專利名稱：一種無(wú)桔霉素紅曲霉基因工程菌的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種無(wú)桔霉素紅曲霉基因工程菌的構(gòu)建方法，本發(fā)明屬于微生物基因工程(或分子育種)領(lǐng)域，涉及通過(guò)基因工程的方法構(gòu)建和選育不產(chǎn)桔霉素紅曲霉色素高產(chǎn)的工程菌。
背景技術(shù)：
紅曲霉(Monascus)是東方特有的菌種，是我國(guó)重要的微生物資源，能產(chǎn)生廣泛的具有生物活性的天然產(chǎn)物，具有很高的商業(yè)價(jià)值。紅曲的應(yīng)用已有上千年的歷史，其醫(yī)療功效在中國(guó)古籍中早有記載。先前的研究表明，紅曲具有降血脂、降血壓、抗氧化、抗癌、抗菌、抗疲勞、預(yù)防老年癡呆癥等多重功效。紅曲酶代謝產(chǎn)物如膽固醇酶抑制劑monacolinK、色素、真菌毒素桔霉素等均是聚酮體類物質(zhì)。表明紅曲酶蘊(yùn)藏著豐富的聚酮體合成酶基因(PKSs)。
其中最重要的紅曲產(chǎn)品是色素，廣泛應(yīng)用于食品、飲料和化妝品工業(yè)。最新研究表明，有一種色素組分具有抗腫瘤的作用。色素分子由一個(gè)短鏈脂肪酸(C6或C8)和一個(gè)經(jīng)聚酮體途徑合成的六酮體經(jīng)酯化縮合而成。但在色素生產(chǎn)過(guò)程中常常會(huì)有桔霉素(真菌毒素)伴隨產(chǎn)生，造成紅曲色素產(chǎn)品的不安全性。無(wú)桔霉素紅曲菌種的選育已成為紅曲界關(guān)注的熱點(diǎn)和迫切需要解決的重大問(wèn)題之一。
法國(guó)研究者Hajjaj H等用同位素示蹤法初步闡明紅曲霉色素和桔霉素的關(guān)系，二者擁有共同的四酮體前體，可能在生物合成起始階段共用同一個(gè)PKS。由于這種代謝關(guān)系的存在，應(yīng)用傳統(tǒng)育種方法來(lái)獲得無(wú)桔霉素色素高產(chǎn)菌種顯得十分困難。往往是色素高產(chǎn)時(shí)，桔霉素含量也提高；或者是阻斷了桔霉素，色素途徑也被阻斷。此外，傳統(tǒng)誘變育種方法還存在恢復(fù)突變率高的缺點(diǎn)。因此，要徹底解決桔霉素的問(wèn)題還需在了解其代謝途徑和關(guān)鍵酶編碼基因的基礎(chǔ)上，借助于途徑工程和基因工程技術(shù)對(duì)菌種進(jìn)行定向改造。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種無(wú)桔霉素紅曲霉基因工程菌的構(gòu)建方法，通過(guò)克隆紅色紅曲霉(Monascus ruber)CICC5006(購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心，編號(hào)為CICC5006)的桔霉素編碼基因，并用REMI介導(dǎo)的方法構(gòu)建和選育不產(chǎn)桔霉素的色素高產(chǎn)的紅曲霉工程菌。
本發(fā)明提供了來(lái)源于CICC5006的桔霉素編碼基因序列pksCT及其相應(yīng)的氨基酸序列。提供了含有CICC5006桔霉素基因的克隆載體pBpksCT，和敲除載體pBpksCTHyg，以及REMI介導(dǎo)的基因敲除方法。利用本發(fā)明成果，可以用于阻斷紅曲霉中桔霉素的代謝途徑，進(jìn)而從根本上解決色素生產(chǎn)過(guò)程中桔霉素伴生和污染問(wèn)題，保證紅曲產(chǎn)品的安全性，達(dá)到改善紅曲產(chǎn)品質(zhì)量和深度開(kāi)發(fā)的目的。該方法還可廣泛應(yīng)用于其它絲狀真菌和菌物的有害產(chǎn)物編碼基因的敲除和重要產(chǎn)物工程菌的構(gòu)建。
本發(fā)明的技術(shù)方案以GeneBank公布的M.purpureus桔霉素的基因序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)引物，pksCT-F5′-GGCCGCGGCCGC GCTTCTTACCAACTTCCCTT-3′，pksCT-R5′-GGCCGTTAACACCTTCAGTCCGCTATCTATC-3′。通過(guò)PCR技術(shù)，以CICC5006基因組DNA為模板，以pksCT-F、pksCT-R為引物擴(kuò)增得到4.1kb的桔霉素編碼基因片段pksCT，其包括5’端非翻譯序列，和三個(gè)功能結(jié)構(gòu)域編碼序列，分別為酮乙酰合成酶N末端結(jié)構(gòu)域(ketoacyl-synt-N terminal domain)編碼序列，酮乙酰合成酶C末端結(jié)構(gòu)域(ketoacyl-synt-C terminal domain)編碼序列，乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域(Acyl transferase domain)編碼序列。
用引物pksCT-F、pksCT-R擴(kuò)增得到的pksCT片段兩端分別引入了Not I和Hpa I酶切位點(diǎn)，經(jīng)純化回收后分別用NotI和Hpa I酶切，插入pBluescript II(-)的Not I和Sma I位點(diǎn)，構(gòu)建得到pBpksCT載體。將來(lái)自載體pCB10031.4kb的Hpa I酶切片段(該片段含有來(lái)自Aspergillus nidulans trpC基因的啟動(dòng)子和hygromycin B抗性基因hph序列)，插入載體pBpksCT的Sma I位點(diǎn)(Sma I位點(diǎn)位于pksCT基因序列內(nèi)2253bp處)構(gòu)建得到紅曲霉桔霉素敲除載體pBpksCTHyg。載體pBpksCT用于序列測(cè)定，載體pBpksCTHyg通過(guò)REMI(restrictedenzyme-mediated integration)介導(dǎo)敲除CICC5006桔霉素基因，構(gòu)建得到無(wú)桔霉素紅曲霉基因工程菌，它是一種色素高產(chǎn)工程菌。
基因pksCT的核苷酸序列如下gcttcttacc aacttccctt ttttcttcag ccagtgcttt tgtactttct cttctccagc 60gattccttcg tatacataag tgccacccaa ttgaacaaag ttgcgtccaa cctcttacat 120gatccagtat ccacttggca agtgattcct cttcaaattc tgaaagtttg agtccatttg 180caaaaggaat tttgcagttg cagcatgatt gatatgggga ttttcccatt ttttaaatca 240gaaatggcta ataagactcg accctcgtgc tcagcgagat tatttaaagg tccatcgcga 300attggtggca ttatggcgcg tcgaattgta tggaatcaat atagtggacg ttttttccga 360
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根據(jù)以上核苷酸序列，其氨基酸組成為Met Ile Asp Ser Thr Ser His Ser Asn Leu Arg Ser Lys Ala Phe1 5 10 15Ile Phe Gly Pro Gln Asp Leu Ser Phe Asp Val Arg Ser Phe Asn20 25 30Lys Leu His Ser Gln Leu Gln Asn His Gln Trp Val Leu Asp Ala35 40 45Leu Ala Ser Leu Pro Lys Leu Trp Asp Asn Phe Ala Ala Ser Asp50 55 60Gln Lys Val Gln Gln Ser Asn Thr Gly Lys Leu Leu Glu Asn Leu65 70 75Asn Ala Trp Ile Ser Ser Gly Val Ala Pro Glu Glu Ala Phe Pro80 85 90Leu Pro Asn Val Leu Leu Ser Pro Leu Val Val Ile Gly Gln Leu95 100 105Val Glu Tyr Met Thr Phe Leu Lys Ala Ala Phe Pro Asp Leu Gly110 115 120Lys Lys His Asp Leu Pro Ile Ser Ile Lys Glu Asp Thr Glu Thr125 130 135Phe Gly Leu Cys Thr Gly Thr Leu Cys Ala Phe Ala Val Ala Cys140 145 150Ser Ser Asn Ile Ala Asp Ile Gln His Tyr Gly Ala Val Ala Ala155 160 165Arg Leu Ala Met Leu Val Gly Ala Ile Val Asp Thr Glu Glu Val170 175 180Leu Ser Asp Pro Glu Gly Lys Ser Val Ser Phe Ser Ala Ser Ser185 190 195Ser Gln Phe Ala Pro Arg Pro Glu Gln Thr Leu Thr Ile Val Leu200 205 210Gln Ala Tyr Val Ser Val Ile Val Asp Gln Arg Arg Ala Thr Leu215 220 225
Thr Ala Ser Lys Lys Thr Ala Pro Ala Ile Ile Glu Arg Leu Lys230 235 240Gln Glu Gly Ala His Val Thr Ser Ile Ala Leu Ser Gly Arg Phe245 250 255His Trp Lys Lys His Gln Asp Ala Val Ser Ser Leu Ile Gln Phe260 265 270Cys Gly Leu Asp Pro Gly Leu Gln Leu Ala Asp Ala Thr Lys Met275 280 285Leu Leu Pro Ser Arg Ser Ser Ser Asp Gly Gln Tyr Ile Thr Thr290 295 300Gly Lys Leu His Glu Leu Ala Leu Arg Ala Ile Leu Leu Glu Gln305 310 315Ser Glu Trp Tyr Lys Thr Cys Arg Ile Ser Tyr Leu Ser Lys Phe320 325 330Ile Met Asp Asp Ala Ala Val Ile Cys Phe Gly Pro Glu Arg Cys335 340 345Met Pro Pro Thr Leu Ala Arg Lys Leu Gly Pro Arg Leu Thr Tyr350 355 360Val Ser Glu Ile Asp Ile Ser Ser Ser Arg Val Pro Gly Gln Leu365 370 375Leu Gly Gly Thr Gln Lys Leu Asn Leu Thr Asp Leu Pro Asp Glu380 385 390Arg Ile Ala Val Ile Gly Met Ala Cys Arg Leu Pro Gly Ala Glu395 400 405Asp His Glu Gly Phe Trp Glu Ile Leu Lys Thr Gly Gln Ser Gln410 415 420His Arg Glu Val Pro Glu Asp Arg Phe Gly Met Ala Thr Ala Trp425 430 435Arg Glu Ala Asp Lys Arg Lys Trp Tyr Gly Asn Phe Ile Asp Asn440 445 450Tyr Asp Thr Phe Asp His Lys Phe Phe Lys Lys Ser Pro Arg Glu455 460 465
Met Ala Ser Thr Asp Pro Gln His Arg Leu Met Leu Gln Val Ala470 475 480Tyr Gln Ala Val Glu Gln Ser Gly Tyr Phe Arg Asn Asn Gly Thr485 490 495Asn Arg Arg Ile Gly Cys Phe Met Gly Val Gly Asn Val Asp Tyr500 505 510Glu Asp Asn Ile Ala Cys Tyr Pro Ala Asn Ala Tyr Ser Ala Thr515 520 525Gly Asn Leu Lys Ser Phe Leu Ala Gly Lys Ile Ser His His Phe530 535 540Gly Trp Thr Gly Pro Ser Leu Thr Leu Asp Thr Ala Cys Ser Ser545 550 555Ser Ser Val Ala Ile His Gln Ala Cys Arg Ser Ile Pro Ser Gly560 565 570Glu Cys Asn Gly Ala Leu Ala Gly Gly Val Asn Val Ile Thr Ser575 580 585Pro Asn Trp Tyr His Asn Leu Ala Gly Ala Ser Phe Leu Ser Pro590 595 600Thr Gly Gln Cys Lys Pro Phe Asp Ala Lys Gly Asp Gly Tyr Cys605 610 615Arg Gly Glu Gly Val Gly Ala Val Phe Leu Lys Arg Leu Ser Ser620 625 630Ala Ile Ala Asp Gly Asp Gln Val Phe Gly Val Ile Ala Ser Thr635 640 645Lys Val Tyr Gln Asn Gln Asn Cys Thr Ala Ile Thr Val Pro Asn650 655 660Ala Ile Ser Leu Ser Glu Leu Phe Thr Asp Val Val Arg Gln Ala665 670 675Arg Leu Glu Pro Lys Asp Ile Thr Leu Val Glu Ala His Gly Thr680 685 690Gly Thr Ala Val Gly Asp Pro Ala Glu Tyr Asp Gly Ile Arg Ala695 700 705
Val Phe Gly Gly Pro Ile Arg Ser Asp Val Leu Ser Leu Gly Ser710 715 720Val Lys Gly Leu Val Gly His Thr Glu Cys Ala Ser Gly Val Val725 730 735Ser Leu Ile Lys Thr Leu Leu Met Ile Gln Gln Gly Phe Ile Pro740 745 750Pro Gln Ala Ser Phe Ser Ser Ile Asn Pro Ser Leu Asn Ala Lys755 760 765Ala Glu Glu Lys Ile Glu Ile Ser Thr Arg Leu Lys Pro Trp Asp770 775 780Ala Pro Phe Arg Ala Ala Leu Ile Asn Asn Tyr Gly Ala Ser Gly785 790 795Ser Asn Ala Ser Met Val Val Thr Gln Pro Pro Asn Leu Thr Glu800 805 810Thr Pro Ser Thr Pro Leu Pro Gly Lys Ser Tyr Pro Phe Trp Ile815 820 825Ser Ala Phe Asp Gln Gln Ser Leu Gln Ser Tyr Val Arg Arg Leu830 835 840Arg Gln Phe Leu Glu Lys His Ala Ala Asp Lys Asn Leu Ser Val845 850 855Ala Asn Leu Ser Phe Gln Val Ala Cys Gln Ser Asn Trp Ser Leu860 865 870Pro Gln Ala Leu Val Phe Ser Ala Ser Thr Lys Glu Glu Leu Asn875 880 885Arg Ala Leu Ala Ser Phe Glu Lys Gly Ser Thr Asp Phe Pro Ser890 895 900Val Gln Leu Pro Asp Pro Lys Pro Val Ile Leu Cys Phe Gly Gly905 910 915Gln Val Ser Thr Tyr Val Gly Leu Asp Gln Glu Val Tyr Asn Ser920 925 930Thr Ala Ile Leu Ser His Tyr Leu Asp Gln Cys Asp Ala Met Cys935 940 945
Leu Ser Leu Gly Leu Gln Ser Ile Tyr Pro Ala Ile Phe Gln Arg950 955 960Ser Pro Ile Glu Asp Ile Ala Gln Leu Gln Thr Ala Leu Phe Ala965 970 975Met Gln Tyr Ser Cys Ala Lys Ala Trp Ile Asp Ser Gly Leu Lys980 985 990Val991其中1-28可能是信號(hào)肽；390-631為酮乙酰合成酶N末端結(jié)構(gòu)域(ketoacyl-synt-N terminal domain)；639-806為酮乙酰合成酶C末端結(jié)構(gòu)域(ketoacyl-synt-C terminal domain)；910-991為乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域(Acyl transferasedomain)。
本發(fā)明的有益效果1.PCR方法分離、克隆CICC5006桔霉素編碼基因pksCT，長(zhǎng)為4.1kb含有三個(gè)功能結(jié)構(gòu)域。構(gòu)建敲除載體pBpksCTHyg，通過(guò)REMI方法介導(dǎo)敲除CICC5006的桔霉素基因。同時(shí)構(gòu)建了無(wú)桔霉素的紅曲霉色素生產(chǎn)工程菌。該工程菌能穩(wěn)定傳代，可用于紅曲色素的生產(chǎn)菌。并且用pksCT三個(gè)結(jié)構(gòu)域中的任一個(gè)或兩個(gè)結(jié)構(gòu)域序列也能構(gòu)建新的敲除載體，用REMI方法介導(dǎo)也能敲除CICC5006的桔霉素基因。同時(shí)也能構(gòu)建無(wú)桔霉素的紅曲霉色素生產(chǎn)工程菌。
2.REMI的方法不僅能介導(dǎo)CICC5006的轉(zhuǎn)化和基因敲除，還能應(yīng)用于其它紅曲霉種以及其它絲狀真菌如曲霉(Aspergillus)、鐮刀菌(Fusarium)、木霉(Trichoderma)等的基因轉(zhuǎn)化和基因敲除以及基因和啟動(dòng)子的捕獲。
3.利用本發(fā)明方法，可以用于阻斷紅曲霉中桔霉素的代謝途徑，進(jìn)而從根本上解決色素生產(chǎn)過(guò)程中桔霉素伴生和污染問(wèn)題，保證紅曲產(chǎn)品的安全性，達(dá)到改善紅曲產(chǎn)品質(zhì)量和深度開(kāi)發(fā)的目的。


圖1載體pBpksCT圖譜；圖2載體pBpksCTHyg圖譜；圖3桔霉素標(biāo)樣的HPLC圖譜；圖4野生型CICC5006發(fā)酵液HPLC圖譜；圖5CICC5006由REMI介導(dǎo)敲除后轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液HPLC圖譜。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1CICC 5006桔霉素編碼基因的克隆引物設(shè)計(jì)以GeneBank公布的M.purpureus桔霉素的基因序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，pksCT-F5′-GGCCGCGGCCGCGCTTCTTACCAACTTCCCTT-3′，pksCT-R5′-GGCCGTTAACACCTTCAGTCCGCTATCTATC-3′。
CICC5006染色體DNA的提取方法取1g CICC5006新鮮菌絲體置于預(yù)冷的研缽中，加入適量石英砂，加1mLCTAB抽提緩沖液，加蛋白酶K終濃度0.1mg/mL，冰上研磨成均勻的混濁液，轉(zhuǎn)入5mL離心管。加入1/10體積的10％SDS，65℃水浴25min～30min，然后冷卻至室溫。用等體積混合溶劑酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提2次，上層水相轉(zhuǎn)入新的離心管，加無(wú)DNA酶(DNase)活性的RNA酶I(RNase I)至終濃度20ug/mL，37℃溫浴30min。用等體積混合溶劑氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提1次，上層水相加1/10體積的3mol/L NaAc，輕輕混勻，再加0.6～0.8體積的異丙醇(或2倍體積無(wú)水乙醇)，用小玻璃棒挑出染色體DNA，用70％乙醇洗后揮干殘留乙醇(或室溫放置30min，6000r/min離心10min，沉淀用70％乙醇洗一次，室溫干燥)，加適當(dāng)體積的TE(pH 8.0)緩沖液(或無(wú)菌去離子水)溶解，4℃保存，或分裝后-20℃保存。
pksCT基因克隆采用PCR技術(shù)，以CICC5006基因組DNA為模板，用引物pksCT-F、pksCT-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為1.5mM MgCl2；10mM Tris-HCl，pH 8.8；50mMKCl；0.1％(w/v)Triton X-100；0.2-0.25mM dNTP；0.4μM每條引物和1-3U PfuDNA聚合酶，10-100ng基因組DNA。PCR反應(yīng)在MJ(PTC-200)PCR儀上進(jìn)行。PCR程序?yàn)?5℃預(yù)變性5min；94℃變性30s、63℃退火30s、72℃延伸4min30s，共35個(gè)循環(huán)；72℃后延伸8min。
用pksCT-F、pksCT-R為引物擴(kuò)增得到4.1kb的桔霉素編碼基因序列命名為pksCT，包括5’端非翻譯序列，和三個(gè)功能結(jié)構(gòu)域編碼序列，分別為酮乙酰合成酶N末端結(jié)構(gòu)域編碼序列，酮乙酰合成酶C末端結(jié)構(gòu)域編碼序列，乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域編碼序列。
用引物pksCT-F、pksCT-R擴(kuò)增得到的pksCT兩端分別引入Not I和Hpa I酶切位點(diǎn)，經(jīng)純化回收后分別用Not I和Hpa I酶切，插入pBluescript II(-)的Not I和Sma I位點(diǎn)，構(gòu)建得到pBpksCT載體。pBpksCT載體用于測(cè)序和敲除桔霉素基因載體的構(gòu)建。對(duì)其插入的pksCT采用Sanger鏈終止法進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定。
實(shí)施例2敲除載體的構(gòu)建將來(lái)自載體pBC10031.4kb的Hpa I酶切片段(該片段含有來(lái)自Aspergillusnidulans tupC基因的啟動(dòng)子和hygromycin B抗性基因hph序列)，插入載體pBpksCT的Sma I位點(diǎn)(Sma I位點(diǎn)位于pksCT基因序列內(nèi)2253bp處)構(gòu)建得到紅曲霉桔霉素敲除載體pBpksCTHyg。載體pBpksCTHyg通過(guò)REMI(restrictedenzyme-mediated integration)介導(dǎo)敲除CICC5006桔霉素基因，構(gòu)建無(wú)桔霉素色素高產(chǎn)工程菌。
實(shí)施例3REMI介導(dǎo)的基因敲除方法原生質(zhì)體的制備菌株CICC5006在產(chǎn)孢培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)7d～10d，收集孢子并制備成均一的孢子懸液(1×108個(gè)/ml)。取200ul涂布鋪有玻璃紙的馬鈴薯瓊脂糖固體平板，30℃培養(yǎng)30h，收集菌絲體，1mol/L MgSO4溶液洗一次。每個(gè)平板收獲的菌絲體加30ml裂解酶液(0.3％裂解酶lysing enzyme、0.1％纖維素酶cellulase和1％蝸牛酶snailase)，30℃，60r/min酶解。將原生質(zhì)體液過(guò)濾，濾液3200r/min離心10min，棄上清，預(yù)冷1.0mol/L山梨醇溶液重懸沉淀，離心。原生質(zhì)體沉淀重懸于1.0mol/L山梨醇，置冰浴備用。
REMI介導(dǎo)的基因敲除方法方法1.上述原生質(zhì)體液離心，沉淀用預(yù)冷STC溶液(1mol/L山梨醇，50mmol/L Tris·HCl(pH 8.0)，50mmol/L CaCl2)洗1-2次，再重懸于預(yù)冷STC溶液洗，并調(diào)整濃度至4×107-1×108個(gè)/ml。取100ul原生質(zhì)體液，加入線性化或未線性化敲除載體pBpksCTHyg 1-20μg，輕輕吹吸混勻。置于冰上，加限制性內(nèi)切酶Hind III(或Sma I、Sal I、Sac I)80-130U，輕輕吹吸混勻，冰浴30-60min。加1mL PTC溶液(40％PEG4000，50mmol/L Tris·HCl(pH 8.0)，50mmol/L CaCl2)，室溫40～120min。涂布含有100-150ug/ml hygromycin B的再生瓊脂糖固體培養(yǎng)基平板。30℃暗培養(yǎng)4d～5d，計(jì)轉(zhuǎn)化子數(shù)。
或方法2.上述原生質(zhì)體液離心，沉淀重懸于電穿孔轉(zhuǎn)化緩沖液(Tris·HCl pH7.510mmol/L，蔗糖600mmol/L，LiAc 1mmol/L，PEG400030％)，濃度均調(diào)整至4×107-1×108個(gè)/ml。取70ul原生質(zhì)體液，加入線性化或未線性化敲除載體pBpksCTHyg 1-20μg，輕輕吹吸混勻。置于冰上，加限制性內(nèi)切酶Hind III(或SmaI、Sal I、Sac I)80-130U，輕輕吹吸混勻，冰浴15-20min。轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0.1mm cuvette杯中，200-400V，200ohms進(jìn)行電擊，立即加入900ul預(yù)冷的復(fù)蘇液體培養(yǎng)基(含0.6mol/L蔗糖的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基)，轉(zhuǎn)入1.5ml無(wú)菌離心管，冰浴10-20min。30℃，60-100r/min培養(yǎng)2-3h。涂布含有100-150ug/ml hygromycin B的再生瓊脂糖固體培養(yǎng)基平板。30℃暗培養(yǎng)4d～5d，計(jì)轉(zhuǎn)化子數(shù)。
原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基分別在CM(0.6％酪蛋白酸水解物，0.5％蔗糖，0.6％酵母浸出物)、馬鈴薯瓊脂糖培養(yǎng)基、沙氏、Vogel’s瓊脂糖固體培養(yǎng)基中加入蔗糖，終濃度均為0.6mol/L。
實(shí)施例4轉(zhuǎn)化子的篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子篩選在含有120ug/ml hygromycin B的再生瓊脂糖固體培養(yǎng)基平板生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子經(jīng)單孢分離，轉(zhuǎn)接含有150ug/ml hygromycin B的PDA瓊脂糖固體培養(yǎng)基平板。生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子再連續(xù)轉(zhuǎn)接5代，以獲得穩(wěn)定性轉(zhuǎn)化子。
PCR方法驗(yàn)證以pksT-F(5′-GGCCGAATTCATGCGACGAAGATGTTACTGC-3′)和pksT-R(5′-GGCCGAATTCAGGTCCTGTCCAGCCGAAAT-3′)為引物，分別以轉(zhuǎn)化子和野生型菌株CICC5006基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為1.5mM MgCl2；10mM Tris-HCl，pH 8.8；50mM KCl；0.1％(w/v)Triton X-100；0.2-0.25mM dNTP；0.4μM每條引物和1-3U Pfu DNA聚合酶，10-100ng基因組DNA。PCR反應(yīng)在MJ(PTC-200)PCR儀上進(jìn)行。PCR程序?yàn)?5℃預(yù)變性5min；94℃變性30s、56℃退火30s、72℃延伸2.5min，共32個(gè)循環(huán)；72℃后延伸8min。結(jié)果，以野生型菌株基因組DNA為模板可擴(kuò)增得到0.8bp的片段，而以轉(zhuǎn)化子基因組DNA為模板時(shí)，可擴(kuò)增得到2.2kb的片段。說(shuō)明潮霉素抗性基因hph片段已插入CICC5006的桔霉素基因中，表明CICC5006中的桔霉素基因已被破壞和敲除。
桔霉素檢測(cè)—HPLC將經(jīng)PCR驗(yàn)證的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子和野生型CICC5006進(jìn)行桔霉素的測(cè)定。
發(fā)酵培養(yǎng)待測(cè)菌株在PDA斜面30℃培養(yǎng)7d～10d，收集孢子并制備成均一的孢子懸液濃度為1×107～1×108個(gè)/ml。10％的接種量接種裝有30ml馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基的250ml搖瓶，200r/min，30℃培養(yǎng)2天。以15％的接種量轉(zhuǎn)接裝有70ml YES液體培養(yǎng)基(4％蔗糖，2％酵母浸提物)的500ml搖瓶，28℃靜止培養(yǎng)14天。
HPLC檢測(cè)將發(fā)酵液與菌絲體混合研磨，取10ml研碎液，加乙醇定容至30ml，混勻，60℃水浴1h。3000r/min離心15min。用孔徑為0.45μm偏氟微孔濾膜微濾后直接用于HPLC分析。
HPLC檢測(cè)條件熒光檢測(cè)波長(zhǎng)λex＝331nm，λem＝500nm；流動(dòng)相V乙氰∶V水＝35∶65(用磷酸調(diào)pH 2.5)；出峰時(shí)間12.324min；流速1.0mL/min，柱溫28℃。
HPLC檢測(cè)結(jié)果野生型CICC5006發(fā)酵液在12.885min有峰，與桔霉素標(biāo)樣(購(gòu)自sigma公司)對(duì)照確證是桔霉素峰。而野生型CICC5006由REMI介導(dǎo)敲除后的轉(zhuǎn)化子在12.885min時(shí)為未觀察到峰，確證篩選到的轉(zhuǎn)化子中桔霉素基因已被破壞和敲除。
權(quán)利要求
1.一種無(wú)桔霉素紅曲霉基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征是(1)引物設(shè)計(jì)以GeneBank公布的M.purpureus桔霉素的基因序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)引物，pksCT-F5′-GGCCGCGGCCGCGCTTCTTACCAACTTCCCTT-3′，pksCT-R5′-GGCCGTTAACACCTTCAGTCCGCTATCTATC-3′；(2)pksCT基因克隆通過(guò)PCR技術(shù)，以CICC5006基因組DNA為模板，以pksCT-F、pksCT-R為引物擴(kuò)增得到4.1kb的桔霉素編碼基因片段命名為pksCT；(3)pBpksCT載體的構(gòu)建pksCT兩端分別引入了Not I和Hpa I酶切位點(diǎn)，經(jīng)純化回收后分別用Not I和Hpa I酶切，插入pBluescript II(-)的Not I和SmaI位點(diǎn)，構(gòu)建得到pBpksCT載體；(4)桔霉素基因敲除載體pBpksCTHyg的構(gòu)建將來(lái)自載體pCB1003 1.4kb的Hpa I酶切片段，該片段含有來(lái)自Aspergillus nidulans trpC基因的啟動(dòng)子和hygromycin B抗性基因hph序列，插入載體pBpksCT的Sma I位點(diǎn)，Sma I位點(diǎn)位于pksCT基因序列內(nèi)2253bp處，構(gòu)建得到紅曲霉桔霉素敲除載體pBpksCTHyg；(5)REMI介導(dǎo)敲除載體pBpksCTHyg通過(guò)REMI介導(dǎo)敲除CICC5006桔霉素基因，構(gòu)建得到無(wú)桔霉素紅曲霉基因工程菌。
2.如權(quán)利要求1方法所述桔霉素編碼基因pksCT，其核苷酸序列為gcttcttacc aacttccctt ttttcttcag ccagtgcttt tgtactttct cttctccagc60gattccttcg tatacataag tgccacccaa ttgaacaaag ttgcgtccaa cctcttacat 120gatccagtat ccacttggca agtgattcct cttcaaattc tgaaagtttg agtccatttg 180caaaaggaat tttgcagttg cagcatgatt gatatgggga ttttcccatt ttttaaatca 240gaaatggcta ataagactcg accctcgtgc tcagcgagat tatttaaagg tccatcgcga 300attggtggca ttatggcgcg tcgaattgta tggaatcaat atagtggacg ttttttccga 360gtatggtata tccggcgacc actatgcacc atgaatagat gcaaccttac acccttgtca 420gatgcaagat tactctatat aagctggcat gccgatgtga ttcgcaacca ctcatttgaa 480cttggctaaa gatcggcaaa cagtattctt gaagaaagga cgtgcgccga cacgcattct 540ggtccaagct cgtacagcag ggttggggac cgtccgtact tctacacgct agcctacatc 600tcatcaacgc ctgttgttgg aggcagaagc taggcgctga ggtgcaagct ttcgggatta 660tttatcggag taacttcatc cttgcgaagt aaatccttca ggatctgtac ttccgcagcc 720catatcatct atgaagcccg tatagcggaa gcacaagcga gcgggacggc tggcgaatac780caacatctga gaatatccga cacaagcaag aagagtgggg aggggcgcga ggtaactgtc840cggaataatg ttctgctgtg gattttcagt tcagcctcac aggcaggtgc agtgggcact900ccatcagact catatatagt tgctactatc cacgagatcg gcaaacggtc tcgcatggca960gtatataccg tgtttgtgtg atatacctac cagtacccta tcattttcaa tacgatttcc 1020catcggtcag cttcaacgtg accaaggacg gcagtttcaa ttgcggctat aagttatgat 1080tgactcaact tcgcactcaa atctgagatc aaaggcgttt atattcggcc cgcaggattt 1140gtctttcgat gtcaggtcct tcaacaagct tcacagccag ctccaaaatc accaatgggt 1200tcttgatgcg ctcgccagcc tgccaaagct ttgggacaac tttgccgcca gtgaccaaaa 1260ggtacagcaa tccaacactg ggaagctgct tgagaacttg aatgcatgga tttccagtgg 1320ggtagcccca gaggaggcat ttcctttgcc aaatgtgctt ctttccccgc tcgtggtcat 1380aggacagttg gttgaataca tgacttttct caaagcggca ttcccagacc taggaaagaa 1440acatgacctg cccatatcaa ttaaggaaga tacggagacc ttcggcctct gcaccggcac 1500cctgtgtgct tttgcagtag cctgctcttc caacatagcc gatattcaac attacggcgc 1560ggtagctgcg agactggcga tgttggttgg agccatcgtc gataccgaag aggtactatc 1620tgatccggaa ggaaagtcag tgagtttttc agcgtcgtgg aatagcgccg aattcagtga 1680ctcattcacc cacgtcctcg agacattccc tgatgtacgt cctcacaatt cgcaccaaga 1740ccagagcaaa cgctaaccat cgttctacag gcatatgtgt ctgtcatcgt tgaccagaga 1800cgtgcgacgt tgacggcgtc gaagaagacg gcgccagcta ttattgagcg gttgaaacaa 1860gaaggcgctc atgtcacgtc aattgcgctt tcgggacgat tccactggaa gaagcatcag 1920gatgccgtat cgagtctcat tcagttttgt ggacttgatc caggcttgca attggctgat 1980gcgacgaaga tgttactgcc tagtcgatcc agctccgatg ggcaatatat cactactgga 2040aaactccacg agctagcttt gcgggcaatt ctcttggaac agtctgagtg gtacaagaca 2100tgccgcattt cctacttgtc aaagttcatc atggacgatg cagcggtgat ttgtttcggg 2160ccggagaggt gcatgccacc aacacttgca cgaaaacttg gtccacgcct gacatacgta 2220tccgagattg atatctcatc gtcacgagta cccgggcagc ttctcggtgg aacgcaaaag 2280ctgaacctca cagacctacc cgatgagcgc atcgctgtta ttggaatggc gtgtcggcta 2340ccgggtgccg aagaccacga gggattctgg gagatcctga aaacgggtca gtcgcagcat 2400agagaggtgc ccgaagatcg gttcggcatg gcgacggcct ggcgagaagc ggacaaacgc 2460aaatggtacg ggaatttcat cgacaattac gacaccttcg atcataaatt cttcaagaag 2520agtccccgag aaatggcatc cacggaccct caacaccgcc tgatgttgca ggtagcatat 2580caggccgtcg aacaatccgg gtacttcaga aataatggta cgaatcggcg cattggatgc 2640ttcatgggtg tcggcaatgt cgattacgag gacaacattg cgtgttaccc tgccaatgcg 2700tattcggcta ccggcaacct gaagagtttt cttgctggca agattagcca ccatttcggc 2760tggacaggac ctagtctgac acttgacacg gcatgctcgt catccagtgt ggctattcac 2820caggcatgcc gttccatccc tagcggggaa tgtaacgggg cactcgccgg aggtgtcaac 2880gttataacga gtcccaactg gtatcataac ctagccggcg catctttcct cagccctact 2940ggtcaatgca agccgtttga cgctaagggg gatgggtact gcagaggtga aggtgttggt 3000gccgtgtttt tgaaacggct ttcctctgca atcgcagatg gtgaccaggt attcggtgtg 3060atcgcgagta cgaaggttta tcaaaatcag aattgtactg caatcactgt tcctaacgca 3120atatctctgt cggagctctt tacggatgtc gtgcgtcaag caaggcttga gcctaaggac 3180attactcttg ttgaggcaca cggaacagga actgcagtcg gggacccagc tgaatacgat 3240ggcattcgag ctgtctttgg aggccctata cgctccgatg ttctgtcgct aggatccgtg 3300aagggccttg tcggtcacac cgaatgcgct tcaggtgtgg tctctttgat aaagaccctc 3360cttatgatcc agcaaggctt tatcccaccc caggccagct tttcaagcat caacccttca 3420ctcaatgcaa aggctgagga aaaaatagag atctcgaccc gtttaaagcc ttgggatgca 3480cctttcagag ctgcactcat caacaactac ggtgcttccg ggtccaatgc ctccatggtt 3540gttacgcaac caccaaatct gacggagacc ccctcgacac cgttgccagg gaaaagctat 3600ccattctgga tcagtgcatt tgaccaacag agccttcaaa gttacgttcg gaggttgcgc 3660caatttctcg aaaaacatgc ggcagacaaa aacctaagcg tcgcaaactt gtctttccaa 3720gttgcttgtc aatcaaactg gtctcttccc caagccctgg tattcagtgc cagcacaaag 3780gaggagctga atagggccct tgcatctttt gagaaaggca gcacggattt cccatctgtc 3840cagcttccgg atccgaagcc cgtcatccta tgctttggag ggcaagtttc cacctatgtt 3900ggtttggatc aagaggtcta taacagcact gcgatcttga gccattactt agatcagtgc 3960gatgccatgt gcctttcgct aggcctgcaa agtatctacc cggctatttt ccaacggtcc 4020ccaatcgagg atattgctca gcttcaaaca gcgctgtttg cgatgcagta ttcctgcgcc 4080aaggcatgga tagatagcgg actgaaggtg t 4111
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述基因pksCT，其氨基酸組成為Met Ile Asp Ser Thr Ser His Ser Asn Leu Arg Ser Lys Ala Phe1 5 10 15Ile Phe Gly Pro Gln Asp Leu Ser Phe Asp Val Arg Ser Phe Asn20 25 30Lys Leu His Ser Gln Leu Gln Asn His Gln Trp Val Leu Asp Ala35 40 45Leu Ala Ser Leu Pro Lys Leu Trp Asp Asn Phe Ala Ala Ser Asp50 55 60Gln Lys Val Gln Gln Ser Asn Thr Gly Lys Leu Leu Glu Asn Leu65 70 75Asn Ala Trp Ile Ser Ser Gly Val Ala Pro Glu Glu Ala Phe Pro80 85 90Leu Pro Asn Val Leu Leu Ser Pro Leu Val Val Ile Gly Gln Leu95 100 105Val Glu Tyr Met Thr Phe Leu Lys Ala Ala Phe Pro Asp Leu Gly110 115 120Lys Lys His Asp Leu Pro Ile Ser Ile Lys Glu Asp Thr Glu Thr125 130 135Phe Gly Leu Cys Thr Gly Thr Leu Cys Ala Phe Ala Val Ala Cys140 145 150Ser Ser Asn Ile Ala Asp Ile Gln His Tyr Gly Ala Val Ala Ala155 160 165Arg Leu Ala Met Leu Val Gly Ala Ile Val Asp Thr Glu Glu Val170 175 180Leu Ser Asp Pro Glu Gly Lys Ser Val Ser Phe Ser Ala Ser Ser185 190 195Ser Gln Phe Ala Pro Arg Pro Glu Gln Thr Leu Thr Ile Val Leu200 205 210Gln Ala Tyr Val Ser Val Ile Val Asp Gln Arg Arg Ala Thr Leu215 220 225Thr Ala Ser Lys Lys Thr Ala Pro Ala Ile Ile Glu Arg Leu Lys230 235 240Gln Glu Gly Ala His Val Thr Ser Ile Ala Leu Ser Gly Arg Phe245 250 255His Trp Lys Lys His Gln Asp Ala Val Ser Ser Leu Ile Gln Phe260 265 270Cys Gly Leu Asp Pro Gly Leu Gln Leu Ala Asp Ala Thr Lys Met275 280 285Leu Leu Pro Ser Arg Ser Ser Ser Asp Gly Gln Tyr Ile Thr Thr290 295 300Gly Lys Leu His Glu Leu Ala Leu Arg Ala Ile Leu Leu Glu Gln305 310 315Ser Glu Trp Tyr Lys Thr Cys Arg Ile Ser Tyr Leu Ser Lys Phe320 325 330Ile Met Asp Asp Ala Ala Val Ile Cys Phe Gly Pro Glu Arg Cys335 340 345Met Pro Pro Thr Leu Ala Arg Lys Leu Gly Pro Arg Leu Thr Tyr350 355 360Val Ser Glu Ile Asp Ile Ser Ser Ser Arg Val Pro Gly Gln Leu365 370 375Leu Gly Gly Thr Gln Lys Leu Asn Leu Thr Asp Leu Pro Asp Glu380 385 390Arg Ile Ala Val Ile Gly Met Ala Cys Arg Leu Pro Gly Ala Glu395 400 405Asp His Glu Gly Phe Trp Glu Ile Leu Lys Thr Gly Gln Ser Gln410 415 420His Arg Glu Val Pro Glu Asp Arg Phe Gly Met Ala Thr Ala Trp425 430 435Arg Glu Ala Asp Lys Arg Lys Trp Tyr Gly Asn Phe Ile Asp Asn440 445 450Tyr Asp Thr Phe Asp His Lys Phe Phe Lys Lys Ser Pro Arg Glu455 460 465Met Ala Ser Thr Asp Pro Gln His Arg Leu Met Leu Gln Val Ala470 475 480Tyr Gln Ala Val Glu Gln Ser Gly Tyr Phe Arg Asn Asn Gly Thr485 490 495Asn Arg Arg Ile Gly Cys Phe Met Gly Val Gly Asn Val Asp Tyr500 505 510Glu Asp Asn Ile Ala Cys Tyr Pro Ala Asn Ala Tyr Ser Ala Thr515 520 525Gly Asn Leu Lys Ser Phe Leu Ala Gly Lys Ile Ser His His Phe530 535 540Gly Trp Thr Gly Pro Ser Leu Thr Leu Asp Thr Ala Cys Ser Ser545 550 555Ser Ser Val Ala Ile His Gln Ala Cys Arg Ser Ile Pro Ser Gly560 565 570Glu Cys Asn Gly Ala Leu Ala Gly Gly Val Asn Val Ile Thr Ser575 580 585Pro Asn Trp Tyr His Asn Leu Ala Gly Ala Ser Phe Leu Ser Pro590 595 600Thr Gly Gln Cys Lys Pro Phe Asp Ala Lys Gly Asp Gly Tyr Cys605 610 615Arg Gly Glu Gly Val Gly Ala Val Phe Leu Lys Arg Leu Ser Ser620 625 630Ala Ile Ala Asp Gly Asp Gln Val Phe Gly Val Ile Ala Ser Thr635 640 645Lys Val Tyr Gln Asn Gln Asn Cys Thr Ala Ile Thr Val Pro Asn650 655 660Ala Ile Ser Leu Ser Glu Leu Phe Thr Asp Val Val Arg Gln Ala665 670 675Arg Leu Glu Pro Lys Asp Ile Thr Leu Val Glu Ala His Gly Thr680 685 690Gly Thr Ala Val Gly Asp Pro Ala Glu Tyr Asp Gly Ile Arg Ala695 700 705Val Phe Gly Gly Pro Ile Arg Ser Asp Val Leu Ser Leu Gly Ser710 715 720Val Lys Gly Leu Val Gly His Thr Glu Cys Ala Ser Gly Val Val725 730 735Ser Leu Ile Lys Thr Leu Leu Met Ile Gln Gln Gly Phe Ile Pro740 745 750Pro Gln Ala Ser Phe Ser Ser Ile Asn Pro Ser Leu Asn Ala Lys755 760 765Ala Glu Glu Lys Ile Glu Ile Ser Thr Arg Leu Lys Pro Trp Asp770 775 780Ala Pro Phe Arg Ala Ala Leu Ile Asn Asn Tyr Gly Ala Ser Gly785 790 795Ser Asn Ala Ser Met Val Val Thr Gln Pro Pro Asn Leu Thr Glu800 805 810Thr Pro Ser Thr Pro Leu Pro Gly Lys Ser Tyr Pro Phe Trp Ile815 820 825Ser Ala Phe Asp Gln Gln Ser Leu Gln Ser Tyr Val Arg Arg Leu830 835 840Arg Gln Phe Leu Glu Lys His Ala Ala Asp Lys Asn Leu Ser Val845 850 855Ala Asn Leu Ser Phe Gln Val Ala Cys Gln Ser Asn Trp Ser Leu860 865 870Pro Gln Ala Leu Val Phe Ser Ala Ser Thr Lys Glu Glu Leu Asn875 880 885Arg Ala Leu Ala Ser Phe Glu Lys Gly Ser Thr Asp Phe Pro Ser890 895 900Val Gln Leu Pro Asp Pro Lys Pro Val Ile Leu Cys Phe Gly Gly905 910 915Gln Val Ser Thr Tyr Val Gly Leu Asp Gln Glu Val Tyr Asn Ser920 925 930Thr Ala Ile Leu Ser His Tyr Leu Asp Gln Cys Asp Ala Met Cys935 940 945Leu Ser Leu Gly Leu Gln Ser Ile Tyr Pro Ala Ile Phe Gln Arg950 955 960Ser Pro Ile Glu Asp Ile Ala Gln Leu Gln Thr Ala Leu Phe Ala965 970 975Met Gln Tyr Ser Cys Ala Lys Ala Trp Ile Asp Ser Gly Leu Lys980 985 990Val991
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是pksCT基因克隆采用PCR技術(shù)，以CICC5006基因組DNA為模板，用引物pksCT-F、pksCT-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為1.5mM MgCl2；10mM Tris-HCl，pH8.8；；50mM KCl；0.1％TritonX-100；0.2-0.25mM dNTP；0.4μM每條引物和1-3 U Pfu DNA聚合酶；10-100ng基因組DNA；PCR反應(yīng)在PCR儀上進(jìn)行，PCR程序?yàn)?5℃預(yù)變性5min，94℃變性30s、63℃退火30s、72℃延伸4min 30s，共35個(gè)循環(huán)，72℃后延伸8min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是桔霉素編碼基因pksCT核苷酸序列中1-1075為5’非編碼區(qū)，1076-1078為起始密碼子ATG，有兩個(gè)外顯子，分別為1076-1656和1740-4111，一個(gè)內(nèi)含子1657-1739；氨基酸序列中包括三個(gè)功能結(jié)構(gòu)域390-631為酮乙酰合成酶N末端結(jié)構(gòu)域，639-806為酮乙酰合成酶C末端結(jié)構(gòu)域，910-991為乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是REMI介導(dǎo)敲除方法方法1.取100ul原生質(zhì)體液，加入線性化或未線性化敲除載體pBpksCTHyg1-20μg，置于冰上，加限制性內(nèi)切酶Hind III或Sma I或Sal I或Sac I 80-130U，輕輕吹吸混勻，冰浴30-60min，加1mL PTC溶液，室溫40～120min，涂布含有100-150ug/ml hygromycin B的再生瓊脂糖固體培養(yǎng)基平板，30℃暗培養(yǎng)4d～5d，計(jì)轉(zhuǎn)化子數(shù)；或方法2.取70ul原生質(zhì)體液，加入線性化或未線性化敲除載體pBpksCTHyg1-20μg，置于冰上，加限制性內(nèi)切酶Hind III或Sma I或Sal I或Sac I 80-130U，輕輕吹吸混勻，冰浴15-20min，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0.1mm cuvette杯中，200-400V，200ohms進(jìn)行電擊，立即加入900ul預(yù)冷的含0.6mol/L蔗糖的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入1.5ml無(wú)菌離心管，冰浴10-20min，30℃，60-100r/min培養(yǎng)2-3h，涂布含有100-150ug/ml hygromycin B的再生瓊脂糖固體培養(yǎng)基平板，30℃暗培養(yǎng)4d～5d，計(jì)轉(zhuǎn)化子數(shù)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是用pksCT中三個(gè)功能結(jié)構(gòu)域酮乙酰合成酶N末端結(jié)構(gòu)域、、酮乙酰合成酶C末端結(jié)構(gòu)域、乙酰轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域中的任意一個(gè)或兩個(gè)編碼序列，構(gòu)建桔霉素基因敲除載體，并由REMI方法介導(dǎo)敲除CICC5006的桔霉素基因，構(gòu)建無(wú)桔霉素紅曲霉基因工程菌。
全文摘要
一種無(wú)桔霉素紅曲霉基因工程菌的構(gòu)建方法，屬于微生物基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明提供了(1)來(lái)源于CICC5006的桔霉素編碼基因pksCT序列；(2)構(gòu)建CICC5006桔霉素基因的克隆載體pBpksCT和敲除載體pBpksCTHyg；(3)REMI介導(dǎo)CICC5006桔霉素基因敲除方法。利用本發(fā)明方法，可以用于阻斷紅曲霉中桔霉素的代謝途徑，進(jìn)而從根本上解決色素生產(chǎn)過(guò)程中桔霉素伴生和污染問(wèn)題，保證紅曲產(chǎn)品的安全性，達(dá)到改善紅曲產(chǎn)品質(zhì)量和深度開(kāi)發(fā)的目的。
文檔編號(hào)C12N1/15GK1687396SQ200510039138
公開(kāi)日2005年10月26日 申請(qǐng)日期2005年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月28日
發(fā)明者諸葛健, 周禮紅, 方慧英 申請(qǐng)人:江南大學(xué)