專利名稱：高羊茅液泡膜Na的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因(FaNHX1)，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植物消除Na+毒害的策略包括降低Na+的吸收、Na+的外排和Na+的區(qū)隔化。Na+吸收是一個復(fù)雜的過程。Na+的外排和區(qū)隔化是間接的主動運輸過程，主要由Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白來調(diào)節(jié)。Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白(Na+/H+antiporter or exchanger，NHA or NHE)是細(xì)菌、酵母、藻類、動物和高等植物的膜系統(tǒng)上普遍存在的一種轉(zhuǎn)運蛋白，參與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的pH、Na+濃度調(diào)節(jié)及細(xì)胞體積變化等生命活動。自1985年Blumwald和Plooe首先在甜菜根部貯藏組織的液泡膜上發(fā)現(xiàn)Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運活性以來，人們相繼發(fā)現(xiàn)在鹽生植物如濱藜、兼性CAM植物冰葉日中花、甜菜等和較耐鹽的甜土植物如大麥、海濱車前、長春花、棉花、向日葵等的液泡膜上普遍存在著Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運活性。Nass等在酵母的前液泡膜(prevacuole)上也發(fā)現(xiàn)了一種Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白。大量實驗表明Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運活性的有無和高低與植物和酵母的耐鹽性密切相關(guān)，在高鹽濃度下植物和酵母可以分別通過質(zhì)膜和液泡膜上的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運將Na+運出細(xì)胞和將Na+區(qū)域化在液泡內(nèi)，維持細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Na+穩(wěn)態(tài)和Na+/K+比相對穩(wěn)定，以適應(yīng)鹽漬環(huán)境。耐鹽植物能夠通過Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白將大部分Na+區(qū)域化到液泡中，因而既能避免離子脅迫，又能進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)。因此Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白在植物耐鹽性中的作用已越來越受到重視。目前人們已經(jīng)從細(xì)菌、酵母、動物和高等植物中相繼獲得了編碼Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的基因。
把編碼液泡膜上Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的基因(如擬南芥的AtNHX1與酵母的NHX1等)轉(zhuǎn)化到鹽敏感植物中，并使其在液泡膜上過量表達(dá)以提高植物耐鹽性，是可行的植物基因工程策略。已在擬南芥、番茄、甜菜等植物獲得高耐鹽的轉(zhuǎn)基因植株。
高羊茅是一種鹽生植物，高羊茅最突出的特點就是能在其他高產(chǎn)作物不能生長的重鹽堿土上種植。目前有關(guān)高羊茅液泡膜上Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1的基因及其在植物轉(zhuǎn)基因工程育種中的應(yīng)用還沒有報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對目前還沒有報道耐鹽堿的高羊茅NHX基因及其在植物轉(zhuǎn)基因育種工程技術(shù)中得到應(yīng)用的現(xiàn)狀，本發(fā)明提供一種高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因、重組載體及植物轉(zhuǎn)基因育種方法，將高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因構(gòu)建在植物表達(dá)的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化小麥獲得轉(zhuǎn)基因植株。
本發(fā)明所提供的高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因(FaNHX1)，具有如SEQID NO.1所示的序列ATGATGGGGC TCGGGCTCGG CGACCCGCCG GCGGACTACG GCTCCATCGC CGCCGTGGGG60CTCTTCGTCG CGCTCATGTG CGTCTGCATC GTCGTCGGAC ACCTCCTCGA GGAGAACCGA120TGGATGAACG AGTCAACCAC CGCGCTCCTG ATTGGGCTCG GCACCGGCAC GGTCATCCTG180CTCGCGTCAA GCGGGAAGCA CTCGCACATA CTCGTCTTCA GCGAGGATCT CTTCTTCATC240TACCTGCTAC CGCCAATCAT TTTCAATGCA GGGTTCCAAG TGAAGAAGAA GCAGTTCTTC300CGCAACTTCA TGACTATTAC ATTGTTTGCT GTAGTTGGGA CCCTCATCTC CTTCAGCATA360ATATCCCTCG GTGCGCTGGG GCTAATATCA AGGCTGAACA TAGGTGCCCT TGAGCTTGGA420
GACTACCTCG CACTTGGGGC AATATTCTCG GCAACGGACT CTGTATGCAC CTTGCAGGTG480TTAAGCCAAG ACGAGACACC CTTCCTCTAC AGTTTGGTCT TTGGTGAAGG TGTCGTCAAC540GATGCAACCT CAGTTGTGTT GTTCAATGCA ATCCAGAACT TTGATCTTGG AGATCTCAGT600ACCCTCAAAT TCTTTCAATT TATTGGAAAC TTCCTTTATC TGTTTGGCGC CAGCACCTTC660CTTGGAGTAG CTACTGGACT TCTCAGTGCT TATGTAATCA AGAAATTGTA CTTTGGCAGG720CACTCCACTG ATCGTGAAGT TGCTATTATG ATGCTCATGG CTTATTTATC TTACATGCTG780GCTGAATTGC TTGATTTGAG TGGTATTCTC ACAGTTTTCT TCTGTGGTAT TCTAATGTCG840CACTATACCT GGCACAATGT AACAGAAAGT TCCAGGGTCA CRACCAAGCA TTCCTTCGCC900ACATTGTCGT TCATTTCTGA GACTTTCCTC TTTCTCTACG TTGGCATGGA TGCGCTGGAT960ATAGAAAAGT GGAAGATTGT TAGTGAAACA TATAGCCCAA TGAAATCAAT CGCCCTGAGC1020TCCGTTATTT TGGCCTTGGT GCTAGTTGCA AGAGCTGCTT TTGTTTTCCC ACTATCCTAT1080CTGTCCAATT TGACCAAAAA AACTCCAGGC GAGAAGATCT CTGTTAGGCA GCAAGTTATT1140ATTTGGTGGT CGGGTCTCAT GAGAGGTGCT GTGTCCATTG CGTTGACCTA CAATAAGTTT1200GCAAAATCAG GTCACACTCA ACTTCCTAGC AATGCTATCA TGATCACCAG TACAATCATT1260GTTGTTCTTT TCAGCACAAT TGTCTTTGGG CTACTGACTA AGCCATTGAT CAGACTCCTG1320ATTCCAACGA GGCACCTCAC CAGGGAAGTG AGCGCCCTTT CTGAACCATC CAGCCCAAAG1380TCTTTCCTTG AACAGGTGAG TGTGGATGGG CCTGACGCCG ATCTCGAGAA TGCTGTGACC1440ATACGCCGCC CGACGAGCCT CCGGATGCTC CTGACGAGCC CAACACGGTC AGTCCATCAC1500TATTGGCGCA AGTTTGACAA TGCCTTCATG CGACCGGTGT TTGGAGGTCG CGGATTCGTC1560CCATTTGTCC CCGGGTCACC CACAGAAAGT AGTGTGCCAT TGCTAGCCCC TGTAAGTGAA1620AACTAA 1626其中，包括與SEQ ID NO.1所示序列具有至少95％相同性的序列。
高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因(FaNHX1)氨基酸序列如序列表SEQ IDNO.2所示MMGLGLGDPP ADYGSIAAVG LFVALMCVCI VVGHLLEENR WMNESTTALL IGLGTGTVIL60LASSGKHSHI LVFSEDLFFI YLLPPIIFNA GFQVKKKQFF RNFMTITLFA VVGTLISFSI120ISLGALGLIS RLNIGALELG DYLALGAIFS ATDSVCTLQV LSQDETPFLY SLVFGEGVVN180DATSVVLFNA IQNFDLGDLS TLKFFQFIGN FLYLFGASTF LGVATGLLSA YVIKKLYFGR240HSTDREVAIM MLMAYLSYML AELLDLSGIL TVFFCGILMS HYTWHNVTES SRVTTKHSFA300TLSFISETFL FLYVGMDALD IEKWKIVSET YSPMKSIALS SVILALVLVA RAAFVFPLSY360LSNLTKKTPG EKISVRQQVI 1wwSGLMRGA VSIALTYNKF AKSGHTQLPS NAIMITSTII420VVLFSTIVFG LLTKPLIRLL IPTRHLTREV SALSEPSSPK SFLEQVSVDG PDADLENAVT480IRRPTSLRML LTSPTRSVHH YWRKFDNAFM RPVFGGRGFV PFVPGSPTES SVPLLAPVSE540N541其中，包括與SEQ ID NO.2所示序列具有至少95％相同性的序列。
上述高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因可以構(gòu)建到原核表達(dá)載體中，通過本領(lǐng)域公知的研究方法將高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因?qū)朐松?，通過誘導(dǎo)，大量表達(dá)出高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1。其中，原核表達(dá)載體優(yōu)選原核表達(dá)載體pET-24a。
所述高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1可用于研究高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1的結(jié)構(gòu)、功能以及抗體制備。
所述高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因可以通過微注射、基因槍、農(nóng)桿菌介導(dǎo)、花粉管通道方法將高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因轉(zhuǎn)入作物和牧草，培育出抗鹽品質(zhì)優(yōu)良的品種/系。
所述高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因可以構(gòu)建到任何基于Ti-質(zhì)粒雙元載體中，通過本領(lǐng)域公知的研究方法將高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因?qū)朕r(nóng)桿菌中，進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。
所述高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因作為目的基因，構(gòu)建在植物表達(dá)的Ti-質(zhì)粒雙元載體pBIUbiGFP上；其中有LB和RB的T-DNA25bp重復(fù)序列，胭脂堿合成酶基因的啟動子P-nos和終止子T-nos，還有在真核生物中作為選擇標(biāo)記使用的nptII，用于選擇的抗生素是卡那霉素和G418；在pBIUbiGFP中還有玉米泛素超強(qiáng)啟動子Ubi和綠色熒光蛋白GFP基因；高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因插入在pBIUbiGFP質(zhì)粒的Ubiquitin啟動子和GFP基因之間的多克隆位點上，并且與GFP基因形成融合基因，表達(dá)一個N末端連有GFP蛋白的高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1。
本發(fā)明所提供的高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因的Ti-質(zhì)粒雙元載體轉(zhuǎn)基因育種方法為1)構(gòu)建的雙元轉(zhuǎn)化重組載體質(zhì)粒pBIUbiGFPFaNHX1轉(zhuǎn)化于農(nóng)桿菌中，通過農(nóng)桿菌苗端轉(zhuǎn)化法侵染植物，從而獲得轉(zhuǎn)基因植株。優(yōu)選雙元轉(zhuǎn)化重組載體pBIUbiGFPFaNHX1轉(zhuǎn)化于農(nóng)桿菌AGL1中，通過農(nóng)桿菌苗端轉(zhuǎn)化法侵染小麥，從而獲得轉(zhuǎn)基因小麥。其中，根癌土壤農(nóng)桿菌AGL1是公知公用菌株。
2)轉(zhuǎn)基因株系的檢測方法用PCR和SOUTHERN印跡雜交法檢測轉(zhuǎn)基因植株葉片中FaNHX1基因。
本發(fā)明提供了一種高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因及其應(yīng)用，突破了FaNHX1基因還沒有在植物轉(zhuǎn)基因工程育種中得到應(yīng)用的現(xiàn)狀，首次將FaNHX1基因構(gòu)建在植物表達(dá)的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，以Ti-質(zhì)粒雙元載體pBIUbiGFPFaNHX1轉(zhuǎn)化小麥并且獲得了轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)鑒定轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性明顯的得到提高。FaNHX1基因轉(zhuǎn)基因小麥的T1代植株表現(xiàn)出明顯的抗鹽性，不同株系的T1代植株在170mM NaCl上的成活率為66％-83％，高于對照中國春(44％)，在170mM NaCl上的成活率為27％-38％，高于對照中國春(0％)。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因重組載體可作為商業(yè)用途的品種、品系或作為基因資源在生產(chǎn)上直接使用或進(jìn)行農(nóng)業(yè)生物育種和轉(zhuǎn)基因植物以提高作物的抗鹽性。


圖1、高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因Ti-質(zhì)粒雙元載體構(gòu)建2、高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因簡并引物擴(kuò)增結(jié)果其中，1，2分別是不同的模板濃度，M為入DNA的EcoRI+HindIII雙切Maker圖3、高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因的3’RACE其中，M為100bp Lader，1，2，3代表不同的重復(fù)圖4、高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因的5’RACE其中，M為100bp Lader，1，2代表不同的重復(fù)圖5、高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因全長cDNA擴(kuò)增其中，M為100bp Lader，1，2代表不同的重復(fù)圖6、轉(zhuǎn)基因T1代的Southern雜交結(jié)果其中，MλDNA(Hind III+EcoRI)，B53，B59轉(zhuǎn)基因植株，wt野生型中國春，+質(zhì)粒pBIUbiGFPFaNHX具體實施方式
1.高羊茅Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因部分片斷的克隆Trizol法提取萌發(fā)2周左右的高羊茅幼苗的總RNA，PowerScriptTM逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，用兼并引物P15`-GAT TCT GTW TGC ACM YTR CAG GT-`3，P25`-CAT KAG MCC AGC CCA CCA WAT-`3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得一擴(kuò)增片斷，克隆測序。
按照下述條件擴(kuò)增目的基因片段反應(yīng)體系2×GC buffer I 25μl，10mM dNTP 3μl，10μM引物1和引物2各1.5μl，DNA模板250ng，LA GC Taq酶1μl，加水補(bǔ)足到50μl。
反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性3min，然后進(jìn)行36個循環(huán)，每一個循環(huán)包括94℃變性40s，59℃復(fù)性1min，72℃延伸1min。最后保持在72℃下延伸10min。
2.高羊茅Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因3`末端的獲得根據(jù)高羊茅Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因部分片段的序列，設(shè)計3’RACE基因特異引物P15’-CCT TCG CCA CAT TGT CGT T-3’，巢式引物P25’-AGC CCAATG AAA TCA ATC GC-3’。先使用引物P1和引物Olig(dT)18，反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板擴(kuò)增，產(chǎn)物稀釋50倍，以巢式引物P2和Olig(dT)18經(jīng)過巢式PCR，獲得一擴(kuò)增片斷，克隆測序。
按照下述條件擴(kuò)增目的基因片段反應(yīng)體系2×GC buffer I 25μl，10mM dNTP 3μl，10μM引物1和引物2各1.5μl，DNA Template 250ng，LA GC Taq酶1μl，加水補(bǔ)足到50μl。
反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性3min，然后進(jìn)行36個循環(huán)，每一個循環(huán)包括94℃變性40s，55℃復(fù)性1min，72℃延伸2min。最后保持在72℃下延伸10min。
3.高羊茅Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因5末端的獲得根據(jù)高羊茅Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因部分片段的序列設(shè)計5’RACE基因特異引物.P15’-TGT GCC AGG TAT AGT GCG ACA T-3’，巢式引物P25’-CAGTGG AGT GCC TGC CAA AGT A-3’。先使用引物P1和引物UMP，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板擴(kuò)增，產(chǎn)物稀釋50倍，以引物巢式引物P2和NUMP經(jīng)過巢式PCR，獲得一擴(kuò)增片斷，克隆測序。
按照下述條件擴(kuò)增目的基因片段反應(yīng)體系2×GC buffer I 25μl，1O mM dNTP 3μl，10μM引物1和引物2各1.5μl，DNA Template 250ng，LA GC Taq酶1μl，加水補(bǔ)足到50μl。
反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性3min，然后進(jìn)行36個循環(huán)，每一個循環(huán)包括94℃變性40s，55℃復(fù)性1min，72℃延伸3min。最后保持在72℃下延伸10min。
4.高羊茅Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因全長cDNA的獲得根據(jù)5`Race和3`Race的結(jié)果，設(shè)計了引物對P15’-ACC GGT ATG GGG CTCGGG CTC GGC G-3’，P25’-CCA TGG TTA GTT TTC ACT TAC AGG GGC-3’，擴(kuò)增cDNA模板獲得全長片斷，克隆測序。
按照下述條件擴(kuò)增目的基因片段反應(yīng)體系2×GC buffer I 25μl，10mM dNTP 3μl，10μM引物1和引物2各1.5μl，DNA Template 250ng，LA GC Taq酶1μl，加水補(bǔ)足到50μl。
反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性3min，然后進(jìn)行36個循環(huán)，每一個循環(huán)包括94℃變性40s，51℃復(fù)性1min，72℃延伸2min。最后保持在72℃下延伸10min。
5.高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因測序用克隆載體構(gòu)建將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后分離相應(yīng)大小的條帶回收后與pUCm-T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞，并通過PCR法、酶切質(zhì)粒法等進(jìn)行驗證克隆產(chǎn)物是否正確，然后進(jìn)行測序證明此基因已經(jīng)成功的以克隆質(zhì)粒的形式存儲在大腸桿菌DH10B中。
6.高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因的Ti-質(zhì)粒雙元載體構(gòu)建用于構(gòu)建雙元轉(zhuǎn)化-表達(dá)載體的質(zhì)粒是由pBI121改造而來。首先將pBI121內(nèi)的GUS基因用BamHI和SacI去除，然后與pIRES-EGFP質(zhì)粒上用BamHI和SacI酶切的GFP基因連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞，并通過酶切質(zhì)粒法等進(jìn)行驗證此新載體(命名為pBIGFP)以正確的形式存儲在大腸桿菌DH10B中。
將載體pBlGFP內(nèi)的花椰菜花葉病毒的啟動子35S(p35S)，用HindIII和BamHI去除，然后與pAL76質(zhì)粒上用HindIII和BamHI酶切的玉米泛素超強(qiáng)啟動子Ubi連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞，并通過酶切質(zhì)粒法等進(jìn)行驗證此新載體(命名為pBIUbiGFP)以正確的形式存儲在大腸桿菌DH10B中。
作為目的基因使用的高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因插入在pBIUbiGFP質(zhì)粒的Ubiquitin啟動子和GFP基因之間的多克隆位點上并且與GFP基因形成融合基因，表達(dá)一個N末端連有GFP蛋白的高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1，使用的內(nèi)切酶是AgeI和NcoI。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞，并通過酶切質(zhì)粒法等進(jìn)行驗證此新載體(命名為pBIUbiGFPFaNHX1)以正確的形式存儲在大腸桿菌DH10B中。
7.高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因Ti-質(zhì)粒雙元載體的轉(zhuǎn)基因育種取中國春的種子，升汞滅菌10min，蒸餾水洗滌3次，整齊置于9cm培養(yǎng)皿中，25℃下露白。在4℃，黑暗條件下春化1個月以上。用雙面刀片切出生長點，并滴加1-2滴的含有pBIUbiGFPFaNHX1質(zhì)粒的農(nóng)桿菌AGL1菌液，繼續(xù)在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至新葉長出，移栽。用PCR篩選出轉(zhuǎn)基因植株，將轉(zhuǎn)基因植株加代。
選取兩個轉(zhuǎn)基因株系的T1代，提取萌發(fā)長勢旺盛時期葉片的總DNA，用高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因全長序列作為探針，進(jìn)行Southern雜交，表明高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因在轉(zhuǎn)基因株系B53和B59基因組中存在。
選取四個轉(zhuǎn)基因株系的T1代幼苗分別在添加170mM和300mM的NaCl的MS營養(yǎng)液培養(yǎng)5天后，全部的轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)出比野生型中國春更高的成活率。其中兩個轉(zhuǎn)基因株系在300mM的成活率分別達(dá)到50％和38％，而野生型中國春全部萎蔫死亡。(見表1)表1轉(zhuǎn)基因株系T1代在不同鹽濃度下的成活率比較

序列表SEQ ID NO.1<110>山東大學(xué)<120>高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因及應(yīng)用<141>2005-5-13<170>PatentIn Version 2.1<210>1<211>1626<212>DNA<213>高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因<400>
atgatggggc tcgggctcgg cgacccgccg gcggactacg gctccatcgc cgccgtgggg60ctcttcgtcg cgctcatgtg cgtctgcatc gtcgtcggac acctcctcga ggagaaccga120tggatgaacg agtcaaccac cgcgctcctg attgggctcg gcaccggcac ggtcatcctg180ctcgcgtcaa gcgggaagca ctcgcacata ctcgtcttca gcgaggatct cttcttcatc240tacctgctac cgccaatcat tttcaatgca gggttccaag tgaagaagaa gcagttcttc300cgcaacttca tgactattac attgtttgct gtagttggga ccctcatctc cttcagcata360atatccctcg gtgcgctggg gctaatatca aggctgaaca taggtgccct tgagcttgga420gactacctcg cacttggggc aatattctcg gcaacggact ctgtatgcac cttgcaggtg480ttaagccaag acgagacacc cttcctctac agtttggtct ttggtgaagg tgtcgtcaac540gatgcaacct cagttgtgtt gttcaatgca atccagaact ttgatcttgg agatctcagt600accctcaaat tctttcaatt tattggaaac ttcctttatc tgtttggcgc cagcaccttc660cttggagtag ctactggact tctcagtgct tatgtaatca agaaattgta ctttggcagg720cactccactg atcgtgaagt tgctattatg atgctcatgg cttatttatc ttacatgctg780gctgaattgc ttgatttgag tggtattctc acagttttct tctgtggtat tctaatgtcg840cactatacct ggcacaatgt aacagaaagt tccagggtca caaccaagca ttccttcgcc900acattgtcgt tcatttctga gactttcctc tttctctacg ttggcatgga tgcgctggat960atagaaaagt ggaagattgt tagtgaaaca tatagcccaa tgaaatcaat cgccctgagc1020tccgttattt tggccttggt gctagttgca agagctgctt ttgttttccc actatcctat1080ctgtccaatt tgaccaaaaa aactccaggc gagaagatct ctgttaggca gcaagttatt1140atttggtggt cgggtctcat gagaggtgct gtgtccattg cgttgaccta caataagttt1200gcaaaatcag gtcacactca acttcctagc aatgctatca tgatcaccag tacaatcatt1260gttgttcttt tcagcacaat tgtctttggg ctactgacta agccattgat cagactcctg1320attccaacga ggcacctcac cagggaagtg agcgcccttt ctgaaccatc cagcccaaag1380tctttccttg aacaggtgag tgtggatggg cctgacgccg atctcgagaa tgctgtgacc1440atacgccgcc cgacgagcct ccggatgctc ctgacgagcc caacacggtc agtccatcac1500tattggcgca agtttgacaa tgccttcatg cgaccggtgt ttggaggtcg cggattcgtc1560ccatttgtcc ccgggtcacc cacagaaagt agtgtgccat tgctagcccc tgtaagtgaa1620aactaa 1626
SEQ ID NO.2<110>山東大學(xué)<120>高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因及應(yīng)用<141>2005-5-13<170>PatentIn Version 2.1<210>2<211>541<212>PRT<213>高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因氨基酸序列<400>
MMGLGLGDPP ADYGSIAAVG LFVALMCVCI VVGHLLEENR WMNESTTALL IGLGTGTVIL60LASSGKHSHI LVFSEDLFFI YLLPPIIFNA GFQVKKKQFF RNFMTITLFA VVGTLISFSI120ISLGALGLIS RLNIGALELG DYLALGAIFS ATDSVCTLQV LSQDETPFLY SLVFGEGVVN180DATSVVLFNA IQNFDLGDLS TLKFFQFIGN FLYLFGASTF LGVATGLLSA YVIKKLYFGR240HSTDREVAIM MLMAYLSYML AELLDLSGIL TVFFCGILMS HYTWHNVTES SRVTTKHSFA300TLSFISETFL FLYVGMDALD IEKWKIVSET YSPMKSIALS SVILALVLVA RAAFVFPLSY360LSNLTKKTPG EKISVRQQVI IWWSGLMRGA VSIALTYNKF AKSGHTQLPS NAIMITSTII420VVLFSTIVFG LLTKPLIRLL IPTRHLTREV SALSEPSSPK SFLEQVSVDG PDADLENAVT480IRRPTSLRML LTSPTRSVHH YWRKFDNAFM RPVFGGRGFV PFVPGSPTES SVPLLAPVSE540N54權(quán)利要求
1.高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因，其特征在于具有如SEQ ID NO.1所示的序列ATGATGGGGC TCGGGCTCGG CGACCCGCCG GCGGACTACG GCTCCATCGC CGCCGTGGGG 60CTCTTCGTCG CGCTCATGTG CGTCTGCATC GTCGTCGGAC ACCTCCTCGA GGAGAACCGA 120TGGATGAACG AGTCAACCAC CGCGCTCCTG ATTGGGCTCG GCACCGGCAC GGTCATCCTG 180CTCGCGTCAA GCGGGAAGCA CTCGCACATA CTCGTCTTCA GCGAGGATCT CTTCTTCATC 240TACCTGCTAC CGCCAATCAT TTTCAATGCA GGGTTCCAAG TGAAGAAGAA GCAGTTCTTC 300CGCAACTTCA TGACTATTAC ATTGTTTGCT GTAGTTGGGA CCCTCATCTC CTTCAGCATA 360ATATCCCTCG GTGCGCTGGG GCTAATATCA AGGCTGAACA TAGGTGCCCT TGAGCTTGGA 420GACTACCTCG CACTTGGGGC AATATTCTCG GCAACGGACT CTGTATGCAC CTTGCAGGTG 480TTAAGCCAAG ACGAGACACC CTTCCTCTAC AGTTTGGTCT TTGGTGAAGG TGTCGTCAAC 540GATGCAACCT CAGTTGTGTT GTTCAATGCA ATCCAGAACT TTGATCTTGG AGATCTCAGT 600ACCCTCAAAT TCTTTCAATT TATTGGAAAC TTCCTTTATC TGTTTGGCGC CAGCACCTTC 660CTTGGAGTAG CTACTGGACT TCTCAGTGCT TATGTAATCA AGAAATTGTA CTTTGGCAGG 720CACTCCACTG ATCGTGAAGT TGCTATTATG ATGCTCATGG CTTATTTATC TTACATGCTG 780GCTGAATTGC TTGATTTGAG TGGTATTCTC ACAGTTTTCT TCTGTGGTAT TCTAATGTCG 840CACTATACCT GGCACAATGT AACAGAAAGT TCCAGGGTCA CAACCAAGCA TTCCTTCGCC 900ACATTGTCGT TCATTTCTGA GACTTTCCTC TTTCTCTACG TTGGCATGGA TGCGCTGGAT 960ATAGAAAAGT GGAAGATTGT TAGTGAAACA TATAGCCCAA TGAAATCAAT CGCCCTGAGC 1020TCCGTTATTT TGGCCTTGGT GCTAGTTGCA AGAGCTGCTT TTGTTTTCCC ACTATCCTAT 1080CTGTCCAATT TGACCAAAAA AACTCCAGGC GAGAAGATCT CTGTTAGGCA GCAAGTTATT 1140ATTTGGTGGT CGGGTCTCAT GAGAGGTGCT GTGTCCATTG CGTTGACCTA CAATAAGTTT 1200GCAAAATCAG GTCACACTCA ACTTCCTAGC AATGCTATCA TGATCACCAG TACAATCATT 1260GTTGTTCTTT TCAGCACAAT TGTCTTTGGG CTACTGACTA AGCCATTGAT CAGACTCCTG 1320ATTCCAACGA GGCACCTCAC CAGGGAAGTG AGCGCCCTTT CTGAACCATC CAGCCCAAAG 1380TCTTTCCTTG AACAGGTGAG TGTGGATGGG CCTGACGCCG ATCTCGAGAA TGCTGTGACC 1440ATACGCCGCC CGACGAGCCT CCGGATGCTC CTGACGAGCC CAACACGGTC AGTCCATCAC 1500TATTGGCGCA AGTTTGACAA TGCCTTCATG CGACCGGTGT TTGGAGGTCG CGGATTCGTC 1560CCATTTGTCC CCGGGTCACC CACAGAAAGT AGTGTGCCAT TGCTAGCCCC TGTAAGTGAA 1620AACTAA 1626其中，包括與SEQ ID NO.1所示序列具有至少95％相同性的序列。
2.高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因，其特征在于具有如序列表SEQ IDNO.2所示氨基酸序列MMGLGLGDPP ADYGSIAAVG LFVALMCVCI VVGHLLEENR WMNESTTALL IGLGTGTVIL 60LASSGKHSHI LVFSEDLFFI YLLPPIIFNA GFQVKKKQFF RNFMTITLFA VVGTLISFSI 120ISLGALGLIS RLNIGALELG DYLALGAIFS ATDSVCTLQV LSQDETPFLY SLVFGEGVVN 180DATSVVLFNA IQNFDLGDLS TLKFFQFIGN FLYLFGASTF LGVATGLLSA YVIKKLYFGR 240HSTDREVAIM MLMAYLSYML AELLDLSGIL TVFFCGILMS HYTWHNVTES SRVTTKHSFA 300TLSFISETFL FLYVGMDALD IEKWKIVSET YSPMKSIALS SVILALVLVA RAAFVFPLSY 360LSNLTKKTPG EKISVRQQVI IWWSGLMRGA VSIALTYNKF AKSGHTQLPS NAIMITSTII 420VVLFSTIVFG LLTKPLIRLL IPTRHLTREV SALSEPSSPK SFLEQVSVDG PDADLENAVT 480IRRPTSLRML LTSPTRSVHH YWRKFDNAFM RPVFGGRGFV PFVPGSPTES SVPLLAPVSE 540N 541其中，包括與SEQ ID NO.2所示序列具有至少95％相同性的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因，其特征是，所述高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因可以構(gòu)建到原核表達(dá)載體中，通過本領(lǐng)域公知的研究方法將高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因?qū)朐松?，通過誘導(dǎo)，大量表達(dá)出高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因，其特征是，所述高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1可用于研究高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1的結(jié)構(gòu)、功能以及抗體制備。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因，其特征是，所述高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因可以通過微注射、基因槍、農(nóng)桿菌介導(dǎo)、花粉管通道方法將高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因轉(zhuǎn)入作物和牧草，培育出抗鹽品質(zhì)優(yōu)良的品種/系。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因，其特征是，所述高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因可以構(gòu)建到任何基于Ti-質(zhì)粒雙元載體中，通過本領(lǐng)域公知的研究方法將高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因?qū)朕r(nóng)桿菌中，進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因，其特征是，將所述高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因作為目的基因，構(gòu)建在植物表達(dá)的Ti-質(zhì)粒雙元載體pBIUbiGFP上；其中有LB和RB的T-DNA25bp重復(fù)序列，胭脂堿合成酶基因的啟動子P-nos和終止子T-nos，還有在真核生物中作為選擇標(biāo)記使用的npt II，用于選擇的抗生素是卡那霉素和G418；在pBIUbiGFP中還有玉米泛素超強(qiáng)啟動子Ubi和綠色熒光蛋白GFP基因；高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因插入在pBIUbiGFP質(zhì)粒的Ubiquitin啟動子和GFP基因之間的多克隆位點上，并且與GFP基因形成融合基因，表達(dá)一個N末端連有GFP蛋白的高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的高羊茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白1基因，其特征是，所述的雙元轉(zhuǎn)化重組載體pBIUbiGFPFaNHX1可轉(zhuǎn)化于農(nóng)桿菌AGL1中，通過農(nóng)桿菌苗端轉(zhuǎn)化法侵染小麥，從而獲得轉(zhuǎn)基因小麥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高羊茅液泡膜Na
文檔編號C12N15/29GK1699568SQ200510043509
公開日2005年11月23日 申請日期2005年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月13日
發(fā)明者夏光敏, 薛哲勇, 劉恒 申請人:山東大學(xué)