專利名稱：一種抗嬰幼兒腹瀉病原菌免疫乳制品及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制品領(lǐng)域，尤其是涉及一種抗嬰幼兒腹瀉病原菌免疫乳制品及其生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
嬰幼兒腹瀉病是指以腹瀉為主要臨床表現(xiàn)的一組腸道傳染病，病因中多以細菌引起的感染性腹瀉，危害嚴重，可導致兒童營養(yǎng)不良，生長發(fā)育障礙。尤其在6月齡以后的嬰幼兒腹瀉發(fā)病率較高。研究發(fā)現(xiàn)，母乳不僅為嬰幼兒提供生長所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，同時也將乳中免疫活性物質(zhì)，如免疫球蛋白、免疫細胞及其細胞因子等傳給了嬰幼兒，使子代免受病原微生物的侵襲。然而，普通的母乳無顯著特異性的抗嬰幼兒腹瀉病原菌功能。如牛的常乳和初乳，雖其中初乳能夠提高嬰幼兒免疫力，但無顯著特異性的抗腹瀉病原菌活性。
從20世紀60年代起，研究者開始關(guān)注和開發(fā)，利用能夠引起人體疾病的特定抗原(病原微生物)對動物進行免疫，然后將這種含有對人病原微生物具有特異性作用抗體的免疫乳收集加工，保留其中抗體的免疫活性，制成不同形式的功能性免疫乳制品。目前，已開發(fā)出針對一些疾病如關(guān)節(jié)炎、齲齒、心血管及肺部疾病、胃腸功能紊亂、降血脂作用、抗炎癥因子作用等的功能性免疫乳制品，并獲得了多項專利。這些不同的免疫乳分別在預防齲齒及牙周炎等口腔疾病的發(fā)生；改善肺功能，減少吸煙危害；改善心血管功能，消除主動脈壁上脂肪的沉積和血栓的形成；抗破傷風毒素；抗輻射作用等方面得到了廣泛應用。但尚未有針對抗嬰幼兒胃腸道細菌性腹瀉病的功能性免疫乳制品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種含有抗嬰幼兒腹瀉病原菌抗體的功能性免疫乳制品。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備所述功能性免疫乳制品的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是使乳制品中含有抗病原性大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)、沙門氏菌(Salmonella)和志賀氏菌(Shigella)的免疫球蛋白。
本發(fā)明中所說的病原性大腸埃希氏桿菌優(yōu)選腸產(chǎn)毒素性大腸埃希氏桿菌(enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)，腸致病性大腸埃希氏桿菌(enteropathogenic Escherichia coli，EPEC)和腸侵襲性大腸埃希氏桿菌(enteroinvasive Escherichia coli，EIEC)；所說的腸產(chǎn)毒素性大腸埃希氏桿菌優(yōu)選大腸埃希氏桿菌44815、大腸埃希氏桿菌44561、大腸埃希氏桿菌44104和大腸埃希氏桿菌44439四株，所說的腸致病性大腸埃希氏桿菌優(yōu)選大腸埃希氏桿菌44336、大腸埃希氏桿菌44338、大腸埃希氏桿菌44344、大腸埃希氏桿菌44351和大腸埃希氏桿菌44155五株；所說的腸侵襲性大腸埃希氏桿菌優(yōu)選大腸埃希氏桿菌44825、大腸埃希氏桿菌44555和大腸埃希氏桿菌44553三株。
本發(fā)明中所說的病原性傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)優(yōu)選傷寒沙門氏菌50071和傷寒沙門氏菌50402；本發(fā)明中所說的病原性志賀氏菌優(yōu)選痢疾志賀氏菌(Shigelladysenteriae)、宋內(nèi)氏志賀氏菌(Shigella sonnei)、福氏志賀氏菌(Shigella flexneri)。
本發(fā)明最佳的技術(shù)方案是使乳制品中含有抗下述17種病原菌的免疫球蛋白，(1)大腸埃希氏桿菌44815，
(2)大腸埃希氏桿菌44561，(3)大腸埃希氏桿菌44104，(4)大腸埃希氏桿菌44439，(5)大腸埃希氏桿菌44825，(6)大腸埃希氏桿菌44555，(7)大腸埃希氏桿菌44553，(8)大腸埃希氏桿菌44336，(9)大腸埃希氏桿菌44338，(10)大腸埃希氏桿菌44344，(11)大腸埃希氏桿菌44351，(12)大腸埃希氏桿菌44155，(13)傷寒沙門氏菌50071，(14)傷寒沙門氏菌50402，(15)痢疾志賀氏菌51570，(16)福氏志賀氏菌51573，(17)宋內(nèi)氏志賀氏菌51334。
由于牛奶及乳制品中含有高活性和高效價的上述抗消化道病原菌抗體，則飲用該牛奶及乳制品將具有抗上述病菌的免疫功能。
本發(fā)明的抗嬰幼兒腹瀉病原菌抗體的功能性免疫牛奶及乳制品通過以下方法得到a.將病原性大腸埃希氏桿菌、沙門氏菌和志賀氏菌毒株作為抗原，分別采用4％甲醛滅活24-48小時后，按1∶1的比例制備成含菌數(shù)為106-1010/ml的混合菌液；b.將混合菌液配以佐劑，制成聯(lián)合多價疫苗；c.用制得的聯(lián)合多價疫苗對奶牛進行免疫，收集牛乳，即得到富含特異性抗體的免疫乳制品。
上述免疫奶牛的自然泌乳，即富含特異性抗體的免疫乳制品。所得到的免疫乳制品還可進一步加工，如分離純化出特異性IgG，作為乳制品添加成分，也能得到本發(fā)明所說的特異性抗體的免疫乳制品。
上述方法步驟b制備聯(lián)合多價疫苗的工藝，是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的，本發(fā)明不再做具體限定和描述。
本發(fā)明的功能性免疫乳制品，其特異性抗體活性及效價均極明顯高于普通乳，能明顯抗腹瀉病原菌感染、有效降低發(fā)病率，兼具營養(yǎng)和保健功能。用本發(fā)明提供的方法生產(chǎn)功能性免疫乳制品，工藝簡單、適于規(guī)?；a(chǎn)。


圖1是本發(fā)明免疫牛奶中特異性抗體活性水平動態(tài)變化示意圖；圖2是本發(fā)明免疫牛奶中特異性抗體效價動態(tài)變化示意圖；圖3是大鼠的血清白細胞介素-2水平變化示意圖。
具體實施例方式
實施例1從中國藥品生物制品檢定所購得17種菌毒株，包括大腸埃希氏桿菌12株、傷寒沙門氏菌2株、以及3株痢疾、福氏和宋內(nèi)氏志賀氏菌；具體如表1表1.


將上述17種致病菌毒株分別在37℃下培養(yǎng)擴增，使其菌數(shù)達106-1010/ml，用4％甲醛溶液滅活24-48小時后離心、洗滌，然后將各菌毒種液按1∶1比例混合制備成混合菌液，并配以佐劑制成聯(lián)合多價疫苗。將疫苗對泌乳高峰期乳牛進行免疫接種，2周一次，3次免疫后改為3周一次，直到泌乳結(jié)束；收集免疫牛奶，即為富含特異性抗體的功能性免疫乳制品。
在奶牛免疫期間采血樣和牛奶樣分析，對奶牛的免疫狀況進行動態(tài)觀察，方法如下酶聯(lián)免疫吸附試驗分析免疫乳特異性抗體活性和效價(1)包被活的病原菌抗原 用磷酸鹽緩沖液洗滌17種病原菌，用包被液制成107/ml懸浮液，酶聯(lián)板各孔分別加150μl，置37℃2小時，然后離心，4℃過夜；(2)封閉 用含吐溫磷酸鹽緩沖液(PBST)洗板3次，每孔分別加入200μl明膠-PBS封閉液，置37℃1小時；(3)加免疫乳樣品和酶標二抗PBST洗板3次，加入稀釋的免疫乳樣品，陰性對照只加樣品稀釋液，置37℃1小時；然后，PBST洗板3次，加入PBS稀釋的酶標兔抗牛IgG，再置37℃1小時；(4)顯色和終止反應 洗板后，加入含OPD底物反應液，37℃閉光20分鐘顯色；然后加50μl2mol/mL硫酸終止反應，(5)比色測定用酶聯(lián)儀在490nm波長下比色測定。效價定義為在490nm波長下吸光值大于陰性對照0.1時，樣品的最高稀釋度。
結(jié)果如圖1和圖2所示，免疫乳特異性抗體活性和效價經(jīng)統(tǒng)計學分析，顯著或極顯著高于普通乳(*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)。
實施例2聯(lián)合多價疫苗制備同實施例1；將疫苗對預產(chǎn)期6-8周的奶牛進行免疫，從奶牛分娩后開始收集免疫牛乳包括初乳和常乳，即為富含特異性抗體的功能性免疫乳。
實施例3抗腹瀉病原菌感染動物試驗將32只4周齡健康SD大鼠隨機分對照組、普通乳組和免疫乳組，每組10只(雌雄對半)，分別灌胃1ml/100g體重的生理鹽水、普通初乳和免疫初乳，連續(xù)12天。在灌胃第5天和第10天，分別給對照組、普通乳組和免疫乳組大鼠口服感染1ml/100g體重的大腸埃希氏菌44825和傷寒沙門氏菌50402混合病原菌液(濃度0.2×109個/ml，比例1∶1)。動物自由采食和飲水。觀察動物發(fā)病情況，并在試驗結(jié)束后宰殺大鼠取血樣分離血清，測定血清白介素-2水平。
試驗結(jié)果顯示第一次感染染病原菌后，對照組大鼠全部有嚴重腹瀉癥狀，糞便不干燥呈長條狀，甚至有的為水樣狀，且粘連顯著，顏色淡黃；普通乳組全部發(fā)病，腹瀉癥狀同對照組；免疫乳組7只大鼠無明顯癥狀變化，1只大鼠糞便不成橢圓形。
第二次感染病原菌后，對照組和普通乳組均表現(xiàn)為輕微腹瀉癥狀，且毛色暗淡，精神抑郁不活躍；免疫乳組表現(xiàn)正常，無明顯變化。
檢測各組血清免疫功能指標白細胞介素-2(IL-2)顯示，免疫乳組大鼠血清IL-2水平分別高于普通乳組和極顯著高于對照組(**P＜0.01)，而普通乳組雖高于對照組但沒有顯著差異(見圖3)，說明口服免疫乳感染腹瀉病原菌的大鼠細胞免疫功能明顯加強。試驗表明，本發(fā)明免疫乳具有明顯抗嬰幼兒腹瀉病原菌感染、有效降低發(fā)病率，提高機體免疫功能，具有保健治療作用。
權(quán)利要求
1.一種抗嬰幼兒腹瀉病原菌免疫乳制品，其特征是，該乳制品中含有抗病原性大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)、沙門氏菌(Salmonella)和志賀氏菌(Shigella)的免疫球蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所說的免疫乳制品，其特征是，其中所說的病原性大腸埃希氏桿菌是大腸埃希氏桿菌44815、大腸埃希氏桿菌44561、大腸埃希氏桿菌44104、大腸埃希氏桿菌44439、大腸埃希氏桿菌44336、大腸埃希氏桿菌44338、大腸埃希氏桿菌44344、大腸埃希氏桿菌44351、大腸埃希氏桿菌44155、大腸埃希氏桿菌44825、大腸埃希氏桿菌44555和大腸埃希氏桿菌44553；其中所說的病原性傷寒沙門氏菌是傷寒沙門氏菌50071和傷寒沙門氏菌50402；其中所說的病原性志賀氏菌是痢疾志賀氏菌51570、宋內(nèi)氏志賀氏菌51334、福氏志賀氏菌51573。
3.制備權(quán)利要求1或2所說的免疫乳制品的方法，其特征在于，包括以下步驟a.將病原性大腸埃希氏桿菌、沙門氏菌和志賀氏菌毒株作為抗原，分別采用4％甲醛滅活24-48小時后，按1∶1的比例制備成含菌數(shù)為106-1010/ml的混合菌液；b.將混合菌液配以佐劑，制成聯(lián)合多價疫苗；c.用制得的聯(lián)合多價疫苗對奶牛進行免疫，收集牛乳，即得到富含特異性抗體的免疫乳制品。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物制品領(lǐng)域，尤其是涉及一種抗嬰幼兒腹瀉病原菌免疫乳制品及其生產(chǎn)方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是使乳制品中含有抗致病性大腸埃希氏桿菌、傷寒沙門氏菌和志賀氏菌的免疫球蛋白。所說的功能性免疫牛奶及乳制品通過以下方法得到a.將致病菌毒種作為抗原，分別采用4％甲醛滅活24－48小時后，按1∶1的比例制備成含菌數(shù)為10
文檔編號A23C9/12GK1685883SQ200510039259
公開日2005年10月26日 申請日期2005年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月11日
發(fā)明者陳龍, 高偉, 許龍兵 申請人:南京師范大學