專利名稱：高冰草液泡膜Na的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因(TeNHX2)，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植物消除Na+毒害的策略包括降低Na+的吸收、Na+的外排和Na+的區(qū)隔化。Na+吸收是一個復(fù)雜的過程。Na+的外排和區(qū)隔化是間接的主動運輸過程，主要由Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白來調(diào)節(jié)。Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白(Na+/H+antiporter or exchanger，NHA or NHE)是細菌、酵母、藻類、動物和高等植物的膜系統(tǒng)上普遍存在的一種轉(zhuǎn)運蛋白，參與細胞質(zhì)內(nèi)的pH、Na+濃度調(diào)節(jié)及細胞體積變化等生命活動。自1985年Blumwald和Plooe首先在甜菜根部貯藏組織的液泡膜上發(fā)現(xiàn)Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運活性以來，人們相繼發(fā)現(xiàn)在鹽生植物如濱藜、兼性CAM植物冰葉日中花、甜菜等和較耐鹽的甜土植物如大麥、海濱車前、長春花、棉花、向日葵等的液泡膜上普遍存在著Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運活性。Nass等在酵母的前液泡膜(prevacuole)上也發(fā)現(xiàn)了一種Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白。大量實驗表明Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運活性的有無和高低與植物和酵母的耐鹽性密切相關(guān)，在高鹽濃度下植物和酵母可以分別通過質(zhì)膜和液泡膜上的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運將Na+運出細胞和將Na+區(qū)域化在液泡內(nèi)，維持細胞質(zhì)內(nèi)Na+穩(wěn)態(tài)和Na+/K+比相對穩(wěn)定，以適應(yīng)鹽漬環(huán)境。耐鹽植物能夠通過Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白將大部分Na+區(qū)域化到液泡中，因而既能避免離子脅迫，又能進行滲透調(diào)節(jié)。因此Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白在植物耐鹽性中的作用已越來越受到重視。目前人們已經(jīng)從細菌、酵母、動物和高等植物中相繼獲得了編碼Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的基因。
把編碼液泡膜上Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的基因(如擬南芥的AtNHX1與酵母的NHX1等)轉(zhuǎn)化到鹽敏感植物中，并使其在液泡膜上過量表達以提高植物耐鹽性，是可行的植物基因工程策略。已在擬南芥、番茄、甜菜等植物獲得高耐鹽的轉(zhuǎn)基因植株。
十倍體高冰草(Thinopyrum ponticum Podp.(Agropyron elongatum(Host.)Nevski))是一種鹽生植物，高冰草最突出的特點就是能在其他高產(chǎn)作物不能生長的重鹽堿土上種植。目前有關(guān)高冰草液泡膜上Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2的基因及其在植物轉(zhuǎn)基因工程育種中的應(yīng)用還沒有報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對目前還沒有報道耐鹽堿的十倍體高冰草(Thinopyrum ponticum Podp.(Agropyron elongatum(Host.)Nevski))NHX基因及其在植物轉(zhuǎn)基因育種工程技術(shù)中得到應(yīng)用的現(xiàn)狀，本發(fā)明提供一種高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因、重組載體及植物轉(zhuǎn)基因育種方法，將高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因構(gòu)建在植物表達的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化小麥獲得轉(zhuǎn)基因植株。
本發(fā)明所提供的高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因(TeNHX2)，具有如SEQID NO.1所示的序列ATGGGGTACC AAGTGGTGGC GGCGCAGCTG GCGCGGCTGA GCGGCGCGCT GGGCACCTCG60GACCACGCGT CCGTGGTCTC CATCAACCTC TTCGTGGCGC TGCTCTGCGC CTGCATCGTC120CTCGGCCACC TCCTCGAGGA GAACCGCTGG CTCAACGAGT CCATCACCGC CCTCATCATC180GGGCTGTGCA CCGGCGTGGT GATCCTGATG ACCACCAAGG GGAAGAGCTC GCACGTGCTC240GTCTTCAGCG AGGACCTCTT CTTCATATAC CTCCTGCCTC CCATCATCTT CAACGCCGGT300
TTCCAGGTGA AGAAGAAGCA GTTCTTCCGG AATTTCATGA CAATCACACT ATTTGGTGCT360GTTGGGACGA TGATGTCGTT TTTCACAATA TCTCTTGCTG CCATTGCGAT ATTCAGCAGG420ATGAACATTG GGACACTGGA CGTATCAGAT TTTCTTGCAA TTGGAGCTAT CTTTTCCGCG490ACAGATTCCG TCTGCACTCT ACAGGTTCTC AATCAGGACG AGACGCCCTT TTTGTACAGT540CTGGTGTTCG GGGAAGGTGT TGTGAACGAT GCCACATCGG TCGTGCTTTT CAACGCGCTC600CAGAACTTCG ATCCTAACCA AATCGACGCG ATCGTCATTC TGAAGTTCTT GGGGAACTTC660TGCTACTTAT TCGTGTCAAG CACCTTCCTT GGAGTGTTTA CTGGATTGCT TAGTGCATAC720GTCATCAAGA AGTTATACAT AGGAAGGCAT TCTACTGACC GTGAGGTTGC ACTTGTGATG780CTCATGGCCT ACCTCTCATA TATGCTAGCT GAGCTGCTAG ATTTGAGTGG CATCCTCACT840GTATTCTTCT GTGGTATTGT GATGTCACAT TACACCTGGC ATAACGTGAC AGAGAGCTCA900AGAGTTACAA CAAAGCATGC GTTTGCAACC TTGTCCTTCA TCGCYGAGAC ATTTCTCTTC960CTTTATGTTG GGATGGATGC ACTGGATATT GAGAAGTGGA AATTTGCTAG TGACAGCCCT1020GGCAAATCCA TTGGAATAAG CTCAATTTTG CTCGGATTGG TTCTGGTTGG AAGAGCTGCT1080TTCGTCTTCC CACTCTCGTT CTTATCCAAC CTGACAAAGA AGACGGAGCT CGAAAAAATA1140AGCTGGAGGC AGCAAATCGT AATATGGTGG GCTGGGCTGA TGAGAGGAGC TGTGTCGATC1200GCTCTTGCTT ACAATAAGTT TACAAGATCT GGTCACACGC AGCTACACGG CAACGCGATA1260ATGATCACCA GCACCATCAC TGTCGTTCTG TTTAGCACTA TGCTGTTTGG CATTTTGACA1320AAGCCTCTGA TCCGGTTCCT GCTGCCCGCG TCGAGCAACG GCGCCGCCTC GGATCCCGCG1380TCACCGAAGT CCCTGCACTC TCCTCTCCTC ACAAGCCAGC TAGGCTCGGA CCTGGAGGCG1440CCTCTCCCCA TCGTGAGGCC CTCCAGCCTC CGGATGCTCA TCACCAAGCC GACCCACACC1500ATCCACTACT ACTGGCGCAA GTTCGACGAC GCGCTGATGC GCCCGATGTT CGGAGGGCGC1560GGGTTCGTGC CCTACTCCCC AGGATCACCC ACCGATCCGA ACGTACTAGT GGAATGA 1617其中，包括與SEQ ID NO.1所示序列具有至少95％相同性的序列。
高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因(TeNHX2)氨基酸序列如序列表SEQID NO.2所示MGYQVVAAQL ARLSGALGTS DHASVVSINL FVALLCACIV LGHLLEENRW LNESITALII60GLCTGVVILM TTKGKSSHVL VFSEDLFFIY LLPPIIFNAG FQVKKKQFFR NFMTITLFGA120VGTMMSFFTI SLAAIAIFSR MNIGTLDVSD FLAIGAIFSA TDSVCTLQVL NQDETPFLYS180LVFGEGVVND ATSVVLFNAL QNFDPNQIDA IVILKFLGNF CYLFVSSTFL GVFTGLLSAY240VIKKLYIGRH STDREVALVM LMAYLSYMLA ELLDLSGILT VFFCGIVMSH YTWHNVTESS300RVTTKHAFAT LSFI*ETFLF LYVGMDALDI EKWKFASDSP GKSIGISSIL LGLVLVGRAA360FVFPLSFLSN LTKKTELEKI SWRQQIVIWW AGLMRGAVSI ALAYNKFTRS GHTQLHGNAI420MITSTITVVL FSTMLFGILT KPLIRFLLPA SSNGAASDPA SPKSLHSPLL TSQLGSDLEA480PLPIVRPSSL RMLITKPTHT IHYYWRKFDD ALMRPMFGGR GFVPYSPGSP TDPNVLVE 538其中，包括與SEQ ID NO.2所示序列具有至少95％相同性的序列。
上述高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因可以構(gòu)建到原核表達載體中，通過本領(lǐng)域公知的研究方法將高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因?qū)朐松?，通過誘導(dǎo)，大量表達出高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2。其中，原核表達載體優(yōu)選原核表達載體pET-24a。
所述高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2可用于研究高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2的結(jié)構(gòu)、功能以及抗體制備。
所述高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因可以通過微注射、基因槍、農(nóng)桿菌介導(dǎo)、花粉管通道方法將高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因轉(zhuǎn)入作物和牧草，培育出抗鹽品質(zhì)優(yōu)良的品種/系。
所述高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因可以構(gòu)建到任何基于Ti-質(zhì)粒雙元載體中，通過本領(lǐng)域公知的研究方法將高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因?qū)朕r(nóng)桿菌中，進行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。
所述高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因作為目的基因，構(gòu)建在植物表達的Ti-質(zhì)粒雙元載體pBIUbiGFP上；其中有LB和RB的T-DNA25bp重復(fù)序列，胭脂堿合成酶基因的啟動子P-nos和終止子T-nos，還有在真核生物中作為選擇標記使用的nptII，用于選擇的抗生素是卡那霉素和G418；在pBIUbiGFP中還有玉米泛素超強啟動子Ubi和綠色熒光蛋白GFP基因；高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因插入在pBIUbiGFP質(zhì)粒的Ubiquitin啟動子和GFP基因之間的多克隆位點上，并且與GFP基因形成融合基因，表達一個N末端連有GFP蛋白的高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2。
本發(fā)明所提供的高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因的Ti-質(zhì)粒雙元載體轉(zhuǎn)基因育種方法為1)構(gòu)建的雙元轉(zhuǎn)化重組載體質(zhì)粒pBIUbiGFPTeNHX2轉(zhuǎn)化于農(nóng)桿菌中，通過農(nóng)桿菌苗端轉(zhuǎn)化法侵染植物，從而獲得轉(zhuǎn)基因植株。優(yōu)選雙元轉(zhuǎn)化重組載體pBIUbiGFPTeNHX2轉(zhuǎn)化于農(nóng)桿菌AGLl中，通過農(nóng)桿菌苗端轉(zhuǎn)化法侵染小麥，從而獲得轉(zhuǎn)基因小麥。其中，根癌土壤農(nóng)桿菌AGL1是公知公用菌株。
2)轉(zhuǎn)基因株系的檢測方法用PCR和SOUTHERN印跡雜交法檢測轉(zhuǎn)基因植株葉片中TeNHX2基因。
本發(fā)明提供了一種高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因及其應(yīng)用，突破了TeNHX2基因還沒有在植物轉(zhuǎn)基因工程育種中得到應(yīng)用的現(xiàn)狀，首次將TeNHX2基因構(gòu)建在植物表達的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，以Ti-質(zhì)粒雙元載體pBIUbiGFPTeNHX2轉(zhuǎn)化小麥并且獲得了轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)鑒定轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性明顯的得到提高。TeNHX2基因轉(zhuǎn)基因小麥的T1代植株表現(xiàn)出明顯的抗鹽性，不同株系的T1代植株在170mM NaCl上的成活率為66％-83％，高于對照中國春(44％)，在170mM NaCl上的成活率為27％-38％，高于對照中國春(0％)。
本方明的轉(zhuǎn)基因重組載體可作為商業(yè)用途的品種、品系或作為基因資源在生產(chǎn)上直接使用或進行農(nóng)業(yè)生物育種和轉(zhuǎn)基因植物以提高作物的抗鹽性。


圖1、高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因Ti-質(zhì)粒雙元載體構(gòu)建2、高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因簡并引物擴增結(jié)果其中，1，2分別是不同的模板濃度，M為入DNA的EcoRI+HindIII雙切Maker圖3、高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因的3’RACE其中，M為100bp Lader，1，2，3代表不同的重復(fù)圖4、高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因的5’RACE其中，M為100bp Lader，1，2代表不同的重復(fù)圖5、高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因全長cDNA擴增其中，M為100bp Lader，1，2代表不同的重復(fù)圖6、轉(zhuǎn)基因T1代的Southern雜交結(jié)果其中，MλDNA(HindIII+EcoRI)，B53，B59轉(zhuǎn)基因植株，wt野生型中國春，+質(zhì)粒pBIUbiGFPTeNHX具體實施方式
1.高冰草Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因部分片斷的克隆Trizol法提取萌發(fā)2周左右的高冰草幼苗的總RNA，PowerScriptTM逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，用兼并引物P15`-GAT TCT GTW TGC ACM YTR CAG GT-`3，P25`-CAT KAG MCC AGC CCA CCA WAT-`3進行PCR擴增，獲得一擴增片斷，克隆測序。
按照下述條件擴增目的基因片段反應(yīng)體系2×GC buffer I 25μl，10mM dNTP 3μl，10μM引物1和引物2各1.5μl，DNA模板250ng，LA GC Taq酶1μl，加水補足到50μl。
反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性3min，然后進行36個循環(huán)，每一個循環(huán)包括94℃變性40s，59℃復(fù)性1min，72℃延伸1min。最后保持在72℃下延伸10min。
2.高冰草Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因3末端的獲得根據(jù)高冰草Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因部分片段的序列，設(shè)計3’RACE基因特異引物P15’-GCA CCC TAC AGG TTC TC-3’，巢式引物P25’-CCG AGA CTT TTC TTTTCC-3’。先使用引物Pl和引物Olig(dT)18，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板擴增，產(chǎn)物稀釋50倍，以巢式引物P2和Olig(dT)18經(jīng)過巢式PCR，獲得一擴增片斷，克隆測序。
按照下述條件擴增目的基因片段反應(yīng)體系2×GC buffer I 25μl，10mM dNTP 3μl，10μM引物1和引物2各1.5μl，DNA Template 250ng，LA GC Taq酶1μl，加水補足到50μl。
反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性3min，然后進行36個循環(huán)，每一個循環(huán)包括94℃變性40s，55℃復(fù)性1min，72℃延伸2min。最后保持在72℃下延伸10min。
3.高冰草Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因5末端的獲得根據(jù)高冰草Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因部分片段的序列設(shè)計5’RACE基因特異引物.P15’-ATC CTG GGG AGT AGG GCA CGA AC-3’，巢式引物P25’-GTC TCGGCG ATG AAG GAC AAG GT-3’。先使用引物P1和引物UMP，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板擴增，產(chǎn)物稀釋50倍，以引物巢式引物P2和NUMP經(jīng)過巢式PCR，獲得一擴增片斷，克隆測序。
按照下述條件擴增目的基因片段反應(yīng)體系2×GC buffer I 25μl，10mM dNTP 3μl，10μM引物1和引物2各1.5μl，DNA Template 250ng，LA GC Taq酶1μl，加水補足到50μl。
反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性3min，然后進行36個循環(huán)，每一個循環(huán)包括94℃變性40s，55℃復(fù)性1min，72℃延伸3min。最后保持在72℃下延伸10min。
4.高冰草Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因全長cDNA的獲得根據(jù)5`Race和3`Race的結(jié)果，設(shè)計了引物對P15’-ACC GGT ATG GGG TAC CAAGTG GTG-3’，P25’-CCA TGG ATT CCA CTA GTA CGT TCG-3’，擴增cDNA模板獲得全長片斷，克隆測序。
按照下述條件擴增目的基因片段反應(yīng)體系2×GC buffer I 25μl，10mM dNTP 3μl，10μM引物1和引物2各1.5μl，DNA Template 250ng，LA GC Taq酶1μl，加水補足到50μl。
反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性3min，然后進行36個循環(huán)，每一個循環(huán)包括94℃變性40s，51℃復(fù)性1min，72℃延伸2min。最后保持在72℃下延伸10min。
5.高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因測序用克隆載體構(gòu)建將PCR擴增產(chǎn)物電泳后分離相應(yīng)大小的條帶回收后與pUCm-T載體進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B感受態(tài)細胞，并通過PCR法、酶切質(zhì)粒法等進行驗證克隆產(chǎn)物是否正確，然后進行測序證明此基因已經(jīng)成功的以克隆質(zhì)粒的形式存儲在大腸桿菌DH10B中。
6.高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因的Ti-質(zhì)粒雙元載體構(gòu)建用于構(gòu)建雙元轉(zhuǎn)化-表達載體的質(zhì)粒是由pBI121改造而來。首先將pBI121內(nèi)的GUS基因用BamHI和SacI去除，然后與pIRES-EGFP質(zhì)粒上用BamHI和SacI酶切的GFP基因連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B感受態(tài)細胞，并通過酶切質(zhì)粒法等進行驗證此新載體(命名為pBIGFP)以正確的形式存儲在大腸桿菌DH10B中。
將載體pBIGFP內(nèi)的花椰菜花葉病毒的啟動子35S(p35S)，用HindIII和BamHI去除，然后與pAL76質(zhì)粒上用HindIII和BamHI酶切的玉米泛素超強啟動子Ubi連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B感受態(tài)細胞，并通過酶切質(zhì)粒法等進行驗證此新載體(命名為pBIUbiGFP)以正確的形式存儲在大腸桿菌DH10B中。
作為目的基因使用的高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因插入在pBIUbiGFP質(zhì)粒的Ubiquitin啟動子和GFP基因之間的多克隆位點上并且與GFP基因形成融合基因，表達一個N末端連有GFP蛋白的高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2，使用的內(nèi)切酶是AgeI和NcoI。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B感受態(tài)細胞，并通過酶切質(zhì)粒法等進行驗證此新載體(命名為pBIUbiGFPTeNHX2)以正確的形式存儲在大腸桿菌DH10B中。
7.高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因Ti-質(zhì)粒雙元載體的轉(zhuǎn)基因育種取中國春的種子，升汞滅菌10min，蒸餾水洗滌3次，整齊置于9cm培養(yǎng)皿中，25℃下露白。在4℃，黑暗條件下春化1個月以上。用雙面刀片切出生長點，并滴加1-2滴的含有pBIUbiGFPTeNHX2質(zhì)粒的農(nóng)桿菌AGL1菌液，繼續(xù)在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至新葉長出，移栽。用PCR篩選出轉(zhuǎn)基因植株，將轉(zhuǎn)基因植株加代。
選取兩個轉(zhuǎn)基因株系的T1代，提取萌發(fā)長勢旺盛時期葉片的總DNA，用高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因全長序列作為探針，進行Southern雜交，表明高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因在轉(zhuǎn)基因株系B53和B59基因組中存在。
選取四個轉(zhuǎn)基因株系的T1代幼苗分別在添加170mM和300mM的NaCl的MS營養(yǎng)液培養(yǎng)5天后，全部的轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)出比野生型中國春更高的成活率。其中兩個轉(zhuǎn)基因株系在300mM的成活率分別達到50％和38％，而野生型中國春全部萎蔫死亡。(見表1)表1轉(zhuǎn)基因株系T1代在不同鹽濃度下的成活率比較

序列表SEQ ID NO.1<110>山東大學<120>高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因及應(yīng)用<141>2005-5-13<170>PatentIn Version 2.1<210>1<211>1617<212>DNA<213>高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因<400>
atggggtacc aagtggtggc ggcgcagctg gcgcggctga gcggcgcgct gggcacctcg60gaccacgcgt ccgtggtctc catcaacctc ttcgtggcgc tgctctgcgc ctgcatcgtc120ctcggccacc tcctcgagga gaaccgctgg ctcaacgagt ccatcaccgc cctcatcatc180gggctgtgca ccggcgtggt gatcctgatg accaccaagg ggaagagctc gcacgtgctc240gtcttcagcg aggacctctt cttcatatac ctcctgcctc ccatcatctt caacgccggt300ttccaggtga agaagaagca gttcttccgg aatttcatga caatcacact atttggtgct360gttgggacga tgatgtcgtt tttcacaata tctcttgctg ccattgcgat attcagcagg420atgaacattg ggacactgga cgtatcagat tttcttgcaa ttggagctat cttttccgcg490acagattccg tctgcactct acaggttctc aatcaggacg agacgccctt tttgtacagt540ctggtgttcg gggaaggtgt tgtgaacgat gccacatcgg tcgtgctttt caacgcgctc600cagaacttcg atcctaacca aatcgacgcg atcgtcattc tgaagttctt ggggaacttc660tgctacttat tcgtgtcaag caccttcctt ggagtgttta ctggattgct tagtgcatac720gtcatcaaga agttatacat aggaaggcat tctactgacc gtgaggttgc acttgtgatg780ctcatggcct acctctcata tatgctagct gagctgctag atttgagtgg catcctcact840gtattcttct gtggtattgt gatgtcacat tacacctggc ataacgtgac agagagctca900agagttacaa caaagcatgc gtttgcaacc ttgtccttca tcgcygagac atttctcttc960ctttatgttg ggatggatgc actggatatt gagaagtgga aatttgctag tgacagccct1020ggcaaatcca ttggaataag ctcaattttg ctcggattgg ttctggttgg aagagctgct1080ttcgtcttcc cactctcgtt cttatccaac ctgacaaaga agacggagct cgaaaaaata1140agctggaggc agcaaatcgt aatatggtgg gctgggctga tgagaggagc tgtgtcgatc1200gctcttgctt acaataagtt tacaagatct ggtcacacgc agctacacgg caacgcgata1260atgatcacca gcaccatcac tgtcgttctg tttagcacta tgctgtttgg cattttgaca1320aagcctctga tccggttcct gctgcccgcg tcgagcaacg gcgccgcctc ggatcccgcg1380tcaccgaagt ccctgcactc tcctctcctc acaagccagc taggctcgga cctggaggcg1440cctctcccca tcgtgaggcc ctccagcctc cggatgctca tcaccaagcc gacccacacc1500atccactact actggcgcaa gttcgacgac gcgctgatgc gcccgatgtt cggagggcgc1560gggttcgtgc cctactcccc aggatcaccc gccgatccga acgtactagt ggaatga 1617
SEQ ID NO.2<110>山東大學<120>高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因及應(yīng)用<141>2005-5-13<170>PatentIn Version 2.1<210>2<211>538<212>PRT<213>高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因氨基酸序列<400>
MGYQVVAAQL ARLSGALGTS DHASVVSINL FVALLCACIV LGHLLEENRW LNESITALII60GLCTGVVILM TTKGKSSHVL VFSEDLFFIY LLPPIIFNAG FQVKKKQFFR NFMTITLFGA120VGTMMSFFTI SLAAIAIFSR MNIGTLDVSD FLAIGAIFSA TDSVCTLQVL NQDETPFLYS180LVFGEGVVND ATSVVLFNAL QNFDPNQIDA IVILKFLGNF CYLFVSSTFL GVFTGLLSAY240VIKKLYIGRH STDREVALVM LMAYLSYMLA ELLDLSGILT VFFCGIVMSH YTWHNVTESS300RVTTKHAFAT LSFI*ETFLF LYVGMDALDI EKWKFASDSP GKSIGISSIL LGLVLVGRAA360FVFPLSFLSN LTKKTELEKI SWRQQIVIWW AGLMRGAVSI ALAYNKFTRS GHTQLHGNAI420MITSTITVVL FSTMLFGILT KPLIRFLLPA SSNGAASDPA SPKSLHSPLL TSQLGSDLEA480PLPIVRPSSL RMLITKPTHT IHYYWRKFDD ALMRPMFGGR GFVPYSPGSP TDPNVLVE 538
權(quán)利要求
1.高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因，其特征在于具有如SEQ ID NO.1所示的序列ATGGGGTACC AAGTGGTGGC GGCGCAGCTG GCGCGGCTGA GCGGCGCGCT GGGCACCTCG 60GACCACGCGT CCGTGGTCTC CATCAACCTC TTCGTGGCGC TGCTCTGCGC CTGCATCGTC 120CTCGGCCACC TCCTCGAGGA GAACCGCTGG CTCAACGAGT CCATCACCGC CCTCATCATC 180GGGCTGTGCA CCGGCGTGGT GATCCTGATG ACCACCAAGG GGAAGAGCTC GCACGTGCTC 240GTCTTCAGCG AGGACCTCTT CTTCATATAC CTCCTGCCTC CCATCATCTT CAACGCCGGT 300TTCCAGGTGA AGAAGAAGCA GTTCTTCCGG AATTTCATGA CAATCACACT ATTTGGTGCT 360GTTGGGACGA TGATGTCGTT TTTCACAATA TCTCTTGCTG CCATTGCGAT ATTCAGCAGG 420ATGAACATTG GGACACTGGA CGTATCAGAT TTTCTTGCAA TTGGAGCTAT CTTTTCCGCG 490ACAGATTCCG TCTGCACTCT ACAGGTTCTC AATCAGGACG AGACGCCCTT TTTGTACAGT 540CTGGTGTTCG GGGAAGGTGT TGTGAACGAT GCCACATCGG TCGTGCTTTT CAACGCGCTC 600CAGAACTTCG ATCCTAACCA AATCGACGCG ATCGTCATTC TGAAGTTCTT GGGGAACTTC 660TGCTACTTAT TCGTGTCAAG CACCTTCCTT GGAGTGTTTA CTGGATTGCT TAGTGCATAC 720GTCATCAAGA AGTTATACAT AGGAAGGCAT TCTACTGACC GTGAGGTTGC ACTTGTGATG 780CTCATGGCCT ACCTCTCATA TATGCTAGCT GAGCTGCTAG ATTTGAGTGG CATCCTCACT 840GTATTCTTCT GTGGTATTGT GATGTCACAT TACACCTGGC ATAACGTGAC AGAGAGCTCA 900AGAGTTACAA CAAAGCATGC GTTTGCAACC TTGTCCTTCA TCGCYGAGAC ATTTCTCTTC 960CTTTATGTTG GGATGGATGC ACTGGATATT GAGAAGTGGA AATTTGCTAG TGACAGCCCT 1020GGCAAATCCA TTGGAATAAG CTCAATTTTG CTCGGATTGG TTCTGGTTGG AAGAGCTGCT 1080TTCGTCTTCC CACTCTCGTT CTTATCCAAC CTGACAAAGA AGACGGAGCT CGAAAAAATA 1140AGCTGGAGGC AGCAAATCGT AATATGGTGG GCTGGGCTGA TGAGAGGAGC TGTGTCGATC 1200GCTCTTGCTT ACAATAAGTT TACAAGATCT GGTCACACGC AGCTACACGG CAACGCGATA 1260ATGATCACCA GCACCATCAC TGTCGTTCTG TTTAGCACTA TGCTGTTTGG CATTTTGACA 1320AAGCCTCTGA TCCGGTTCCT GCTGCCCGCG TCGAGCAACG GCGCCGCCTC GGATCCCGCG 1380TCACCGAAGT CCCTGCACTC TCCTCTCCTC ACAAGCCAGC TAGGCTCGGA CCTGGAGGCG 1440CCTCTCCCCA TCGTGAGGCC CTCCAGCCTC CGGATGCTCA TCACCAAGCC GACCCACACC 1500ATCCACTACT ACTGGCGCAA GTTCGACGAC GCGCTGATGC GCCCGATGTT CGGAGGGCGC 1560GGGTTCGTGC CCTACTCCCC AGGATCACCC ACCGATCCGA ACGTACTAGT GGAATGA 1617其中，包括與SEQ ID NO.1所示序列具有至少95％相同性的序列。
2.高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2，其特征在于具有如序列表SEQ ID NO.2所示氨基酸序列MGYQVVAAQL ARLSGALGTS DHASVVSINL FVALLCACIV LGHLLEENRW LNESITALII 60GLCTGVVILM TTKGKSSHVL VFSEDLFFIY LLPPIIFNAG FQVKKKQFFR NFMTITLFGA 120VGTMMSFFTI SLAAIAIFSR MNIGTLDVSD FLAIGAIFSA TDSVCTLQVL NQDETPFLYS 180LVFGEGVVND ATSVVLFNAL QNFDPNQIDA IVILKFLGNF CYLFVSSTFL GVFTGLLSAY 240VIKKLYIGRH STDREVALVM LMAYLSYMLA ELLDLSGILT VFFCGIVMSH YTWHNVTESS 300RVTTKHAFAT LSFI*ETFLF LYVGMDALDI EKWKFASDSP GKSIGISSIL LGLVLVGRAA 360FVFPLSFLSN LTKKTELEKI SWRQQIVIWW AGLMRGAVSI ALAYNKFTRS GHTQLHGNAI 420MITSTITVVL FSTMLFGILT KPLIRFLLPA SSNGAASDPA SPKSLHSPLL TSQLGSDLEA 480PLPIVRPSSL RMLITKPTHT IHYYWRKFDD ALMRPMFGGR GFVPYSPGSP TDPNVLVE538其中，包括與SEQ ID NO.2所示序列具有至少95％相同性的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因，其特征是，所述高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因可以構(gòu)建到原核表達載體中，通過本領(lǐng)域公知的研究方法將高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因?qū)朐松?，通過誘導(dǎo)，大量表達出高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因，其特征是，所述高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2可用于研究高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2的結(jié)構(gòu)、功能以及抗體制備。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因，其特征是，所述高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因可以通過微注射、基因槍、農(nóng)桿菌介導(dǎo)、花粉管通道方法將高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因轉(zhuǎn)入作物和牧草，培育出抗鹽品質(zhì)優(yōu)良的品種/系。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因，其特征是，所述高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因可以構(gòu)建到任何基于Ti-質(zhì)粒雙元載體中，通過本領(lǐng)域公知的研究方法將高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因?qū)朕r(nóng)桿菌中，進行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因，其特征是，將所述高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因作為目的基因，構(gòu)建在植物表達的Ti-質(zhì)粒雙元載體pBIUbiGFP上；其中有LB和RB的T-DNA25bp重復(fù)序列，胭脂堿合成酶基因的啟動子P-nos和終止子T-nos，還有在真核生物中作為選擇標記使用的npt II，用于選擇的抗生素是卡那霉素和G418；在pBIUbiGFP中還有玉米泛素超強啟動子Ubi和綠色熒光蛋白GFP基因；高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因插入在pBIUbiGFP質(zhì)粒的Ubiquitin啟動子和GFP基因之間的多克隆位點上，并且與GFP基因形成融合基因，表達一個N末端連有GFP蛋白的高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的高冰草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白2基因，其特征是，所述的雙元轉(zhuǎn)化重組載體pBIUbiGFP:TeNHX2可轉(zhuǎn)化于農(nóng)桿菌AGL1中，通過農(nóng)桿菌苗端轉(zhuǎn)化法侵染小麥，從而獲得轉(zhuǎn)基因小麥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高冰草(Thinopyrum ponticumPodp.(Agropyron elongatum(Host.)Nevski)液泡膜Na
文檔編號C12N15/29GK1699569SQ200510043510
公開日2005年11月23日 申請日期2005年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月13日
發(fā)明者夏光敏, 劉恒, 薛哲勇 申請人:山東大學