶的影響

結(jié)果顯示以玉米粉和大麥粉(質(zhì)量比2∶1)復(fù)配為碳源時(shí)，產(chǎn)β-葡聚糖酶的能力較高。
實(shí)施例2以玉米粉和大麥粉(質(zhì)量比2∶1)復(fù)配為碳源，分別選擇不同的氮源，在其發(fā)酵工藝(如說(shuō)明書所述)相同的情況下，進(jìn)行發(fā)酵，CGMCC No.1314產(chǎn)β-葡聚糖酶和蛋白酶的結(jié)果見(jiàn)表2。
表2不同氮源對(duì)CGMCC No.1314產(chǎn)β-葡聚糖酶及蛋白酶的影響

結(jié)果顯示，4％的豆餅粉作為氮源時(shí)，酶活較高。
實(shí)施例3不同表面活性劑對(duì)產(chǎn)酶的影響以大麥粉2％、玉米粉4％和豆餅粉4％及無(wú)機(jī)鹽離子組成的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別加入1％含量的不同表面活性劑SDS、Tween-80、聚乙二醇或消泡劑聚醚，搖瓶培養(yǎng)，結(jié)果表明，Tween-80，聚乙二醇或消泡劑聚醚均能促進(jìn)β-葡聚糖酶的生成，尤以消泡劑聚醚的效果最為顯著，比對(duì)照酶活提高了約20％。
實(shí)施例4CGMCC No.1314在5L發(fā)酵罐產(chǎn)酶，從斜面上接一環(huán)CGMCC No.1314菌種入種子培養(yǎng)基(25mL/250mL錐形瓶)，在37℃、200r/min下培養(yǎng)12h后，以8％的接種量(v/v)接入5L罐中。5L罐中體積為3L，通氣量為3L/(L·min)，攪拌轉(zhuǎn)速為600r/mim，發(fā)酵溫度為37℃。發(fā)酵設(shè)備為上海保興生物設(shè)備工程有限公司的5L自動(dòng)控制發(fā)酵罐(Biotech-2001)。發(fā)酵時(shí)間為35-40h，β-葡聚糖酶酶活最高值為123U/mL，蛋白酶最高酶活為3800U/mL。
權(quán)利要求
1.一株產(chǎn)包括β-葡聚糖酶及蛋白酶的復(fù)合酶的菌株，其分類命名為淀粉液化芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)SYB-001，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.1314。
2.一種利用權(quán)利要求1所述菌株發(fā)酵生產(chǎn)包括β-葡聚糖酶及蛋白酶的復(fù)合酶的方法，其特征是斜面和種子培養(yǎng)基以g/L計(jì)蛋白胨10.0，牛肉膏5，NaCl 5，斜面培養(yǎng)再加瓊脂20，pH 7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基以g/L計(jì)玉米粉36-44，大麥粉18-22，豆餅粉36-44，控制玉米粉與大麥粉的質(zhì)量比為2∶1，Na2HPO48，(NH4)2SO44，NH4Cl 0.75，CaCl21.0，pH7.0；培養(yǎng)條件為搖瓶發(fā)酵，250mL錐形瓶中發(fā)酵培養(yǎng)基為25mL，溫度為35～40℃，培養(yǎng)基初始pH4.0～10.0，轉(zhuǎn)速150～200r/min，發(fā)酵時(shí)間為60h；發(fā)酵罐發(fā)酵，5L發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基體積為3L，接種量為體積比8％，溫度為37℃，通氣量3L/L·min，攪拌轉(zhuǎn)速為600r/min，發(fā)酵時(shí)間為35-40h。
全文摘要
一株產(chǎn)復(fù)合酶的菌株及用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)復(fù)合酶的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的菌株為一株淀粉液化芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)SYB－001，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.1314。該菌株在以玉米粉和大麥粉為復(fù)合碳源，豆餅粉為氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基中能夠制備具有較高酶活性的復(fù)合酶(包括β－葡聚糖酶和蛋白酶)。本發(fā)明為指導(dǎo)育種和最終實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N9/42GK1683520SQ200510038488
公開日2005年10月19日 申請(qǐng)日期2005年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月17日
發(fā)明者李崎, 李永仙, 鄭飛云, 顧國(guó)賢, 尹象勝, 林小潔, 郝秋娟 申請(qǐng)人:江南大學(xué)