專利名稱：bec基因花器官特異表達載體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因重組與表達調控，具體地說將吲哚雙加氧酶基因bec與在花器官特異表達的啟動子重組，構建成可在花器官特異表達吲哚雙加氧酶的載體質粒。
背景技術：
靛藍是最早發(fā)現的天然染料之一，顏色鮮艷又耐久，它通常從含靛植物中提取出來，但提取工藝復雜，產量低，因此目前市售的靛藍色素絕大部分通過化學合成。自1928年發(fā)現微生物可合成靛藍色素以來，通過微生物發(fā)酵大規(guī)模生產天然靛藍色素成為可能。靛藍分子中的苯環(huán)可引入各種取代基(最重要的是鹵素)，形成各種靛藍類染料。此外，靛藍分子中的氮原子可被其它原子取代，用硫來代替氮原子則形成硫靛，是一種紅色染料。在生物體的色氨酸代謝途徑中，色氨酸在色氨酸酶的作用下形成吲哚及其衍生物，其中吲哚酚常以β-吲哚葡萄糖苷形式存在，其在β-葡糖酶的作用下脫去一分子葡萄糖生成吲哚酚，而吲哚酚極易被氧化成靛藍。因此在靛藍合成途徑中，吲哚氧化成吲哚酚是關鍵步驟，而吲哚雙加氧酶是關鍵酶，該基因的表達就可以促使靛藍色素的生成。
在自然界中，天然的靛藍色花卉極為罕見。通過基因工程的方法改良花卉的顏色就是將花器官特異表達啟動子或誘導表達啟動子與色素合成基因構建成植物高效表達載體，轉化花卉，產生的色素就會沉淀在花器官的細胞腔內呈現色彩，改變轉基因花卉的色澤。這種轉基因花卉的出現將以其新穎的色澤和更加優(yōu)良的園藝性狀而具有更為廣闊的市場前景。
查爾酮合成酶基因(chs)是植物體類黃酮合成分支的第一個酶，它的表達受到植株發(fā)育狀況和環(huán)境刺激等因素的影響。目前，chs啟動子是花卉基因工程中研究較多的一個，尤其是花卉的花色基因工程。在目前GenBank(基因數據庫)中公布的有關chs啟動子序列中，以十字花科植物為主，其中作為模式植物的擬南芥更是研究最多的材料之一。另外，象赤松、豌豆和矮牽牛等也是研究較多的植物。
1996年，Ouriel Faktor等研究了法國豌豆chs15基因的啟動子序列，chs15-gus(β-葡萄糖苷酸酶基因)融合表達顯示該啟動子與大豆中報道的chs啟動子具有相似的組織特異表達模式。gus活性在花和根尖中較強，而且在花中的表達主要是限定在花器官的色素部分。而在葉片和花萼部分很難檢測到gus表達。在煙草中表達時，色素集中的花藥部分gus的表達活性要比花絲等部位高的多，在子房中gus的表達活性也比較低。因此查爾酮合成酶基因啟動子以其在花器官和根尖特異表達的特性而成為一種較為理想的用于花卉基因工程研究中的啟動子。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種bec基因花器官特異表達載體，將該載體轉入花卉，可促使靛藍色素在花器官特異生成，改變花的色澤，提高花卉觀賞價值。
本發(fā)明的技術方案是將花器官特異表達的查爾酮合成酶基因的啟動子Pchs與吲哚雙加氧酶基因bec進行基因重組，構建成可在花器官細胞內特異表達吲哚雙加氧酶的重組質粒。將該質粒轉化花卉，轉基因花卉的花器官中將含有吲哚雙加氧酶，催化吲哚氧化成吲哚酚，2個吲哚酚分子自然縮合成為靛藍色素，沉淀在花器官細胞腔內從而改變花器官的顏色。
其中，所述bec基因的表達產物為吲哚雙加氧酶，是靛藍色素合成途徑中的關鍵酶，該基因的表達就可以促使靛藍色素的生成。
所述查爾酮合成酶基因chs啟動子為花器官特異表達，可調控結構基因在花器官中特異表達。
所述載體質粒，在bec基因的5’端組裝花器官特異啟動元件查爾酮合成酶基因啟動子Pchs。它們能使bec基因在花器官特異表達。
所述載體質粒，在bec基因的3’端組裝了增強表達能力的nos終止子。
所述載體質粒組裝NPTII基因，作為轉基因植物的篩選標記，可以用卡那霉素進行轉基因植株的篩選。
所述載體質粒組裝LB和RB序列，促使組裝于其間的bec基因表達框架和篩選標記基因NPTII整合至植物受體細胞染色體中。
本發(fā)明與現有技術相比，其顯著優(yōu)點是本發(fā)明所述載體含有微生物靛藍色素合成途徑關鍵酶基因bec，并將其置于花器官特異表達的啟動子Pchs調控之下，將該載體轉入花卉，可促使靛藍色素在花器官特異生成，改變花的色澤，提高花卉觀賞性，具有重要的意義。
四

附圖是bec基因花器官特異表達載體質粒pBinPchs-bec的構建路線圖。
將pPTL-bec上切下吲哚雙加氧酶基因bec片段，經過兩步中間載體pSIII和pSIV，將花器官特異啟動子、bec基因和Nos終止子串聯(lián)，構建成bec基因表達盒Pchs-bec-Tnos”，然后連入植物表達載體pBin19，最終得到載體pBinPchs-bec。
五具體實施例方式
下面的實施例可以使本領域技術人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
實施例1擬南芥總DNA的提取。
1、取擬南芥哥倫比亞生態(tài)型種子，經無菌處理接種在培養(yǎng)基上，待其長出葉片。
2、稱取4克新鮮葉片作為植物材料，在液氮中研成粉末，裝入50ml離心管中，加入20ml冰浴的提取緩沖液，混合均勻。
3、2,700g離心20分鐘，取上清加入8ml裂解緩沖液，充分渦旋混合均勻，65oC溫浴20-30分鐘。
4、加入10ml氯仿/異戊醇(24∶1)，顛倒混勻，12000rpm離心5分鐘，取上相轉入一新離心管中。如此重復數次，直至分界面澄清為止。
5、吸取上相到另一新Eppendof管中，加入2/3體積冰冷的異丙醇(約5.6ml)，室溫靜置20-30分鐘。
6、6000rpm離心10分鐘，收集沉淀物。
7、加入1ml 70％乙醇溫和振蕩沖洗2～3次，吹干。
8、加入500μl TE 65℃溫浴10-30分鐘，重懸沉淀。
9、重懸沉淀后，10,000g離心5分鐘沉淀多糖。然后將上清轉移到新的1.5mlEppendorf管。
10、溶解于TE的DNA可保存幾周至數月。
11、紫外檢測結果濃度為300ng/ul，A260/A280的比值為1.89，凝膠電泳結果DNA大于20KB。
實施例2花器官特異啟動子的克隆。
1、花器官特異啟動子Pchs引物。
上游引物5’-TAG GAG TTA AGT ATG CAC GTG TAA GAA CT-3’下游引物5’-CGC TAT AGT TAT CAC CAA CTT GG-3’。
2、PCR擴增高保真PCR反應體系如下10×ExBuf(Mg2+free)2μl；2mM dNTPMixer 2μl；25mM Mg2+1μl；ExTaq DNA Polymerase 0.2μl，即1u；上游引物1μl，30pmol；下游引物1μl，30pmol；模板(擬南芥總DNA約10-250ng)1μl，加無菌ddH2O補足20μl。反應程序預變性94℃3分鐘-(94℃40秒-55℃30秒-72℃40秒)×35個循環(huán)-72℃10分鐘。
3、反應完成后，取10μl樣品經1.0％瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下用一次性刀片小心切下位于530bp左右的特異片段，用DNA片段回收試劑盒回收并純化后溶于20μl ddH2O中，-20℃保存。
4、將擴增片段連接到pGEM-T載體上，進行序列分析。
實施例3花器官特異啟動子gus表達載體(pESII)的構建。
1、取7μlPCR回收產物與1μlpGEM-T載體連接，轉化大腸桿菌DH5α，測序鑒定得pGEM-T-Pchs。
2、將pGEM-T-Pchs以PstI和NcoI酶切，所得片段連接至經PstI和NcoI雙酶切的pUC-T-GAFP載體片段，轉化鑒定，即得中間載體pSI。
3、陽性克隆以PstI和NcoI雙酶切鑒定大小，切下大小為0.54KB左右片段。
4、將中間載體pSI以HindIII、EcoRV酶切所得Pchs啟動子片段連接至經HindIII、SmaI酶切的pBI121載體片段，得花器官特異啟動子gus表達載體pES II。陽性克隆經PCR鑒定，可見一條0.53 kb左右條帶，即Pchs啟動子片段。
實施例4花器官特異啟動子調控下bec基因的植物表達載體(pBinPchs-bec)構建。
1、將pPTL-bec以EcoRI、PstI酶切所得bec片段連接至經EcoRI、PstI。酶切的pBluescriptSK載體片段得中間載體pSIII。藍白斑篩選所得陽性克隆經EcoRI、SmaI酶切鑒定得2.4kb左右條帶，為bec基因。
2、將中間載體pSIII以EcoRI、SmaI酶切所得bec片段連接至EcoRI、EcoRV酶切的pSI載體片段，獲得中間載體pSIV，陽性克隆經XbaI，SacI雙酶切鑒定，可見一條2.4kb左右條帶，即bec基因。
3、將中間載體pSIV以EcoRI和HindIII酶切所得bec片段連接至經EcoRI和HindIII酶切pBin19所得載體片段上，獲得植物表達載體pBinPchs-bec。陽性克隆經EcoRI和HindIII雙酶切并以pBin19酶切產物為對照，結果pBin19雙酶切產物可見1條10.0kb左右條帶為gus片段；而pBinPchs-bec雙酶切產生2條帶，各約10.0kb和3.5kb，說明花器官特異啟動元件調控下基因的基因表達盒“Pchs-bec-Tnos”已經成功插入。
權利要求
1.一種bec基因花器官特異表達載體，其特征在于它含有擬南芥查爾酮合成酶基因的啟動子、bec基因、終止子和NPTII基因。
2.根據權利要求1所述的bec基因花器官特異表達載體，其特征在于bec基因的表達產物是吲哚雙加氧酶。
3.根據權利要求1所述的bec基因花器官特異表達載體，其特征在于bec基因的5’端組裝花器官特異啟動元件查爾酮合成酶基因啟動子。
4.根據權利要求1所述的bec基因花器官特異表達載體，其特征在于bec基因的3’端組裝了增強表達能力的nos終止子。
5.根據權利要求1所述的bec基因花器官特異表達載體，其特征在于含有LB和RB序列。
6.根據權利要求1所述的bec基因花器官特異表達載體，其特征在于NPTII基因可以用卡那霉素篩選。
7.根據權利要求1所述的bec基因花器官特異表達載體，其特征在于可將bec基因整合至植物受體細胞染色體中。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種bec基因花器官特異表達載體，它含有在花器官特異表達的啟動子查爾酮合成酶基因chs啟動子Pchs、吲哚雙加氧酶基因bec、終止子nos、篩選標記基因NPTII(新霉素磷酸轉移酶基因)和LB(左邊界)、RB(右邊界)序列，其特征在于將其中的bec基因置于花器官特異表達的啟動子Pchs調控之下，將該載體轉入花卉，可促使靛藍色素在花器官特異生成，改變花的色澤，提高花卉觀賞價值。
文檔編號C12N15/52GK1715415SQ20051003910
公開日2006年1月4日 申請日期2005年4月26日 優(yōu)先權日2005年4月26日
發(fā)明者陳英, 黃敏仁, 王明庥, 諸葛強, 王光萍, 潘惠新, 李火根, 徐立安 申請人:南京林業(yè)大學