專(zhuān)利名稱(chēng)：快速檢測(cè)it15基因cag重復(fù)序列動(dòng)態(tài)突變的引物及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的臨床檢測(cè)技術(shù)，具體涉及一種快速檢測(cè)IT15基因CAG重復(fù)序列動(dòng)態(tài)突變的引物及方法，該檢測(cè)結(jié)果可用于臨床輔助診斷亨廷頓舞蹈病。
背景技術(shù)：
亨廷頓舞蹈病(Huntington’s Disease，HD)是一種以影響運(yùn)動(dòng)功能為主的神經(jīng)退行性疾病，屬常染色體顯性遺傳性疾病。HD的癥狀通常在45歲以后出現(xiàn)，主要病癥是不受控制的大肢體運(yùn)動(dòng)，伴有認(rèn)知障礙和精神異常。導(dǎo)致該疾病的突變基因IT15在1993年被發(fā)現(xiàn)。該基因位于人第4號(hào)染色體上，它編碼一個(gè)分子量為350kD的蛋白質(zhì)，被命名為亨廷頓蛋白(Huntingtin，Htt)。IT15基因由67個(gè)外顯子構(gòu)成，在外顯子起始密碼子ATG下游第17個(gè)密碼子后有一段三核苷酸CAG的重復(fù)序列，HD即由CAG重復(fù)序列的異常擴(kuò)展突變引起。該病的發(fā)病率在北美和歐洲約為10萬(wàn)分之5。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前在我國(guó)幾個(gè)地區(qū)發(fā)現(xiàn)了48個(gè)家系。鑒于臨床診斷及分子診斷較困難，我國(guó)尚無(wú)系統(tǒng)的流行病學(xué)調(diào)查。
舞蹈樣疾病種類(lèi)較多，給HD的確診增加了難度。目前檢測(cè)CAG重復(fù)數(shù)已成為對(duì)HD確診的主要依據(jù)。全美醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)學(xué)會(huì)根據(jù)對(duì)歐美人群的大樣本檢測(cè)所得的分析結(jié)果提出以下診斷標(biāo)準(zhǔn)CAG重復(fù)數(shù)≤26時(shí)為正常等位基因，不引起疾?。籆AG重復(fù)數(shù)在27～35時(shí)為可引起突變的等位基因，不會(huì)引起疾病，但在減數(shù)分裂時(shí)易發(fā)擴(kuò)展突變，使后代患??；CAG重復(fù)數(shù)在36～39時(shí)為不完全外顯的HD等位基因，攜帶者可能發(fā)病也可能不發(fā)病；CAG重復(fù)數(shù)≥40時(shí)為完全外顯的HD等位基因，攜帶個(gè)體必然會(huì)患病。然而，由于IT15基因CAG重復(fù)序列的C/G含量高達(dá)67％，極大地增加了該序列擴(kuò)增的難度，限制了對(duì)我國(guó)HD流行病學(xué)的調(diào)查。
由于CAG重復(fù)序列的GC含量很高，擴(kuò)增困難，為提高DNA解鏈水平，在PCR反應(yīng)體系中添加有10％DMSO。為提高敏感性，以往測(cè)定CAG重復(fù)數(shù)時(shí)需在做基因擴(kuò)增時(shí)用同位素標(biāo)記，并在聚丙烯酰胺凝膠電泳后進(jìn)行放射自顯影。由于采用國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道的引物和條件，難以擴(kuò)增出目的條帶，加上同位素操作需要較高的實(shí)驗(yàn)條件，而且同位素操作存在風(fēng)險(xiǎn)與復(fù)雜性，因此，導(dǎo)致現(xiàn)有的亨廷頓舞蹈病IT15基因突變檢測(cè)技術(shù)難以推廣普及，給普通醫(yī)院開(kāi)展臨床應(yīng)用帶來(lái)困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種檢測(cè)IT15基因CAG重復(fù)序列動(dòng)態(tài)突變的引物及方法，其目的在于建立一個(gè)簡(jiǎn)便易行的擴(kuò)增CAG重復(fù)序列的快速檢測(cè)方法，為提高生物臨床檢測(cè)水平，普及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明引物采用的技術(shù)方案是一種快速檢測(cè)IT15基因CAG重復(fù)序列動(dòng)態(tài)突變的引物，由對(duì)應(yīng)第一步PCR擴(kuò)增的第一對(duì)引物和對(duì)應(yīng)第二步PCR擴(kuò)增的第二對(duì)引物組成；所述第一對(duì)引物采用以下四對(duì)引物中的任意一對(duì)引物(I)、外源有義5’CTTGCTGTGTGAGGCAGAACCTG-3’外源反義5’GGCTGAGGAAGCTGAGGAG-3’(II)、外源有義5’TTCACACACAGCTTCGC-3’外源反義5’CCTCCTCTCGAAGTGTCCCG-3’(III)、外源有義5’GGCAGAGTCCGCAGGCTAG-3’外源反義5’AAGTTCCATAGCGATGCCCAG-3’(IV)、外源有義5’CTAGGGCTGTCAATCATGCTGG-3’外源反義5’AAGTTCCATAGCGATGCCCAG-3’所述第二對(duì)引物采用以下兩對(duì)引物中的任意一對(duì)引物(I)、內(nèi)源有義5’GACCCTGGAAAAGCTGATG-3’內(nèi)源反義5’GGCTGAGGAAGCTGAGGAG-3’(II)、內(nèi)源有義5’ATGAAGGCCTTCGAGTCCCTCAAGTCCTTC-3’內(nèi)源反義5’GTCGGTGCAGCGGCTCC-3’。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明方法采用的技術(shù)方案是一種快速檢測(cè)IT15基因CAG重復(fù)序列動(dòng)態(tài)突變的方法，包括下列步驟第一步準(zhǔn)備DNA(1)、從人體抽取血樣；(2)、從血樣中獲取基因組DNA；第二步對(duì)含CAG重復(fù)序列的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增(1)、第一步PCR擴(kuò)增利用PCR擴(kuò)增方法，以第一步獲取的基因組DNA為模板，采用以下四對(duì)引物中的任意一對(duì)引物進(jìn)行第一步PCR擴(kuò)增(I)、外源有義5’CTTGCTGTGTGAGGCAGAACCTG-3’
外源反義5’GGCTGAGGAAGCTGAGGAG-3’(II)、外源有義5’TTCACACACAGCTTCGC-3’外源反義5’CCTCCTCTCGAAGTGTCCCG-3’(III)、外源有義5’GGCAGAGTCCGCAGGCTAG-3’外源反義5’AAGTTCCATAGCGATGCCCAG-3’(IV)、外源有義5’CTAGGGCTGTCAATCATGCTGG-3’外源反義5’AAGTTCCATAGCGATGCCCAG-3’具體操作為①、將以上四對(duì)引物中的任意一對(duì)引物分別與獲取的血樣基因組DNA、4種堿基、含鎂離子的緩沖液、耐熱性DNA聚合酶、10％DMSO、去離子水混合構(gòu)成單獨(dú)的反應(yīng)體系；②、分別對(duì)各反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到第一步擴(kuò)增產(chǎn)物；(2)、第二步PCR擴(kuò)增利用PCR擴(kuò)增方法，以第一步擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，采用以下兩對(duì)引物中的任意一對(duì)引物進(jìn)行第二步PCR擴(kuò)增(I)、內(nèi)源有義5’GACCCTGGAAAAGCTGATG-3’內(nèi)源反義5’GGCTGAGGAAGCTGAGGAG-3’(II)、內(nèi)源有義5’-ATGAAGGCCTTCGAGTCCCTCAAGTCCTTC-3’內(nèi)源反義5’-GTCGGTGCAGCGGCTCC-3’具體操作為①、將以上兩對(duì)引物中的任意一對(duì)引物分別與第一步擴(kuò)增的產(chǎn)物、4種堿基、含鎂離子的緩沖液、耐熱性DNA聚合酶、10％DMSO、去離子水混合構(gòu)成單獨(dú)的反應(yīng)體系；②、分別對(duì)各反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到第二步擴(kuò)增產(chǎn)物；第三步凝膠電泳采用凝膠電泳系統(tǒng)對(duì)上述DNA擴(kuò)增后的體系做凝膠電泳；第四步觀測(cè)結(jié)果根據(jù)凝膠電泳對(duì)應(yīng)泳帶中所顯示的條帶數(shù)量和大小來(lái)判斷IT15基因CAG重復(fù)序列動(dòng)態(tài)突變情況，具體判斷方法如下(1)、如果觀察到對(duì)應(yīng)泳帶中出現(xiàn)一條DNA條帶，則該對(duì)等位基因CAG重復(fù)數(shù)相同；如果觀察到對(duì)應(yīng)泳帶中出現(xiàn)兩條DNA條帶，該對(duì)等位基因CAG重復(fù)數(shù)目不同；(2)、當(dāng)?shù)诙絇CR使用如上所述第一對(duì)引物時(shí)，若DNA條帶大于218個(gè)堿基時(shí)，則CAG重復(fù)數(shù)目大于40(由于CG含量高，遷移率變慢，電泳圖譜顯示約為240個(gè)堿基大小)；若DNA條帶等于149個(gè)堿基時(shí)，則CAG重復(fù)數(shù)目為17(由于CG含量高，遷移率變慢，電泳圖譜顯示約為160個(gè)堿基大小)。
(3)、當(dāng)?shù)诙絇CR使用如上所述第二對(duì)引物時(shí)，若DNA條帶大于304個(gè)堿基時(shí)，則CAG重復(fù)數(shù)目大于40(由于CG含量高，遷移率變慢，電泳圖譜顯示約為330個(gè)堿基大小)；當(dāng)DNA條帶等于235個(gè)堿基時(shí)，則CAG重復(fù)數(shù)目為17(由于CG含量高，遷移率變慢，電泳圖譜顯示約為250個(gè)堿基大小)。
上述技術(shù)方案中的有關(guān)內(nèi)容解釋如下1、關(guān)于DNA片段的PCR擴(kuò)增PCR(polymerase chain reaction)擴(kuò)增是一種體外擴(kuò)增DNA片段的方法，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法。采用這種方法，在反應(yīng)系統(tǒng)中只要有一個(gè)拷貝的待擴(kuò)增DNA片段，在短時(shí)間內(nèi)就能擴(kuò)增出大量拷貝數(shù)的特異性DNA片段。該方法廣泛應(yīng)用于基因檢測(cè)。
PCR擴(kuò)增的基本原理是模仿細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的DNA復(fù)制過(guò)程，以DNA互補(bǔ)鏈聚合反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過(guò)靶DNA變性、引物與模板DNA(待擴(kuò)增DNA)一側(cè)的互補(bǔ)序列退火復(fù)性、耐熱性DNA聚合酶催化引物延伸等過(guò)程的多次循環(huán)，產(chǎn)生待擴(kuò)增的特異性DNA片段。一般反應(yīng)過(guò)程是1、將反應(yīng)體系加熱至90～98℃，模板雙鏈DNA變性成為兩條單鏈DNA，作為互補(bǔ)鏈聚合反應(yīng)的模板；2、降溫至37～60℃，使兩種引物分別與模板DNA鏈的互補(bǔ)序列退火復(fù)性；3、升溫至70～75℃，在耐熱性DNA聚合酶催化下，四種脫氧核糖核酸按與模板堿基配對(duì)原則沿引物5’→3’方向延伸，合成模板DNA鏈的互補(bǔ)鏈。重復(fù)以上過(guò)程，就可以出現(xiàn)待擴(kuò)增的特異性DNA片段。由于上一次循環(huán)合成的兩條互補(bǔ)鏈均可作為下一次循環(huán)的模板DNA鏈，所以每循環(huán)一次，底物DNA的拷貝數(shù)增加一倍，因此PCR經(jīng)過(guò)n次循環(huán)后，理論上，待擴(kuò)增的特異性DNA片段可達(dá)到2n個(gè)拷貝數(shù)。
2、上述方案中，為了獲得更好PCR擴(kuò)增效果，第一步PCR擴(kuò)增和第二步PCR擴(kuò)增的循環(huán)條件為


以上兩步PCR擴(kuò)增中，變性溫度以98℃、退火溫度為56℃、延伸溫度為72℃為最佳。第一步PCR擴(kuò)增的循環(huán)次數(shù)以30次為最佳，第二步PCR擴(kuò)增的循環(huán)次數(shù)30～40次，其中35次為最佳。
3、上述方案中，凝膠電泳采用6％～10％聚丙烯酰胺凝膠電泳或2.0％～3.0％瓊脂糖凝膠電泳，其中，凝膠電泳采用10％聚丙烯酰胺凝膠電泳或2.5％瓊脂糖凝膠電泳效果更好。
原技術(shù)方法與本發(fā)明方法的比較見(jiàn)下表

由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)和效果1、本發(fā)明應(yīng)用特殊設(shè)計(jì)的引物，利用該基因檢測(cè)方法，在完成PCR反應(yīng)和凝膠電泳后，可直接觀察產(chǎn)物的數(shù)量和大小來(lái)判斷IT15基因CAG重復(fù)序列動(dòng)態(tài)突變情況。
2、本發(fā)明簡(jiǎn)單，不需測(cè)序。
3、本發(fā)明便宜，一般分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室或檢驗(yàn)室就可操作。
4、本發(fā)明靈敏度高，可以檢測(cè)Htt基因中CAG擴(kuò)展突變，為臨床診斷亨廷頓舞蹈病提供可靠的依據(jù)。
5、本發(fā)明建立了一個(gè)快速的簡(jiǎn)便易行的擴(kuò)增CAG重復(fù)序列的方法，為提高生物樣本臨床檢測(cè)水平，及其推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。


附圖1為本專(zhuān)利方法流程圖；附圖2為實(shí)施例三(安徽省一亨廷頓舞蹈病家系)的HD家系遺傳圖譜；附圖3為實(shí)施例三(安徽省一亨廷頓舞蹈病家系)的家系成員Htt基因CAG重復(fù)序列擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物電泳圖譜。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述實(shí)施例一一種快速檢測(cè)IT15基因CAG重復(fù)序列動(dòng)態(tài)突變的引物，由對(duì)應(yīng)第一步PCR擴(kuò)增的第一對(duì)引物和對(duì)應(yīng)第二步PCR擴(kuò)增的第二對(duì)引物組成；所述第一對(duì)引物采用以下四對(duì)引物中的任意一對(duì)引物(I)、外源有義5’CTTGCTGTGTGAGGCAGAACCTG-3’外源反義5’GGCTGAGGAAGCTGAGGAG-3’(II)、外源有義5’TTCACACACAGCTTCGC-3’外源反義5’CCTCCTCTCGAAGTGTCCCG-3’(III)、外源有義5’GGCAGAGTCCGCAGGCTAG-3’外源反義5’AAGTTCCATAGCGATGCCCAG-3’(IV)、外源有義5’CTAGGGCTGTCAATCATGCTGG-3’外源反義5’AAGTTCCATAGCGATGCCCAG-3’所述第二對(duì)引物采用以下兩對(duì)引物中的任意一對(duì)引物(I)、內(nèi)源有義5’GACCCTGGAAAAGCTGATG-3’內(nèi)源反義5’GGCTGAGGAAGCTGAGGAG-3’(II)、內(nèi)源有義5’ATGAAGGCCTTCGAGTCCCTCAAGTCCTTC-3’內(nèi)源反義5’GTCGGTGCAGCGGCTCC-3’。
因此，本實(shí)施例可以通過(guò)排列組合產(chǎn)生一系列不同的引物組合。這些引物組合中的每一種組合均可作為快速檢測(cè)IT15基因CAG重復(fù)序列動(dòng)態(tài)突變的引物，其中每一種組合均由兩對(duì)四引物構(gòu)成。
實(shí)施例二一種快速檢測(cè)IT15基因CAG重復(fù)序列動(dòng)態(tài)突變的方法，其特征在于包括下列步驟第一步準(zhǔn)備DNA(1)、從人體抽取血樣；(2)、從血樣中獲取DNA，即血樣基因組DNA樣品準(zhǔn)備試劑準(zhǔn)備抗凝劑每100ml含0.48g檸檬酸，1.32g檸檬酸鈉，1.47g葡萄糖；紅細(xì)胞裂解液10mmol/L Tris-HCl，PH 7.6；5mmol/L MgCl2；10mmol/L NaCl；白細(xì)胞裂解液10mmol/L Tris-HCl，PH 7.6；10mmol/L EDTA PH 8.050mmol/L NaCl10mg/ml蛋白酶K(Protease K)10mg Protease K溶于1ml ddH2O。分裝，-20℃保存。使用時(shí)，在4℃融化。
從血樣中獲取DNA過(guò)程①、取3ml新鮮血液加0.5ml抗凝劑，混勻，1500rpm離心10min，小心吸取紅細(xì)胞與血清之間呈一層乳白色的白細(xì)胞到一個(gè)新的15ml離心管。
②、加10ml紅細(xì)胞裂解液，輕輕混勻，放置10min，并經(jīng)常對(duì)溶液進(jìn)行混勻以充分裂解紅細(xì)胞。
③、1500rpm離心10min，棄上清，沉淀為白細(xì)胞。
④、加白細(xì)胞裂解液3ml，加50μl 10％SDS和50μl 10mg/ml蛋白酶K，50℃溫育過(guò)夜。
⑤、加等體積酚∶氯仿(1∶1)，輕柔混勻15次，5000g離心10min，取上層水溶液。
⑥、加60μl 5mol/L NaCl，輕輕混勻。再加2/3體積異丙醇，輕輕混勻5min，可見(jiàn)白色絮狀沉淀即基因組DNA。
⑦、8000g離心10min，棄上清。
⑧、加70％乙醇10ml，輕輕旋轉(zhuǎn)離心管，使管壁都充分接觸到乙醇。
⑨、8000g離心5min，棄上清，室溫風(fēng)干明顯的乙醇液滴，不要使白色沉淀干透，否則基因組DNA難溶于水。
⑩、加無(wú)菌去離子水500μl，置于搖床，室溫輕輕搖2h。之后，4℃過(guò)夜，使其充分溶解。
第二步對(duì)DNA進(jìn)行擴(kuò)增(1)、第一步PCR擴(kuò)增利用PCR擴(kuò)增方法，以第一步獲取的DNA為模板，采用以下四對(duì)引物中的任意一對(duì)引物進(jìn)行第一步PCR擴(kuò)增(I)、外源有義5’CTTGCTGTGTGAGGCAGAACCTG-3’外源反義5’GGCTGAGGAAGCTGAGGAG-3’(II)、外源有義5’TTCACACACAGCTTCGC-3’外源反義5’CCTCCTCTCGAAGTGTCCCG-3’(III)、外源有義5’GGCAGAGTCCGCAGGCTAG-3’外源反義5’AAGTTCCATAGCGATGCCCAG-3’(IV)、外源有義5’CTAGGGCTGTCAATCATGCTGG-3’外源反義5’AAGTTCCATAGCGATGCCCAG-3’具體操作為①、將以上四對(duì)引物中的任意一對(duì)引物分別與獲取的DNA、4種堿基、含鎂離子的緩沖液、耐熱性DNA聚合酶、10％DMSO，去離子水混合構(gòu)成單獨(dú)的反應(yīng)體系，具體見(jiàn)下表

②、分別對(duì)各反應(yīng)體系進(jìn)行PCR循環(huán)，擴(kuò)增含CAG重復(fù)序列DNA片段。PCR循環(huán)條件見(jiàn)下表

(2)、第二步PCR擴(kuò)增利用PCR擴(kuò)增方法，以第一步擴(kuò)增的產(chǎn)物為模板，采用以下兩對(duì)引物中的任意一對(duì)引物進(jìn)行第二步PCR擴(kuò)增(I)、內(nèi)源有義5’GACCCTGGAAAAGCTGATG-3’內(nèi)源反義5’GGCTGAGGAAGCTGAGGAG-3’(II)、內(nèi)源有義5’ATGAAGGCCTTCGAGTCCCTCAAGTCCTTC-3’內(nèi)源反義5’GTCGGTGCAGCGGCTCC-3’具體操作為①、將以上兩對(duì)引物中的任意一對(duì)引物分別與第一步擴(kuò)增的產(chǎn)物、4種堿基、含鎂離子的緩沖液、耐熱性DNA聚合酶、雙重蒸餾水混合構(gòu)成單獨(dú)的反應(yīng)體系，具體見(jiàn)下表

②、分別對(duì)各反應(yīng)體系進(jìn)行PCR循環(huán)，將DNA量擴(kuò)增至凝膠電泳可觀察即可。PCR循環(huán)條件見(jiàn)下表

第三步凝膠電泳采用凝膠電泳系統(tǒng)對(duì)上述DNA擴(kuò)增后的體系做凝膠電泳；第四步觀測(cè)結(jié)果根據(jù)凝膠電泳對(duì)應(yīng)泳帶中所顯示的條帶數(shù)量和大小來(lái)判斷IT15基因CAG重復(fù)序列動(dòng)態(tài)突變情況，具體判斷方法如下(1)、如果觀察到對(duì)應(yīng)泳帶中出現(xiàn)一條DNA條帶，則該等位基因CAG重復(fù)數(shù)相同；如果觀察到對(duì)應(yīng)泳帶中出現(xiàn)兩條DNA條帶，該等位基因CAG重復(fù)數(shù)目不同；(2)、當(dāng)?shù)诙絇CR使用如上所述第一對(duì)引物時(shí)，若DNA條帶大于218個(gè)堿基時(shí)(由于CG含量高，遷移率變慢，電泳圖譜顯示約為240個(gè)堿基大小)，則CAG重復(fù)數(shù)目大于40；當(dāng)DNA條帶等于149個(gè)堿基時(shí)，則CAG重復(fù)數(shù)目為17(由于CG含量高，遷移率變慢，電泳圖譜顯示約為160個(gè)堿基大小)。
(3)、當(dāng)?shù)诙絇CR使用如上所述第二對(duì)引物時(shí)，若DNA條帶大于304個(gè)堿基時(shí)，則CAG重復(fù)數(shù)目大于40(由于CG含量高，遷移率變慢，電泳圖譜顯示約為330個(gè)堿基大小)；當(dāng)DNA條帶等于235個(gè)堿基時(shí)，則CAG重復(fù)數(shù)目為17(由于CG含量高，遷移率變慢，電泳圖譜顯示約為250個(gè)堿基大小)。
實(shí)施例三利用本發(fā)明方法快速檢測(cè)安徽省一亨廷頓舞蹈病家系的lT15基因CAG重復(fù)序列動(dòng)態(tài)突變。
1、材料與方法1.1研究對(duì)象安徽省1個(gè)HD家系的包括4代成員，對(duì)其中11名成員進(jìn)行采樣分析。外周靜脈血各3ml(3.8％枸櫞酸鈉抗凝)。裂解紅細(xì)胞，離心獲得白細(xì)胞，常規(guī)飽和氯化鈉法提取白細(xì)胞中的基因組DNA。
1.2擴(kuò)增含CAG重復(fù)序列的部分IT15基因。使用本專(zhuān)利述及的第一步PCR引物(I)和第二步PCR引物(I)，按實(shí)施例二方法對(duì)安徽省一舞蹈病家系成員htt基因進(jìn)行擴(kuò)增。
采用NEST-PCR進(jìn)行擴(kuò)增。1st PCR擴(kuò)增體積為25μl，其中含2×GC緩沖液(含Mg2+)12.5μl，各種dNTP 250μmol/L，HD2和HD3各0.6μmol/L，LATaq多聚酶1U和200ng基因組DNA。擴(kuò)增條件95℃3min；(95℃30s，56℃30s，和72℃90S)，循環(huán)30次；72℃10min.。
2nd PCR擴(kuò)增體積為50μl，其中含2×GC緩沖液(含Mg2+)25μl，各種dNTP250μmol/L，HD1和HD2各0.6μmol/L，LATaq多聚酶1U和1μl 1stPCR產(chǎn)物。擴(kuò)增條件95℃3min；(95℃30s，56℃30s，和72℃90S)，循環(huán)30次；72℃10min·。PCR反應(yīng)試劑均為T(mén)AKARA產(chǎn)品。
2結(jié)果2.1該家系共15名成員，因該病死亡人數(shù)為3名，發(fā)病年齡分別為58，41，42歲。家系圖譜見(jiàn)圖2。
圖2說(shuō)明如下

I，II，III代表該家系的第一代，，第二代和第三代2.2對(duì)該家系11位成員進(jìn)行了HD的分子診斷，對(duì)IT15基因CAG重復(fù)序列進(jìn)行了擴(kuò)增，該分析結(jié)果見(jiàn)圖3。右一為核酸分子量標(biāo)記，其他泳道為對(duì)一HD家族共11名成員IT15基因含CAG重復(fù)序列擴(kuò)增的結(jié)果。
按本專(zhuān)利述及的觀察方法，(1)如果觀察到對(duì)應(yīng)泳帶中出現(xiàn)一條DNA條帶，則該等位基因CAG重復(fù)數(shù)相同；如果觀察到對(duì)應(yīng)泳帶中出現(xiàn)兩條DNA條帶，該等位基因CAG重復(fù)數(shù)目不同；(2)、當(dāng)?shù)诙絇CR使用如上所述第一對(duì)引物時(shí)，若DNA條帶大于218個(gè)堿基時(shí)(由于CG含量高，遷移率變慢，電泳圖譜顯示約為240個(gè)堿基大小)，則CAG重復(fù)數(shù)目大于40；當(dāng)DNA條帶等于149個(gè)堿基時(shí)，則CAG重復(fù)數(shù)目為17(由于CG含量高，遷移率變慢，電泳圖譜顯示約為160個(gè)堿基大小)。
2.3對(duì)擴(kuò)增得到的各樣本的重復(fù)序列進(jìn)行割膠回收、測(cè)序。分析序列，計(jì)數(shù)各擴(kuò)增片段CAG重復(fù)數(shù)。對(duì)本實(shí)驗(yàn)HD家系成員臨床及基因分析結(jié)果見(jiàn)表1。
表1本實(shí)驗(yàn)HD家系成員臨床及基因分析結(jié)果

注1斜線兩邊的數(shù)字代表一對(duì)同源染色體的兩個(gè)不同等位基因上的CAG重復(fù)數(shù)。
2斜線兩邊的字母代表對(duì)一對(duì)同源染色體的兩個(gè)不同等位基因上的CAG重復(fù)數(shù)的評(píng)價(jià)N代表正常，H代表HD。
上述實(shí)施例只為說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種快速檢測(cè)IT15基因CAG重復(fù)序列動(dòng)態(tài)突變的引物，其特征在于由對(duì)應(yīng)第一步PCR擴(kuò)增的第一對(duì)引物和對(duì)應(yīng)第二步PCR擴(kuò)增的第二對(duì)引物組成；所述第一對(duì)引物采用以下四對(duì)引物中的任意一對(duì)引物(I)、 外源有義5’CTTGCTGTGTGAGGCAGAACCTG-3’外源反義5’GGCTGAGGAAGCTGAGGAG-3’(II)、 外源有義5’TTCACACACAGCTTCGC-3’外源反義5’CCTCCTCTCGAAGTGTCCCG-3’(III)、外源有義5’GGCAGAGTCCGCAGGCTAG-3’外源反義5’AAGTTCCATAGCGATGCCCAG-3’(IV)、 外源有義5’CTAGGGCTGTCAATCATGCTGG-3’外源反義5’AAGTTCCATAGCGATGCCCAG-3’所述第二對(duì)引物采用以下兩對(duì)引物中的任意一對(duì)引物(I)、 內(nèi)源有義5’GACCCTGGAAAAGCTGATG-3’內(nèi)源反義5’GGCTGAGGAAGCTGAGGAG-3’(II)、內(nèi)源有義5’ATGAAGGCCTTCGAGTCCCTCAAGTCCTTC-3’內(nèi)源反義5’GTCGGTGCAGCGGCTCC-3’。
2.一種快速檢測(cè)IT15基因CAG重復(fù)序列動(dòng)態(tài)突變的方法，其特征在于包括下列步驟第一步準(zhǔn)備DNA(1)、從人體抽取血樣；(2)、從血樣中獲取基因組DNA；第二步對(duì)IT15基因含CAG重復(fù)序列的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增(1)、第一步PCR擴(kuò)增利用PCR擴(kuò)增方法，以第一步獲取的基因組DNA為模板，采用以下四對(duì)引物中的任意一對(duì)引物進(jìn)行第一步PCR擴(kuò)增(I)、 外源有義5’CTTGCTGTGTGAGGCAGAACCTG-3’外源反義5’GGCTGAGGAAGCTGAGGAG-3’(II)、 外源有義5’TTCACACACAGCTTCGC-3’外源反義5’CCTCCTCTCGAAGTGTCCCG-3’(III)、外源有義5’GGCAGAGTCCGCAGGCTAG-3’外源反義5’AAGTTCCATAGCGATGCCCAG-3’(IV)、外源有義5’CTAGGGCTGTCAATCATGCTGG-3’外源反義5’AAGTTCCATAGCGATGCCCAG-3’具體操作為①、將以上四對(duì)引物中的任意一對(duì)引物分別與獲取的血樣基因組DNA、4種堿基、含鎂離子的緩沖液、耐熱性DNA聚合酶、10％DMSO、去離子水混合構(gòu)成單獨(dú)的反應(yīng)體系；②、分別對(duì)各反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到第一步擴(kuò)增產(chǎn)物；(2)、第二步PCR擴(kuò)增利用PCR擴(kuò)增方法，以第一步擴(kuò)增的產(chǎn)物為模板，采用以下兩對(duì)引物中的任意一對(duì)引物進(jìn)行第二步PCR擴(kuò)增(I)、 內(nèi)源有義5’GACCCTGGAAAAGCTGATG-3’內(nèi)源反義5’GGCTGAGGAAGCTGAGGAG-3’(II)、內(nèi)源有義5’ATGAAGGCCTTCGAGTCCCTCAAGTCCTTC-3’內(nèi)源反義5’GTCGGTGCAGCGGCTCC-3’具體操作為①、將以上兩對(duì)引物中的任意一對(duì)引物分別與第一步擴(kuò)增的產(chǎn)物、4種堿基、含鎂離子的緩沖液、耐熱性DNA聚合酶、10％DMSO、去離子水混合構(gòu)成單獨(dú)的反應(yīng)體系；②、分別對(duì)各反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到第二步擴(kuò)增產(chǎn)物；第三步凝膠電泳采用凝膠電泳系統(tǒng)對(duì)上述第二步擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳；第四步觀測(cè)結(jié)果根據(jù)凝膠電泳對(duì)應(yīng)泳帶中所顯示的條帶數(shù)量和大小來(lái)判斷IT15基因CAG重復(fù)序列動(dòng)態(tài)突變情況，具體判斷方法如下(1)、如果觀察到對(duì)應(yīng)泳帶中出現(xiàn)一條DNA條帶，則該對(duì)等位基因CAG重復(fù)數(shù)相同；如果觀察到對(duì)應(yīng)泳帶中出現(xiàn)兩條DNA條帶，該對(duì)等位基因CAG重復(fù)數(shù)目不同；(2)、當(dāng)?shù)诙絇CR使用如上所述第一對(duì)引物時(shí)，若DNA條帶大于218個(gè)堿基時(shí)，則CAG重復(fù)數(shù)目大于40(由于CG含量高，遷移率變慢，電泳圖譜顯示約為240個(gè)堿基大小)；當(dāng)DNA條帶等于149個(gè)堿基時(shí)，則CAG重復(fù)數(shù)目為17(由于CG含量高，遷移率變慢，電泳圖譜顯示約為160個(gè)堿基大小)。(3)、當(dāng)?shù)诙絇CR使用如上所述第二對(duì)引物時(shí)，若DNA條帶大于304個(gè)堿基時(shí)，則CAG重復(fù)數(shù)目大于40(由于CG含量高，遷移率變慢，電泳圖譜顯示約為330個(gè)堿基大小)；當(dāng)DNA條帶等于235個(gè)堿基時(shí)，則CAG重復(fù)數(shù)目為17(由于CG含量高，遷移率變慢，電泳圖譜顯示約為250個(gè)堿基大小)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速檢測(cè)IT15基因CAG重復(fù)序列動(dòng)態(tài)突變的方法，其特征在于第一步PCR擴(kuò)增和第二步PCR擴(kuò)增的循環(huán)條件為
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的快速檢測(cè)IT15基因CAG重復(fù)序列動(dòng)態(tài)突變的方法，其特征在于以上兩步PCR擴(kuò)增中，變性溫度以98℃、退火溫度為56℃、延伸溫度為72℃為最佳。第一步PCR擴(kuò)增的循環(huán)次數(shù)為30次，第二步PCR擴(kuò)增的循環(huán)次數(shù)為30～40次。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速檢測(cè)IT15基因CAG重復(fù)序列動(dòng)態(tài)突變的方法，其特征在于上述凝膠電泳采用6％～10％聚丙烯酰胺凝膠電泳或2.0％～3.0％瓊脂糖凝膠電泳。
全文摘要
一種快速檢測(cè)舞蹈病IT15基因CAG重復(fù)序列擴(kuò)展突變的引物及方法，其特點(diǎn)是采用專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)的特殊引物，通過(guò)兩次PCR擴(kuò)增將DNA量擴(kuò)增至凝膠電泳可觀察的程度，最后利用凝膠電泳直接觀查IT15基因CAG重復(fù)序列動(dòng)態(tài)突變情況。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1.簡(jiǎn)單便宜，不需測(cè)序，一般分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室或檢驗(yàn)室就可操作，從而建立了一個(gè)簡(jiǎn)便易行的擴(kuò)增CAG重復(fù)序列的快速檢測(cè)方法。2.靈敏度高，25ng基因組DNA就足夠檢測(cè)Htt基因中CAG擴(kuò)展突變，為臨床診斷亨廷頓舞蹈病提供可靠的依據(jù)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1737163SQ20051004152
公開(kāi)日2006年2月22日 申請(qǐng)日期2005年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月15日
發(fā)明者秦正紅, 林芳, 王進(jìn) 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)