專利名稱：一種利用腐皮鐮孢菌生產(chǎn)殼寡糖的方法
技術領域：
本發(fā)明是利用腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)殼聚糖高效內(nèi)切酶生產(chǎn)高活性殼寡糖的技術。
背景技術：
殼寡糖(Chitosan oligosaccharide)，也稱幾丁寡糖，學名為β-1，4-寡聚-葡萄糖胺，是以殼聚糖為原料，經(jīng)生物技術降解而成的水溶性好、功能作用大、生物活性高的低分子量(小于4000D)產(chǎn)品。殼寡糖在人體內(nèi)吸收率近100％，是近年來倍受關注的功能性醫(yī)藥食品素材。殼寡糖水溶性大于99％，人體吸收率99.88％，從而比殼聚糖具有更優(yōu)越的生物活性。實驗證明，殼寡糖應用于乳制品，可使雙歧桿菌增生120倍。殼寡糖具有明顯的抗菌抑菌作用，其抑菌作用隨殼寡糖分子量的降低而逐漸增強的，尤以分子量為1500D左右時抗菌效果較好。殼寡糖能提高機體的免疫活性和抗癌能力，還可作為植物調(diào)節(jié)劑，增強植物對病蟲害的防御能力。殼寡糖的諸多優(yōu)良的生物活性使其廣泛應用于各行業(yè)，如精細化工領域作為優(yōu)良的保濕增濕劑，同時又可抑制皮膚表面細菌，活化表皮細胞，增強皮膚彈性；在生物醫(yī)藥方面的重要用途之一是利用其抑制腫瘤作用來制備抗癌制劑，殼寡糖特別是低聚6～8糖，可通過活化人體中的淋巴細胞，抑制癌細胞的繁殖和擴散來達到抗癌作用；在保健食品領域，以殼寡糖為主要原料生產(chǎn)的保健食品能夠提高機體的免疫力，活化細胞，促進腸道雙歧桿菌等有益菌的增生，并抑制有毒菌的生成。目前殼寡糖的制備方法主要包括水解法、物理法、利用糖轉(zhuǎn)移反應、利用轉(zhuǎn)基因合成、化學合成法幾大類。目前以水解法(酸水解法和酶水解法等)為主。
目前廣泛采用的酸解法和氧化降解法反應制取殼寡糖其反應條件和分離條件都較難控制，且后處理繁瑣，分離純化困難，高生理活性殼寡糖(聚合度在6-10)的產(chǎn)率低，成本高。酶法降解主要是由甲殼素酶、殼聚糖酶和溶菌酶進行水解，但這類酶較難獲得，造成生產(chǎn)成本過高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用腐皮鐮孢菌生產(chǎn)殼寡糖的方法，該方法過程簡捷，成本低，得到的殼寡糖產(chǎn)品小于十糖的占90％以上，其中高生理活性殼寡糖(6-8糖)占45％以上。
本發(fā)明的技術方案是，該種利用腐皮鐮孢菌生產(chǎn)殼寡糖的方法，其步驟包括1)、以腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)經(jīng)培養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)出殼聚糖高效內(nèi)切酶2)、殼聚糖在酶解前采用物理技術進行預處理，降低殼聚糖粘度；3)、在發(fā)酵酶液pH值為5.0-5.5，溫度為37℃-55℃下，加入發(fā)酵酶液體積2-4％的殼聚糖粉末，該殼聚糖事先采用物理技術進行過預處理，酶解6-8hr；4)、對酶解后的液體，采用超濾和納濾技術進行膜濾，對產(chǎn)品進行分子量分級、脫色、脫鹽和濃縮干燥。
本發(fā)明進一步的方案在于，培養(yǎng)基成分葡萄糖或蔗糖或淀粉2％，蛋白胨0.1％，酵母粉0.1％，干酪素0.1％；培養(yǎng)基pH值為5.5-7.5；培養(yǎng)時間20-64hr；選定的攪拌轉(zhuǎn)速為250～300r/min；通風量在0～24hr，通氣比為0.33∶1；24～48hr，通氣比為0.38∶1；48hr～結(jié)束，通氣比為0.44∶1；并根據(jù)發(fā)酵情況及時補加聚醚類消泡劑。
本發(fā)明進一步的方案在于，培養(yǎng)基pH值最佳pH值為6.0。
本發(fā)明進一步的方案在于，培養(yǎng)時間最佳60hr。
本發(fā)明進一步的方案在于，前述在酶解前采用物理技術進行的預處理可以是采用超聲波技術或輻照技術等物理方法適當降低殼聚糖粘度的處理。
本發(fā)明進一步的方案在于，酶解過程中發(fā)酵酶液pH值為5.5，溫度為50℃下，加入發(fā)酵酶液體積4％的殼聚糖粉末，該殼聚糖事先采用物理技術進行過預處理，酶解8hr。
本發(fā)明進一步的方案在于，所述膜濾過程是當酶解6-8hr后，過濾去除不溶物，將濾液泵入超濾膜分離器中，膜的截留分子量為2000D，濾液中分子量大于2000D的物質(zhì)返回濾液貯罐中，分子量小于2000D的透過膜進入脫色脫鹽貯罐；在此過程中需向濾液貯罐補加純凈水；當透過液中殼寡糖含量極低時，停止超濾操作，并將濾液泵入納濾膜分離器進行濃縮，作為下一批的原料投入發(fā)酵酶液中；脫色脫鹽貯罐中的超濾透過液泵入納濾膜分離器，進行脫色和脫鹽，截留液返回貯罐，在此過程中不斷補加純凈水，直至鹽份和色度達標，停止補加純凈水，對溶液進行濃縮。
前述以腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)經(jīng)培養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)出殼聚糖高效內(nèi)切酶菌落形態(tài)，菌落圓形，菌絲白色，在不同生長階段呈現(xiàn)綠色、紅色等，菌落緊實，最適培養(yǎng)溫度25℃。殼寡糖高效內(nèi)切酶的一般性質(zhì)酶作用適宜pH為5.0～6.0，最適宜pH值5.4；酶作用適宜溫度為45～53℃，最適溫度為50℃；酶作用殼聚糖不產(chǎn)生單糖。
通過快速篩選平板并通過搖瓶實驗，篩選到了一株可迅速降解殼聚糖為殼寡糖的腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)；該菌株經(jīng)優(yōu)化培養(yǎng)，發(fā)酵達到300U/L以上的殼寡糖酶活性。
本發(fā)明具有如下有益效果殼聚糖高效內(nèi)切酶具有高活性、酶解底物濃度高、生產(chǎn)成本低等特點，酶解產(chǎn)物小于十糖的占90％以上，其中6-8糖占45％以上，不含單糖和二糖，產(chǎn)物生物活性高，生產(chǎn)工藝采用高科技的分離手段，產(chǎn)品分子量分布集中。具體為1)、采用腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)發(fā)酵產(chǎn)生的殼聚糖高效內(nèi)切酶對殼寡糖進行酶解，得到的殼寡糖產(chǎn)品小于十糖的占90％以上，其中高生理活性殼寡糖(6-8糖)占45％以上。
2)、原料殼寡糖經(jīng)物理方法預處理后，一次酶解得率達到75％。
3)、過程簡捷，減少了分離過程引起的污染。
總之，本發(fā)明將生物工程技術和膜濾技術結(jié)合起來，即采用腐皮鐮孢菌(Fusariumsolani)發(fā)酵產(chǎn)生高效內(nèi)切酶對殼聚糖進行酶解，采用超濾和納濾膜技術對產(chǎn)物進行分子量分級、脫色、脫鹽和濃縮。其酶解產(chǎn)物小于十糖的占90％以上，其中6-8糖占45％以上，在現(xiàn)有技術中未有記載，對殼寡糖的工業(yè)化生產(chǎn)和應用具有現(xiàn)實意義。其創(chuàng)造性顯而易見。廣泛用于保健食品中。


圖為本發(fā)明方法的工藝流程圖。
具體實施例方式
該種利用腐皮鐮孢菌生產(chǎn)殼寡糖的方法，其步驟包括1)、以腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)經(jīng)培養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)出殼聚糖高效內(nèi)切酶通過快速篩選平板并通過搖瓶實驗，篩選到了一株可迅速降解殼聚糖為殼寡糖的腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)；該菌株經(jīng)優(yōu)化培養(yǎng)，發(fā)酵達到300U/L以上的殼寡糖酶活性；培養(yǎng)基成分葡萄糖2％，蛋白胨1％，酵母粉0.1％，干酪素0.1％；培養(yǎng)基pH值為5.5-7.5，最佳pH值為6.0；培養(yǎng)時間20-64hr，最佳60hr；選定的攪拌轉(zhuǎn)速為250～300r/min；通風量在0～24hr，通氣比為0.33∶1；24～48hr，通氣比為0.38∶1；48hr～結(jié)束，通氣比為0.44∶1；并根據(jù)發(fā)酵情況及時補加聚醚類消泡劑。
2)、殼聚糖在酶解前采用物理技術進行預處理，降低殼聚糖粘度；前述在酶解前采用物理技術進行的預處理可以是采用超聲波技術或輻照技術等物理方法適當降低殼聚糖粘度的處理，提高酶解時底物殼聚糖濃度。
3)、酶解過程是在發(fā)酵酶液pH值為5.0-5.5，溫度為37℃-55℃下，加入發(fā)酵酶液體積2-4％的殼聚糖粉末，該殼聚糖事先采用物理技術進行過預處理，酶解6-8hr；
4)、對酶解后的液體，采用超濾和納濾技術進行膜濾提純，對產(chǎn)品進行分子量分級、脫色、脫鹽和濃縮干燥。
所述膜濾過程可以是當酶解6-8hr后，過濾去除不溶物，將濾液泵入超濾膜分離器中，膜的截留分子量為2000D，濾液中分子量大于2000D的物質(zhì)返回濾液貯罐中，分子量小于2000D的透過膜進入脫色脫鹽貯罐；在此過程中需向濾液貯罐補加去離子水。當透過液中殼寡糖含量極低時，停止超濾操作，并將濾液泵入納濾膜分離器進行濃縮，作為下一批的原料投入發(fā)酵酶液中。脫色脫鹽貯罐中的超濾透過液泵入納濾膜分離器，進行脫色和脫鹽，截留液返回貯罐，在此過程中不斷補加去離子水，直至鹽份和色度達標，停止補加去離子水，對溶液進行濃縮。
殼聚糖的酶解實施例將殼聚糖和分別經(jīng)超聲波處理、輻照處理的殼聚糖各1200g投入30L發(fā)酵酶液中，調(diào)節(jié)pH值為5.5，啟動攪拌，于37℃-55℃下酶解，8hr后過濾，濾液經(jīng)超濾、納濾、干燥，樣品的酶解率如下。
不同殼聚糖的酶解產(chǎn)率

樣品中不同聚合度殼寡糖含量如下表。

權利要求
1.一種利用腐皮鐮孢菌生產(chǎn)殼寡糖的方法，其特征在于，步驟包括1)、以腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)經(jīng)培養(yǎng)發(fā)酵生產(chǎn)出殼聚糖高效內(nèi)切酶；2)、殼聚糖在酶解前采用物理技術進行預處理，降低殼聚糖粘度；3)、在發(fā)酵酶液pH值為5.0-5.5，溫度為37℃-55℃下，加入發(fā)酵酶液體積2-4％的殼聚糖粉末，該殼聚糖事先采用物理技術進行過預處理，酶解6-8hr；4)、對酶解后的液體，采用超濾和納濾技術進行膜濾，對產(chǎn)品進行分子量分級、脫色、脫鹽和濃縮干燥。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種利用腐皮鐮孢菌生產(chǎn)殼寡糖的方法，其特征在于，培養(yǎng)基成分葡萄糖或蔗糖或淀粉2％，蛋白胨0.1％，酵母粉0.1％，干酪素0.1％；培養(yǎng)基pH值為5.5-7.5；培養(yǎng)時間20-64hr；選定的攪拌轉(zhuǎn)速為250～300r/min；通風量在0～24hr，通氣比為0.33∶1；24～48hr，通氣比為0.38∶1；48hr～結(jié)束，通氣比為0.44∶1；并根據(jù)發(fā)酵情況及時補加聚醚類消泡劑。
3.根據(jù)權利要求2所述的一種利用腐皮鐮孢菌生產(chǎn)殼寡糖的方法，其特征在于，培養(yǎng)基成分葡萄糖2％，蛋白胨0.1％，酵母粉0.1％，干酪素0.1％。
4.根據(jù)權利要求2所述的一種利用腐皮鐮孢菌生產(chǎn)殼寡糖的方法，其特征在于培養(yǎng)基pH值最佳為6.0。
5.根據(jù)權利要求2所述的一種利用腐皮鐮孢菌生產(chǎn)殼寡糖的方法，其特征在于培養(yǎng)時間最佳60hr。
6.根據(jù)權利要求1或2所述的一種利用腐皮鐮孢菌生產(chǎn)殼寡糖的方法，其特征在于，前述在酶解前采用物理技術進行的預處理可以是采用超聲波技術或輻照技術等物理方法適當降低殼聚糖粘度的處理。
7.根據(jù)權利要求6所述的一種利用腐皮鐮孢菌生產(chǎn)殼寡糖的方法，其特征在于，酶解過程中發(fā)酵酶液pH值為5.5，溫度為50℃下，加入發(fā)酵酶液體積4％的殼聚糖粉末，該殼聚糖事先采用物理技術進行過預處理，酶解8hr。
8.根據(jù)權利要求1所述的一種利用腐皮鐮孢菌生產(chǎn)殼寡糖的方法，其特征在于，所述膜濾過程是當酶解6-8hr后，過濾去除不溶物，將濾液泵入超濾膜分離器中，膜的截留分子量為2000D，濾液中分子量大于2000D的物質(zhì)返回濾液貯罐中，分子量小于2000D的透過膜進入脫色脫鹽貯罐；在此過程中需向濾液貯罐補加去離子水；當透過液中殼寡糖含量極低時，停止超濾操作，并將濾液泵入納濾膜分離器進行濃縮，作為下一批的原料投入發(fā)酵酶液中；脫色脫鹽貯罐中的超濾透過液泵入納濾膜分離器，進行脫色和脫鹽，截留液返回貯罐，在此過程中不斷補加去離子水，直至鹽份和色度達標，停止補加去離子水，對溶液進行濃縮。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)生產(chǎn)殼寡糖的方法，該菌所產(chǎn)的殼聚糖酶為高效內(nèi)切酶，在37℃－55℃范圍內(nèi)，2hr可使2％的殼聚糖溶液粘度降低90％以上，酶解8hr后，殼寡糖產(chǎn)率大于70％，其中10糖以下的寡糖大于90％。其生產(chǎn)方法包括腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)的培養(yǎng)、產(chǎn)酶發(fā)酵工藝、殼聚糖原料的物理預處理、酶解液的過濾、產(chǎn)物分子量分級、脫色、脫鹽與濃縮、干燥。本發(fā)明采用腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)酶解殼聚糖，使產(chǎn)品殼寡糖中生理活性最強的6糖、7糖、8糖含量大大增加，提取采用多種膜濾技術，提高了收率和產(chǎn)品質(zhì)量。廣泛用于保健食品中。
文檔編號C12P19/00GK1680569SQ20051004201
公開日2005年10月12日 申請日期2005年1月11日 優(yōu)先權日2005年1月11日
發(fā)明者蘇理, 鮑曉明, 蘭文忠, 趙雙枝, 董學前 申請人:蘇理