專利名稱：一種紅藻和藍藻完整藻膽體的穩(wěn)定化技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藍藻和紅藻完整藻膽體的穩(wěn)定化技術(shù)，屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
藻膽蛋白是一類光合作用捕光色素～蛋白質(zhì)復(fù)合物，主要存在于藍藻、紅藻、隱藻和少數(shù)甲藻中。在光合作用中起捕獲和傳遞光能的作用，具有強烈的熒光。在藍藻和紅藻中，由2-3種藻膽蛋白組成超分子結(jié)構(gòu)藻膽體，形成高效的能量傳遞序列。在80年代中期，美國研究藻類光合作用的學(xué)者提出將藻膽蛋白作為熒光標(biāo)記物，用于診斷試劑。同常用的熒光標(biāo)記物相比，藻膽蛋白具有下列優(yōu)點生產(chǎn)過程安全、無毒，光能吸收強，熒光產(chǎn)率高，超過90％，背景光干擾和假陽性率低，在pH4-11的范圍內(nèi)穩(wěn)定，可以作雙色、三色和四色標(biāo)記。所以，這類試劑的應(yīng)用范圍不斷擴大。由于其獨特的優(yōu)點，藻膽蛋白和藻膽蛋白標(biāo)記的診斷試劑在90年代初進入國際市場。但是，由于價格昂貴，尚未應(yīng)用到普及型的臨床診斷試劑。我國全部進口，也僅限于用細胞流式儀進行的診斷。
藻膽蛋白做為熒光探針，有其獨特的優(yōu)勢，但單個的藻膽蛋白分子，由于其分子較小、分子中含有的色素基團較少，因此，產(chǎn)生熒光的亮度不夠，使得在高分辨率的檢測中靈敏度不高。美國的莫斯曼(J.P.Morseman)提出，應(yīng)用固定化的完整藻膽體做為熒光探針，可用于多種生物醫(yī)學(xué)檢測。由于藻膽體中含有更多的色素基團，因此，其亮度較高，并且，激發(fā)波長為藻紅蛋白(PE)或藻藍蛋白(PC)的吸收波長，而熒光發(fā)射來自APC，因此，激發(fā)波長和發(fā)射波長相距更遠，避免相互干擾。但是藻膽體是由藻膽蛋白在連接蛋白的作用下，在疏水、電荷等非共價鍵作用下自組裝形成的超分子復(fù)合體，藻膽體只有在較高離子強度的緩沖系統(tǒng)中保持穩(wěn)定，在較低離子強度下，極易解離，即使在較高的離子強度下，完整藻膽體也很難長時間保存，從而嚴(yán)重限制了藻膽體做為熒光探針在生物醫(yī)學(xué)檢測中的應(yīng)用。因此，完整藻膽體的穩(wěn)定化，對于藻膽體的保存和做為熒光探針用于生物醫(yī)學(xué)檢測，顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對藻膽體做為熒光探針做為熒光標(biāo)記物用于生物醫(yī)學(xué)檢測中需要解決的關(guān)鍵技術(shù)問題，提供一種完整藻膽體的穩(wěn)定化技術(shù)，從而為完整藻膽體用做熒光探針奠定基礎(chǔ)。
本發(fā)明的藍藻和紅藻完整藻膽體的穩(wěn)定化技術(shù)，方法如下1、原料的破碎以新鮮的藍藻或紅藻為原料，溶于pH＝6.8～7.0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液中，采用超聲波破碎細胞。
上述藍藻選自鈍頂螺旋藻或魚腥藻；上述紅藻選自單細胞紅藻紫球藻、大型紅藻多管藻或三叉仙菜。
2、藻膽體解離在上述破碎的藻體中加入去污劑吐溫X-100(TritonX-100)，使藻膽體從類囊體膜上解離下來。離心，去除去污劑、葉綠素和破碎的細胞，得藻膽體的粗提物。
3、完整藻膽體的提取以蔗糖密度梯度高速離心的方法提取制備上述藍藻或紅藻的完整藻膽體。
4、完整藻膽體的穩(wěn)定性保護采用下列方法之一(1)采用葡聚糖，對藻膽體非共價交聯(lián)，準(zhǔn)確稱量相對分子質(zhì)量為20000的葡聚糖，加入到上述步驟3完整藻膽體溶液中，溶解，使終濃度達9～10％(W/V)。
(2)采用甲醛交聯(lián)技術(shù)，對藻膽體分子內(nèi)進行共價交聯(lián)，取上述步驟3完整藻膽體溶液，用0.75mol/L的磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀緩沖液(pH＝6.98)調(diào)整蛋白濃度至0.25～0.30mg/mL，然后，取該藻膽體溶液1.8mL，邊振蕩邊緩慢滴加用0.75mol/L的磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀緩沖液配制的3～5％(W/V)甲醛濃溶液0.2mL，直至甲醛濃度為0.3～0.5％(W/V)，20℃保溫12-13h。
上述步驟1原料的破碎具體為新鮮藻體0.75～1.0g，溶于15～20mL 1mol·L-1的磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀緩沖液(pH＝6.8～7.0)中，超聲波破碎，破碎功率為12～15W，破碎5～6次，每次1.5～2min，間隔2～3min。
上述步驟2藻膽體解離具體為在破碎的藻體溶液中加入體積百分比濃度1.9～2.1％去污劑吐溫X-100，室溫下，緩慢攪拌1小時～1.5小時，13000rpm～15000rpm離心1～2次，去除表層的去污劑吐溫X-100、葉綠素和底部的細胞碎片，收集出離心管中部的溶液，即為藻膽體粗提液。
上述去污劑的加入量本發(fā)明不作特別限定，按本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)，以能使藻膽體從類囊體膜上解離為宜。
上述步驟3提取藻膽體的蔗糖密度梯度離心的方法可采用現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供如下具體方法取步驟2制備的藻膽體粗提液3～4mL，疊加到蔗糖密度梯度離心管的上層，從底層到上層蔗糖的摩爾濃度及體積2mol·L-14mL、1mol·L-13mL、0.5mol·L-15mL、0.25mol·L-15mL；40000rpm～45000rpm離心3～4h，取1mol·L-1層的藍色液，對1mol·L-1的磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀緩沖液透析過夜去除蔗糖，最后用1mol·L-1的磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀緩沖液稀釋，至藻膽蛋白濃度的為0.25～0.30mg/mL，測定完整藻膽體的熒光光譜。(如圖1所示)上述步驟4完整藻膽體穩(wěn)定性測定1、將用葡聚糖穩(wěn)定性保護方法(1)所得藻膽體溶液的磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀的離子強度降為0.6mol/L，20℃保存，保存30天。作為對照的是在磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀的離子強度降為1.0mol/L保存的未加葡聚糖的藻膽體(未經(jīng)穩(wěn)定性保護的藻膽體在0.75～1.0molL的磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀緩沖液中，能夠保持完整，而0.6mol/L的磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀緩沖液中，容易解離，無法保持完整)。測定藻膽體的熒光光譜，藻膽體依然保持完整(如圖2和圖3所示)。
2、甲醛交聯(lián)技術(shù)穩(wěn)定性保護方法(2)所得藻膽體溶液，用去離子水稀釋至低離子濃度0.1mol/L，20℃溫育30天，測量其熒光光譜，結(jié)果表明在0.1mol/L低離子強度下保存30天，穩(wěn)定化的藻膽體依然保持完整。(如圖4所示)本發(fā)明以紅藻和藍藻為材料，應(yīng)用超聲波破碎細胞、去污劑TritonX-100從類囊體膜上解離藻膽體、常規(guī)離心去除TritonX-100、葉綠素和細胞碎片、應(yīng)用蔗糖密度梯度超速離心制備完整藻膽體，然后應(yīng)用葡聚糖非共價鍵包被和甲醛共價交聯(lián)兩種方法之一，對藻膽體的穩(wěn)定性進行保護，室溫保存30天，藻膽體依然保持完整，沒有解離。從而為將藻膽體應(yīng)用于超靈敏的生物醫(yī)學(xué)檢測奠定了基礎(chǔ)，具有很好的應(yīng)用前景。


圖1是實施例1蔗糖密度梯度離心法提取的鈍頂螺旋藻藻膽體的室溫?zé)晒夤庾V。曲線a是鈍頂螺旋藻藻膽體的室溫?zé)晒獍l(fā)射光譜，其發(fā)射峰位于680nm處。曲線b是藻膽體的激發(fā)光譜，680nm的熒光激發(fā)峰有兩處，其中622nm處為最大激發(fā)峰，650nm處為一肩峰。
圖2是實施例1加入葡聚糖后藻膽體V值隨保存時間的變化。
圖3是實施例1加葡聚糖(a)及未加葡聚糖對照(b)藻膽體保存30天的室溫?zé)晒獍l(fā)射光譜。
圖4是實施例2穩(wěn)定化的鈍頂螺旋藻藻膽體的室溫?zé)晒夤庾V，其中，a熒光激發(fā)光譜，Em＝665nm；b熒光發(fā)射光譜，Ex＝580nm。
具體實施方式
實施例1、藍藻完整藻膽體的穩(wěn)定化技術(shù)，方法如下1、原料的破碎新鮮鈍頂螺旋藻0.8g，溶于16mL 1mol·L-1的磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀緩沖液(pH＝6.9)中，采用超聲波破碎細胞，破碎功率為12～15W，破碎5次，每次1.5min，間隔2min。
2、藻膽體解離在上述破碎的藻體中加入體積百分比濃度2.0％去污劑吐溫X-100，室溫下，緩慢攪拌1小時～1.5小時，使藻膽體從類囊體膜上解離下來，13000rpm～15000rpm離心1～2次，去除表層的去污劑吐溫X-100、葉綠素和底部的細胞碎片，收集出離心管中部的溶液，即為藻膽體粗提液。
3、完整藻膽體的提取以蔗糖密度梯度高速離心的方法提取完整藻膽體。取步驟2制備的藻膽體粗提液3mL，小心疊加到蔗糖密度梯度離心管的上層，從底層到上層蔗糖的摩爾濃度及體積2mol·L-14mL、1mol·L-13mL、0.5mol·L-15mL、0.25mol·L-15mL；40000rpm～45000rpm離心3～4h，取1mol·L-1層的藍色液，對1mol·L-1的磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀緩沖液透析過夜去除蔗糖，最后用1mol·L-1的磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀緩沖液稀釋，至藻膽蛋白濃度的為0.25～0.30mg/mL。
測定完整藻膽體的熒光光譜，如圖1所示，曲線a是鈍頂螺旋藻藻膽體的室溫?zé)晒獍l(fā)射光譜，其發(fā)射峰位于680nm處，該峰值是AP-B的熒光發(fā)射峰，沒有C-藻籃蛋白(C-PC)(648nm)及異藻籃蛋白(APC)(660nm)的熒光發(fā)射峰，說明在純化的藻膽體的內(nèi)，C-PC和APC吸收的光能均能高效地傳遞給能量的末端受體AP-B，因而證明所得的藻膽體是完整的。曲線b是藻膽體的激發(fā)光譜，680nm的熒光激發(fā)峰有兩處，其中622nm處為最大激發(fā)峰，來自于C-PC，這說明藻膽體680nm熒光發(fā)射峰的能量主要來源于C-PC，而650nm處為一肩峰，來自于異藻籃蛋白(APC)，進一步說明藻膽體是完整的。
4、完整藻膽體的穩(wěn)定性保護采用葡聚糖，對藻膽體非共價交聯(lián)，準(zhǔn)確稱量相對分子質(zhì)量為20000的葡聚糖，加入到上述步驟3完整藻膽體溶液中，溶解，使終濃度達9～10％(W/V)，將該溶液的磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀的離子強度降為0.6mol/L，20℃保存，保存30天。
作為對照的是在磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀的離子強度降為1.0mol/L保存的未加葡聚糖的藻膽體，測定藻膽體的熒光光譜，藻膽體依然保持完整，如圖2和圖3所示。
圖2中V＝F676nm/F650nm，反映藻膽體的解離程度，V值越大，藻膽體越完整，V值越小，藻膽體的解離程度越大。葡聚糖的加入，使得鈍頂螺旋藻藻膽體(0.6mg/mL)的V值增加，說明葡聚糖使藻膽體結(jié)合得更為緊密。
圖3表明在30天的考查期(于1mol/L緩沖液中，pH7，20℃保存)內(nèi)，與對照藻膽體相比，加入葡聚糖的藻膽體的V值始終大于對照組相應(yīng)的V值，而且保存過程中V值的降低量較小。保存30天后，加入葡聚糖的藻膽體的熒光發(fā)射峰位置變化不大，由676nm藍移至671nm，且在650nm左右未出現(xiàn)肩峰，而對照藻膽體已出現(xiàn)明顯的650nm左右的肩峰，熒光發(fā)射主峰亦藍移至668nm。外觀上看，保存30天后，加葡聚糖的藻膽體形成藍色沉淀沉降在試管底部，上清液澄清，而對照組藻膽體藍色溶液已出現(xiàn)較多的白色絮狀沉淀，說明已有少量藻膽蛋白變性。這些結(jié)果說明葡聚糖對藻膽體的穩(wěn)定性有明顯的保護作用。
實施例2、如實施例1所述，所不同的是步驟4完整藻膽體的穩(wěn)定性保護采用甲醛交聯(lián)技術(shù)，對藻膽體分子內(nèi)進行共價交聯(lián)，取上述步驟3完整藻膽體溶液，用0.75mol/L的磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀緩沖液(pH＝6.98)調(diào)整蛋白濃度至0.28mg/mL，然后，取該藻膽體溶液1.8mL，邊振蕩邊緩慢滴加用0.75mol/L的磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀緩沖液配制的4％(W/V)甲醛濃溶液0.2mL，直至甲醛濃度為0.4％(W/V)，20℃保溫12h。所得藻膽體溶液，用去離子水稀釋至低離子濃度0.1mol/L，20℃溫育30天，測量其熒光光譜，結(jié)果表明在0.1mol/L低離子強度下保存30天，穩(wěn)定化的藻膽體依然保持完整。如圖4所示。
圖4是穩(wěn)定化的鈍頂螺旋藻藻膽體的室溫?zé)晒夤庾V，其中，a熒光激發(fā)光譜，Em＝665nm；b熒光發(fā)射光譜，Ex＝580nm。其熒光發(fā)射峰在665nm，為異藻藍蛋白(APC)的熒光發(fā)射峰，未出現(xiàn)650nm C-藻藍蛋白的熒光發(fā)射峰，說明能量可高效地自C-藻藍蛋白傳遞到異藻藍蛋白；穩(wěn)定化藻膽體的最大熒光激發(fā)峰在626nm，較對照藻膽體的(622nm)有所微移，穩(wěn)定化藻膽體在650nm左右也有一激發(fā)肩峰。這些結(jié)果說明鈍頂螺旋藻藻膽體的穩(wěn)定化處理并沒有改變藻膽體原有的能量傳遞特性。
實施例3、紅藻完整藻膽體的穩(wěn)定化技術(shù)，方法如下如實施例1所述，所不同的是步驟1的原料是單細胞紅藻紫球藻0.9g，溶于18mL 1mol·L-1的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液(pH＝6.8)中，超聲波破碎細胞，破碎功率為12～15W，破碎6次，每次2min，間隔3min。
實施例4、如實施例2所述，所不同的是步驟1的原料是大型紅藻多管藻1.0g，溶于20mL 1mol·L-1的磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀緩沖液(pH＝7.0)中，超聲波破碎細胞，破碎功率為12～15W，破碎6次，每次2 min，間隔3min。
步驟3提取藻膽體的蔗糖密度梯度離心的方法取步驟2制備的藻膽體粗提液4mL，小心疊加到蔗糖密度梯度離心管的上層，從底層到上層蔗糖的摩爾濃度及體積2mol·L-14mL、1mol·L-13mL、0.5mol·L-15mL、0.25mol·L-15mL；40000rpm～45000rpm離心3～4h，取1mol·L-1層的藍色液，對1mol·L-1的磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀緩沖液透析過夜去除蔗糖，最后用1mol·L-1的磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀緩沖液稀釋，至藻膽蛋白濃度的為0.30mg/mL。
權(quán)利要求
1.藍藻和紅藻完整藻膽體的穩(wěn)定化技術(shù)，方法如下(1)原料的破碎以新鮮的藍藻或紅藻為原料，溶于pH＝6.8～7.0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液中，采用超聲波破碎細胞；(2)藻膽體解離在上述破碎的藻體中加入去污劑吐溫X-100，使藻膽體從類囊體膜上解離下來，離心，去除去污劑、葉綠素和破碎的細胞，得藻膽體的粗提物；(3)完整藻膽體的提取以蔗糖密度梯度高速離心的方法提取制備上述藍藻或紅藻的完整藻膽體。(4)完整藻膽體的穩(wěn)定性保護采用下列方法之一①采用葡聚糖，對藻膽體非共價交聯(lián)，準(zhǔn)確稱量相對分子質(zhì)量為20000的葡聚糖，加入到上述步驟3完整藻膽體溶液中，溶解，使終濃度達9～10％W/V；②采用甲醛交聯(lián)技術(shù)，對藻膽體分子內(nèi)進行共價交聯(lián)，取上述步驟3完整藻膽體溶液，用0.75mol/L的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液pH＝6.98，調(diào)整蛋白濃度至0.25～0.30mg/mL，然后，取該藻膽體溶液1.8mL，邊振蕩邊緩慢滴加用0.75mol/L的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液配制的3～5％W/V甲醛濃溶液0.2mL，直至甲醛濃度為0.3～0.5％W/V，20℃保溫12-13h。
2.如權(quán)利要求1所述的藍藻和紅藻完整藻膽體的穩(wěn)定化技術(shù)，其特征在于藍藻選自鈍頂螺旋藻或魚腥藻，紅藻選自單細胞紅藻紫球藻、大型紅藻多管藻或三叉仙菜。
3.如權(quán)利要求1所述的藍藻和紅藻完整藻膽體的穩(wěn)定化技術(shù)，其特征在于步驟(1)新鮮藻體0.75～1.0g，溶于15～20mL 1mol·L-1的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液中，超聲波破碎，破碎功率為12～15W，破碎5～6次，每次1.5～2min，間隔2～3min。
4.如權(quán)利要求1所述的藍藻和紅藻完整藻膽體的穩(wěn)定化技術(shù)，其特征在于步驟(2)加入去污劑吐溫X-100的體積百分比濃度為1.9～2.1％，室溫下，緩慢攪拌1小時～1.5小時，13000rpm～15000rpm離心1～2次，收集出離心管中部的溶液。
5.如權(quán)利要求1所述的藍藻和紅藻完整藻膽體的穩(wěn)定化技術(shù)，其特征在于步驟(3)具體為取步驟2制備的藻膽體粗提液3～4mL，疊加到蔗糖密度梯度離心管的上層，從底層到上層蔗糖的摩爾濃度及體積2mol·L-14mL、1mol·L-13mL、0.5mol·L- 15mL、0.25mol·L-15mL；40000rpm～45000rpm離心3～4h，取1mol·L-1層的藍色液，對1mol·L-1的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液透析過夜去除蔗糖，最后用1mol·L-1的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液稀釋，至藻膽蛋白濃度為0.25～0.30mg/mL。
全文摘要
藍藻和紅藻完整藻膽體的穩(wěn)定化技術(shù)，屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以紅藻和藍藻為材料，應(yīng)用超聲波破碎細胞、去污劑TritonX－100從類囊體膜上解離藻膽體、常規(guī)離心去除TritonX－100、葉綠素和細胞碎片、應(yīng)用蔗糖密度梯度超速離心制備完整藻膽體，然后應(yīng)用多糖葡聚糖非共價鍵包被和甲醛共價交聯(lián)兩種方法，對藻膽體的完整性進行保護，室溫下保存30天，藻膽體依然保持完整，沒有解離。從而為將藻膽體應(yīng)用于超靈敏的生物醫(yī)學(xué)檢測奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12N1/12GK1654627SQ20051004202
公開日2005年8月17日 申請日期2005年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月17日
發(fā)明者張玉忠, 張熙穎, 陳秀蘭, 周百成 申請人:山東大學(xué)