專利名稱：表達新城疫病毒HN基因的重組雞痘病毒活載體疫苗rFPV－12LSHN及其構建方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種能抵抗母源抗體干擾的表達新城疫病毒HN基因的重組雞痘病毒活載體疫苗，用于預防雞新城疫。
背景技術：
雞痘病毒(Fowlpox Virus，簡稱FPV)是繼痘苗病毒(VV)之后的一種具有獨特優(yōu)越性和廣闊應用前景的表達載體，是當今分子生物學領域的研究熱點之一。禽痘病毒屬痘病毒科，禽痘病毒屬，雞痘病毒是其代表種。FPV作為表達載體有其獨特的優(yōu)越性。其基因組龐大，長度約為VV的1.5倍，含較多的復制非必需區(qū)，可構建FPV多價和多聯疫苗；FPV具有自身的酶系統(tǒng)和調控信號，其轉錄、翻譯和裝配均發(fā)生在胞漿中，可對外源基因的表達產物進行翻譯后加工、修飾，保留其相應的生物學活性，誘導機體產生體液免疫和細胞免疫；與VV相比，FPV的宿主范圍較窄，僅感染禽類，不易散毒，對哺乳動物和人類無潛在的威脅；重組病毒的構建方法相對簡單；表達水平較高；便于對重組雞痘病毒免疫雞群和自然感染雞群進行鑒別。
近十幾年來，FPV載體疫苗的研究已取得了很大進展，有多種病原體的保護性抗原基因在FPV中得以成功表達，如NDV的F和HN基因、IBDV的VP2/VP2-3-4基因、AIV的HA/NA/NP基因、MDV的gB/pp38基因、IBV的S1基因、ALV的env基因、REV的env基因等，并在SPF雞上有很高甚至100％的保護率(Boyle D B，Heine H G.Recombinant fowlpox virus vaccines for poultry.Immunol.Cell Biol，1993，71391-397.)。但迄今為止，重組FPV活載體疫苗在國內外尚未獲得廣泛應用。究其原因，主要是重組FPV疫苗的免疫效力在很大程度上受到商品雞所攜帶的母源抗體的干擾。我國商業(yè)雞群攜帶母源抗體的情況更為嚴重，因為在我國的養(yǎng)禽業(yè)中，種雞一般要多次接種針對NDV、AIV等病原體的疫苗，包括能產生高抗體滴度的油乳劑滅活疫苗。因此，我國市場上的商品雞普遍帶有相當高的母源抗體，其中ND的母源抗體HI效價平均可達28-29，這無疑給疫苗，尤其弱毒苗和活載體疫苗的早期應用和疫情監(jiān)測帶來很大的困難。重組FPV受到針對FPV的母源抗體和針對外源基因表達產物的母源抗體的雙重干擾，而且針對外源蛋白的母源抗體也會干擾其免疫效力。
許多研究已經證明，針對外源蛋白的母源抗體會干擾重組FPV的免疫效力，而且母源抗體越高干擾越大。Taylor等發(fā)現，在有較高ND母源抗體的試驗雞上，共表達NDVF和HN基因的重組FPV抵抗NDV強毒攻擊的免疫保護率較在SPF雞上有所下降(Taylor J，Christensen L，Gettig R，et al.Efficacy of arecombinant fowl pox-based Newcastle disease virus vaccine candidate againstvelogenic and respiratory challenge.Avian Dis，1996，40173-80.)。本室丁煒東、韋棟平等的試驗結果也表明，重組FPV的免疫效力因存在針對NDV或AIV的母源抗體而受到很大的影響(丁煒東，曹麗萍，張體銀等.表達新城疫病毒F和HN基因重組雞痘病毒疫苗的遺傳穩(wěn)定性和免疫效力試驗.中國獸醫(yī)雜志，2005，4110-14.韋棟平，劉玉良，邵衛(wèi)星等.共表達新城疫F基因和H9亞型禽流感病毒HA基因的重組雞痘病毒.微生物學報，2004，4414-18.)。
關于針對FPV的抗體是否影響重組FPV的免疫效力，目前尚無一致的看法。Taylor等對1日齡帶有FPV母源抗體的試驗雞免疫共表達NDV F和HN基因的重組FPV，免疫后28攻擊NDV強毒，保護率達94％-100％，表明針對FPV的母源抗體幾乎不影響重組病毒抵抗NDV攻擊的免疫效力(Taylor J，Christensen L，Gettig R，et al.Efficacy of a recombinant fowl pox-based Newcastledisease virus vaccine candidate against velogenic and respiratory challenge.AvianDis，1996，40173-80.)。而喬傳玲等通過在SPF雞上預先感染FPV，然后接種重組FPV，來探討FPV抗體對重組病毒的免疫效力是否存在影響。結果表明，FPV與表達AIV HA和NA基因的重組FPV同時接種和間隔4周接種時，FPV抗體對重組疫苗的免疫效力不構成影響，對高致病性AIV的保護率為100％。而間隔時間為1、2、3周時，重組疫苗的免疫效力則受到不同程度的影響(喬傳玲，李呈軍，于康震等.禽痘病毒感染對禽流感病毒疫苗免疫效力的影響.中國預防獸醫(yī)學報，2005，27154-156.)。在此之前，Swayne等也對此進行了研究，首先用FPV免疫12周齡雞，然后在間隔4、9、15周后分別用表達AIV HA基因的重組FPV進行免疫，免疫3周后用高致病性AIV攻擊，結果重組病毒未能提供堅強的免疫保護(Swayne D E，Beck J R and Kinney N.Failure of arecombinant fowlpox virus vaccine containing an avian influenza hemagglutiningene to provide consistent protection against influenza in chickens permmunizedwith a fowl pox vaccine.Avian Dis，2000，44132-137.)。
目前，克服母源抗體的干擾作用主要有DNA疫苗免疫、共表達細胞因子、粘膜免疫以及利用新的佐劑和載體釋放系統(tǒng)等幾種途徑，但尚有許多理論和技術問題需要解決，沒有從根本上解決重組FPV受母源抗體干擾這一難題。

發(fā)明內容
本發(fā)明的第一個目的在于發(fā)明一種表達新城疫病毒HN基因的重組雞痘病毒活載體疫苗rFPV-12LSF，該疫苗具有較強的抵抗新城疫母源抗體干擾的能力，從而克服表達新城疫病毒HN基因的重組雞痘疫苗在應用過程中受母源抗體干擾這一難題。
本發(fā)明表達新城疫病毒HN基因的重組雞痘病毒活載體疫苗rFPV-12LSHN，于2005年6月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其保藏號為CGMCC NO1394。
本發(fā)明的第二個目的在于發(fā)明一種表達新城疫病毒HN基因的重組雞痘病毒活載體疫苗rFPV-12LSHN的構建方法利用FPV表達載體p12-18，將新城疫病毒HN基因通過同源重組插入到282E4株新鑒定的雞痘病毒復制非必需區(qū)FPV1-2，從而獲得表達新城疫病毒HN基因的重組雞痘病毒活載體疫苗rFPV-12LSHN。
本發(fā)明克服了母源抗體干擾是重組FPV疫苗研究領域亟待解決的一個難題。本發(fā)明與本室原來構建的以復制非必需區(qū)FPV7S為插入位點構建的表達新城疫病毒HN基因的重組FPV相比，該疫苗在高母源抗體商品雞上具有較強的抵抗新城疫母源抗體干擾的能力。
本發(fā)明的具體技術方案如下(1)表達新城疫病毒HN基因的轉移載體的構建將ZJ1株新城疫病毒(NDV)的HN基因插入表達載體p12-18，獲得表達NDV HN基因的重組FPV轉移載體p12LSHN。用堿裂解法制備轉移載體的質粒DNA并以PEG純化質粒DNA。
(2)表達新城疫病毒HN基因的重組雞痘病毒的構建將(1)中構建的轉移載體p12LSHN與282E4株FPV共轉染CEF。
具體方法是在35mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)CEF，使形成60％的單層后以0.1MOI的282E4株FPV感染，37℃吸附2小時后傾去上清培養(yǎng)基，加1ml含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基；將1μg轉移載體溶解于50μl的無血清DMEM培養(yǎng)基；取5μl轉染試劑FuGENETM6緩慢加入到100μl無血清DMEM培養(yǎng)基中，兩者混勻置室溫作用15min，然后緩緩滴加至上述CEF中，邊滴邊混勻，置37℃培養(yǎng)3小時后補加1ml含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基；12h后更換為含1％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置37℃繼續(xù)培養(yǎng)；CEF產生80％病變后收獲病毒，反復凍融3次，低速離心去除細胞碎片，上清用于重組病毒的篩選和純化。將上清稀釋液接種60mm平皿上長成致密單層的CEF，37℃培養(yǎng)約72h，待出現較多病毒蝕斑后，用含有200μg/ml X-gal的營養(yǎng)瓊脂覆蓋，待出現藍色蝕斑后挑取藍色蝕斑，用吸管將其吸出，轉入0.5ml細胞培養(yǎng)維持液中，凍融3次，低速離心去除細胞與瓊脂碎片，取上清感染次代細胞。在60mm平皿中重復進行以上步驟后，于96孔板上篩選數次，直至在X-gal存在的條件下，重組病毒在CEF上所形成的蝕斑全部呈藍色。即可得到純化的重組病毒，即282E4株重組病毒rFPV-12LSHN。
重組病毒中外源基因的插入和表達可通過PCR擴增外源基因和間接免疫熒光試驗予以鑒定。
(3)新構建的表達新城疫病毒HN基因的重組雞痘病毒rFPV-12LSHN與原有的表達新城疫病毒HN基因的重組雞痘病毒rFPV-HN在有母源抗體商品雞上的免疫效力比較試驗將1日齡商品蛋雞隨機分組，52只/組，進行隔離飼養(yǎng)。1日齡ND的HI抗體效價平均約為28。于10日齡頸部皮下分別接種rFPV-12LSHN、rFPV-HN和野生型雞痘病毒FPV282，105PFU/只，同時設ND油苗對照組，0.2ml/只。免疫后28d進行滴鼻攻毒，每只試驗雞接種105ELD50的F48E8株NDV強毒。觀察14d，記錄發(fā)病死亡情況。對免疫效力試驗結果進行統(tǒng)計分析。
在高母源抗體的商品雞上，本發(fā)明新構建的表達新城疫病毒HN基因的重組雞痘病毒rFPV-12LSHN、原有的表達新城疫病毒HN基因的重組雞痘病毒rFPV-HN和ND油苗保護率分別為85.4％、50.0％和83.3％，rFPV-12LSHN與rFPV-HN的保護率之間差異顯著，與常規(guī)油苗的免疫效力相當，表明本發(fā)明新構建的表達新城疫病毒HN基因的重組雞痘病毒rFPV-12LSHN具有較強的抵抗母源抗體干擾的能力。


圖1為轉移載體p12LSHN的構建過程圖。
圖2為三個不同組免疫保護率圖表。
具體實施例方式
本發(fā)明涉及的FPV(雞痘病毒)表達載體p12-18，于2005年6月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO1385，其長度為10450bp，該載體以雞痘病毒新鑒定的復制非必需區(qū)FPV1-2為外源基因插入位點，是一個含有雞痘病毒復制非必需區(qū)側翼區(qū)FPV1和FPV2的表達載體，FPV1的核苷酸長度為1863bp，FPV2的核苷酸長度為1554bp。本發(fā)明涉及的新城疫病毒HN基因的核苷酸長度為1662bp，序列發(fā)表于GenBankh上，序列號為AF431744。
構建FPV(雞痘病毒)表達載體p12-18的具體步驟是1、定向克隆法篩選雞痘病毒的新復制非必需區(qū)FPV1-2病毒的增殖及基因組的提取按常規(guī)方法取9-10日齡的SPF雞胚，制成CEF單層。接種282E4株(中國疫苗株)FPV，在5％CO2，37℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待病變達80％以上棄去原培養(yǎng)基，細胞用PBS洗兩遍后，加入適量PBS，用吸管將細胞吹下。低速離心棄上清，用少量PBS(50ml的細胞培養(yǎng)瓶用200μl)懸浮。提取方法參照High PurePCR Template Preparation Kit說明書進行1.5ml的Eppendorf管中依次加入上述200μl樣品、200μl Binding Buffer和40μl Proteinase K，混勻；72℃作用10min后，加入100μl異丙醇；將上述混合物混勻后加入特定的離心管，8000rpm離心1min，棄濾液；然后加入500μl Washing Buffer，離心，洗滌兩遍；13000rpm離心10s，去除殘余的液體；加入200μl Elution Buffer(70℃預熱)，8000rpm 1min離心至干凈的Eppendorf管中，所得即為282E4株FPV基因組DNA。
PCR擴增FPV復制非必需區(qū)FPV1-2的側翼區(qū)FPV1和FPV2
根據已發(fā)表的美國致病株雞痘病毒FPV的基因組全序列(AF198100)設計兩對引物，引物表達式P1 5’-TCTGAGCTCCGTAAGACTTATCCATACCGAG-3’P2 5’-TCTAGATCTGCTAGCGTTTCTAAGATCATCATGTCCTAC-3’P3 5’-GGCAAGCTTCTGTAGTAGTTACTACATACGCAG-3’P4 5’-CACCTCGAGAACAGAAATAGCTCCTCTCATAC-3’P1位于ORF077的內部，P2和P3均位于ORF073與ORF074兩個ORF之間的間隔區(qū)，P4位于ORF071的內部。P1和P2跨幅約為1880bp，即FPV1，P3和P4跨幅約為1570bp，即FPV2。
兩對引物分別用于擴增雞痘病毒FPV復制非必需區(qū)各自的兩個側翼區(qū)(FPV1和FPV2)。引物中加入了便于克隆操作的限制性酶切位點和保護性堿基。以282E4株FPV的基因組DNA為模板，用高保真PCR系統(tǒng)(Expand HighFidelity PCR System)擴增FPV復制非必需區(qū)側翼區(qū)FPV1和FPV2并進行序列測定。
2、構建載體pP12L(1)用Hind III+Xho I雙酶切克隆載體pSK和上述回收的FPV2片段，37℃消化2h以后，電泳并回收約3.0kb的載體片段和約1.57kb的FPV2。然后按一定比例進行連接成pSKP2，轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，挑取白色菌落提質粒并以Hind III+Xho I雙酶切(20μl體系)，37℃消化1.5h以后，加4μl 6×Loadingbuffer，用瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。陽性質粒命名為pSKP2。
(2)將pSKP2和FPV1分別用BamH I+Sac I、Bgl II+Sac I進行雙酶切，37℃消化2h后，電泳并回收約4.57kb的載體片段和約1.88kb的FPV1片段，按一定比例連接形成pSKP1P2，轉化宿主菌DH5α，然后挑取白色菌落提質粒并用Hind III+Sac I雙酶切(20μl體系)，加4μl 6×Loading buffer，用瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，陽性質粒命名為pSKP1P2。pSKP1P2分別以Hind III+Xho I和Hind III+Sac I雙酶切后電泳，可見預期目的條帶FPV2和FPV1，條帶大小分別約為1.57kb和1.93kb(其中包括約50bp的酶切位點)，表明FPV1和FPV2已成功插入載體。
(3)將pSKP1P2和pFG1175-1分別用Nhe I、Xba I進行單酶切，37℃消化2h后，電泳并回收約6.45kb的載體片段和約3.80kb的P11-LacZ標記基因表達框，按一定比例連接構成pP12L，轉化宿主菌DH5α，然后挑取藍色菌落提質粒并用Sac I進行酶切(20μl體系)，37℃消化1.5h后，加4μl 6×Loading buffer，用瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。篩選P11-LacZ標記基因表達框正向插入的陽性質粒，陽性質粒命名為pP12L。
3、FPV復制非必需區(qū)的篩選將純化的載體質粒pP12L與282E4株FPV共轉染CEF，轉染試劑為FuGENETM6 Transfection Reagent，轉染及重組病毒的篩選純化按照轉染試劑說明書進行。在35mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)CEF，使形成60％的單層后以0.1MOI的282E4株FPV感染，37℃吸附2小時后傾去上清培養(yǎng)基，加1ml含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基；將1μg載體質粒pP12L溶解于50μl的無血清DMEM培養(yǎng)基；取5μl轉染試劑FuGENETM6緩慢加入到100μl無血清DMEM培養(yǎng)基中，兩者混勻置室溫作用15min，然后緩緩滴加至上述CEF中，邊滴邊混勻，置37℃培養(yǎng)3小時后補加1ml含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基；12h后更換為含1％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置37℃繼續(xù)培養(yǎng)；CEF產生80％病變后收獲病毒，反復凍融3次，低速離心去除細胞碎片，上清用于重組病毒的篩選和純化。將上清稀釋液接種60mm平皿上長成致密單層的CEF，37℃培養(yǎng)約72h，待出現較多病毒蝕斑后，用含有200μg/ml X-gal的營養(yǎng)瓊脂覆蓋，待出現藍色蝕斑后挑取藍色蝕斑，見圖3，用吸管將其吸出，轉入0.5ml細胞培養(yǎng)維持液中，凍融3次，低速離心去除細胞與瓊脂碎片，取上清感染次代細胞。在60mm平皿中重復進行以上步驟后，于96孔板上篩選數次，直至在X-gal存在的條件下，重組病毒在CEF上所形成的蝕斑全部呈藍色。即可得到純化的重組病毒。重組病毒rFPV-12LSF的獲得表明，預先假定的復制非必需區(qū)均為真正的FPV復制非必需區(qū)，命名為FPV1-2。
4、復制非必需區(qū)的遺傳穩(wěn)定性試驗重組雞痘病毒接種CEF，在5％CO2，37℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2-3天后待病變達80％以上后收獲，反復凍融3次，用于下次擴增，連續(xù)傳10代?？瞻哂嫈岛蟊４嬗?70℃冰箱備用。分別取重組病毒的0、5、10代以10-3、10-4、10-5、10-6稀釋，接種生長在24孔板上單層次代CEF，100μl/孔。待出現單個蝕斑后，覆蓋含200μg/ml X-gal的瓊脂，37℃，CO2箱中培養(yǎng)1-2天觀察蝕斑純度。結果發(fā)現所有病毒蝕斑均呈藍色。
用PBS吹下擴增的三個代次重組雞痘病毒的單層細胞，以High Pure PCRTemplate Preparation Kit(寶靈曼公司)提取核酸模板DNA。按常規(guī)方法針對LacZ基因部分片段進行PCR并測序，檢測外源基因在重組FPV傳代過程中是否發(fā)生變異，結果序列沒有發(fā)生任何變異。
以上試驗表明，重組病毒基因組中的LacZ基因能夠穩(wěn)定遺傳和表達，同時也證明了篩選的FPV復制非必需區(qū)FPV1-2具有良好的遺傳穩(wěn)定性。
5、FPV(雞痘病毒)表達載體p12-18的構建將pN11S用Hind III+SmaI進行雙酶切，37℃消化2h后，電泳并回收約200bp的含MCS的Ps啟動子，與同時用Hind III+Sma I雙酶切的載體pP12L按一定比例連接構建雞痘病毒表達載體p12-18，將該載體轉化宿主菌DH5α，然后挑取藍色菌落提質粒，并用Hind III+Sma I雙酶切(20μl體系)，加4μl6×Loading buffer，用瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，陽性質粒分別命名為p12-18。
經測序，FPV表達載體p12-18的長度為10450bp，該載體以雞痘病毒新鑒定的復制非必需區(qū)FPV1-2為外源基因插入位點，是一個含有雞痘病毒復制非必需區(qū)側翼區(qū)FPV1和FPV2的表達載體。
一、表達新城疫病毒HN基因的轉移載體的構建質粒pTHN用Bgl II+Xho I雙酶切，回收約1.7kb的HN片段，與經BamHI+Sal I雙酶切的表達載體p12-18進行連接，轉化宿主菌DH5α，然后挑取藍色菌落提質粒，并用Pst I酶切(20μl體系)，加4μl 6×Loading buffer，用瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。陽性質粒命名為p12LSHN。pN11SHN具體構建過程見圖1。
用堿裂解法制備轉移載體的質粒DNA并以PEG純化質粒DNA。
二、表達新城疫病毒HN基因的重組雞痘病毒的構建將純化的載體質粒p12LSHN與282E4株FPV共轉染CEF，轉染試劑為FuGENETM6 Transfection Reagent，轉染及重組病毒的篩選純化按照轉染試劑說明書進行。在35mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)CEF，使形成60％的單層后以0.1MOI的282E4株FPV感染，37℃吸附2小時后傾去上清培養(yǎng)基，加1ml含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基；將1μg轉移載體溶解于50μl的無血清DMEM培養(yǎng)基；取5μl轉染試劑FuGENETM6緩慢加入到100μl無血清DMEM培養(yǎng)基中，兩者混勻置室溫作用15min，然后緩緩滴加至上述CEF中，邊滴邊混勻，置37℃培養(yǎng)3小時后補加1ml含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基；12h后更換為含1％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置37℃繼續(xù)培養(yǎng)；CEF產生80％病變后收獲病毒，反復凍融3次，低速離心去除細胞碎片，上清用于重組病毒的篩選和純化。將上清稀釋液接種60mm平皿上長成致密單層的CEF，37℃培養(yǎng)約72h，待出現較多病毒蝕斑后，用含有200μg/ml X-gal的營養(yǎng)瓊脂覆蓋，待出現藍色蝕斑后挑取藍色蝕斑，用吸管將其吸出，轉入0.5ml細胞培養(yǎng)維持液中，凍融3次，低速離心去除細胞與瓊脂碎片，取上清感染次代細胞。在60mm平皿中重復進行以上步驟后，于96孔板上篩選數次，直至在X-gal存在的條件下，重組病毒在CEF上所形成的蝕斑全部呈藍色。即可得到純化的重組病毒，即282E4株重組病毒rFPV-12LSHN。
重組病毒的0、5、10代接種24孔板上的單層次代CEF，待出現單個蝕斑后，覆蓋含200μg/ml X-gal的瓊脂，發(fā)現所有病毒蝕斑均呈藍色。而間接免疫熒光試驗發(fā)現所有病毒蝕斑均呈現特異性熒光，陰性對照組無特異性熒光。對5、10代重組病毒中的HN基因進行PCR，結果均可以擴增出1.7Kb的目的條帶，與預期值相符。測序結果顯示，所測序列沒有發(fā)生任何變異。以上試驗表明，重組病毒基因組中的HN基因均能夠穩(wěn)定地遺傳和表達。
三、重組雞痘病毒rFPV-12LSHN在高母源抗體商品雞上的免疫效力試驗將1日齡商品蛋雞隨機分組，52只/組，進行隔離飼養(yǎng)。1日齡ND的HI抗體效價平均約為28。于10日齡頸部皮下分別接種rFPV-12LSHN、rFPV-HN和野生型雞痘病毒FPV282，105PFU/只，同時設ND油苗對照組，0.2ml/只。免疫后28d進行滴鼻攻毒，每只試驗雞接種105ELD50的F48E8株NDV強毒。觀察14d，記錄發(fā)病死亡情況。
商品雞10日齡時ND母源抗體的平均HI效價為2(5.0±0.6)。由表1和表2可見，組病毒rFPV-12LSHN、rFPV-HN和ND油苗保護率分別為85.4％、50.0％和83.3％，可見重組病毒rFPV-12LSHN與rFPV-HN的保護率之間差異顯著，與常規(guī)油苗的免疫效力相當，表明該重組病毒具有較強的地抵抗母源抗體干擾的能力。(圖2中，1為rFPV-N11SHN，2為rFPV-12LSHN，3為ND油苗)表1重組FPV在l0日齡商品雞上的免疫效力試驗結果

ND HI效價＝平均HI效價(log2X)±標準差；FPV282282E4株野生型雞痘病毒免疫保護率＝(攻毒對照組死亡率-疫苗免疫組死亡率)/攻毒對照組死亡率×100％a、b差異顯著(P＜0.05)。
權利要求
1.表達新城疫病毒HN基因的重組雞痘病毒活載體疫苗rFPV-12LSHN，其特征在于其保藏號為CGMCC NO1394。
2.表達新城疫病毒HN基因的重組雞痘病毒活載體疫苗rFPV-12LSHN的構建方法，其特征在于利用FPV表達載體p12-18，將新城疫病毒HN基因通過同源重組插入到282E4株新鑒定的雞痘病毒復制非必需區(qū)FPV1-2，從而獲得了能抵抗母源抗體干擾的表達新城疫病毒HN基因的重組雞痘病毒活載體疫苗rFPV-12LSHN。
3.根據權利要求2所述表達新城疫病毒HN基因的重組雞痘病毒活載體疫苗rFPV-12LSHN的構建方法，其特征在于包括以下步驟(1)表達新城疫病毒HN基因的轉移載體的構建將ZJ1株新城疫病毒(NDV)的HN基因插入表達載體p12-18，獲得表達NDV HN基因的重組FPV轉移載體p12LSHN，用堿裂解法制備轉移載體的質粒DNA并以PEG純化質粒DNA；(2)表達新城疫病毒HN基因的重組雞痘病毒的構建將(1)中構建的轉移載體p12LSHN與282E4株FPV共轉染CEF。
4.根據權利要求2所述表達新城疫病毒HN基因的重組雞痘病毒活載體疫苗rFPV-12LSHN的構建方法，其特征在于步驟(2)中，在35mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)CEF，使形成60％的單層后以0.1MOI的282E4株FPV感染，37℃吸附2小時后傾去上清培養(yǎng)基，加1ml含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基；將1μg轉移載體溶解于50μl的無血清DMEM培養(yǎng)基；取5μl轉染試劑FuGENETM6緩慢加入到100μl無血清DMEM培養(yǎng)基中，兩者混勻置室溫作用15min，然后緩緩滴加至上述CEF中，邊滴邊混勻，置37℃培養(yǎng)3小時后補加1ml含10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基；12h后更換為含1％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置37℃繼續(xù)培養(yǎng)；CEF產生80％病變后收獲病毒，反復凍融3次，低速離心去除細胞碎片，上清用于重組病毒的篩選和純化，將上清稀釋液接種60mm平皿上長成致密單層的CEF，37℃培養(yǎng)約72h，待出現較多病毒蝕斑后，用含有200μg/ml X-gal的營養(yǎng)瓊脂覆蓋，待出現藍色蝕斑后挑取藍色蝕斑，用吸管將其吸出，轉入0.5ml細胞培養(yǎng)維持液中，凍融3次，低速離心去除細胞與瓊脂碎片，取上清感染次代細胞，在60mm平皿中重復進行以上步驟后，于96孔板上篩選數次，直至在X-gal存在的條件下，重組病毒在CEF上所形成的蝕斑全部呈藍色，即可得到純化的重組病毒，即表達新城疫HN基因的重組雞痘病毒活載體疫苗rFPV-12LSHN。
全文摘要
表達新城疫病毒HN基因的重組雞痘病毒活載體疫苗rFPV－12LSHN及其構建方法，涉及一種能抵抗母源抗體干擾的表達新城疫病毒HN基因的重組雞痘病毒活載體疫苗，用于預防雞新城疫。利用FPV表達載體p12－18，將新城疫病毒HN基因通過同源重組插入到282E4株新鑒定的雞痘病毒復制非必需區(qū)FPV1－2，從而獲得了表達新城疫病毒HN基因的重組雞痘病毒活載體疫苗rFPV－12LSHN。本發(fā)明與原來構建的以復制非必需區(qū)FPV7S為插入位點構建的表達新城疫病毒HN基因的重組FPV相比，該疫苗在高母源抗體商品雞上具有較強的抵抗新城疫母源抗體干擾的能力。
文檔編號C12N15/33GK1769464SQ200510041179
公開日2006年5月10日 申請日期2005年7月22日 優(yōu)先權日2005年7月22日
發(fā)明者劉秀梵, 孫蕾, 陳素娟, 劉武杰 申請人:揚州大學