專利名稱：馬藺液泡膜Na的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因(IINHX2)，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植物消除Na+毒害的策略包括降低Na+的吸收、Na+的外排和Na+的區(qū)隔化。Na+吸收是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。Na+的外排和區(qū)隔化是間接的主動(dòng)運(yùn)輸過(guò)程，主要由Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)調(diào)節(jié)。Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Na+/H+antiporter or exchanger，NHA or NHE)是細(xì)菌、酵母、藻類、動(dòng)物和高等植物的膜系統(tǒng)上普遍存在的一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，參與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的pH、Na+濃度調(diào)節(jié)及細(xì)胞體積變化等生命活動(dòng)。自1985年Blumwald和Plooe首先在甜菜根部貯藏組織的液泡膜上發(fā)現(xiàn)Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)活性以來(lái)，人們相繼發(fā)現(xiàn)在鹽生植物如濱藜、兼性CAM植物冰葉日中花、甜菜等和較耐鹽的甜土植物如大麥、海濱車前、長(zhǎng)春花、棉花、向日葵等的液泡膜上普遍存在著Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)活性。Nass等在酵母的前液泡膜(prevacuole)上也發(fā)現(xiàn)了一種Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。大量實(shí)驗(yàn)表明Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)活性的有無(wú)和高低與植物和酵母的耐鹽性密切相關(guān)，在高鹽濃度下植物和酵母可以分別通過(guò)質(zhì)膜和液泡膜上的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)將Na+運(yùn)出細(xì)胞和將Na+區(qū)域化在液泡內(nèi)，維持細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Na+穩(wěn)態(tài)和Na+/K+比相對(duì)穩(wěn)定，以適應(yīng)鹽漬環(huán)境。耐鹽植物能夠通過(guò)Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將大部分Na+區(qū)域化到液泡中，因而既能避免離子脅迫，又能進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)。因此Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物耐鹽性中的作用已越來(lái)越受到重視。目前人們已經(jīng)從細(xì)菌、酵母、動(dòng)物和高等植物中相繼獲得了編碼Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因。
把編碼液泡膜上Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因(如擬南芥的AtNHX1與酵母的NHX1等)轉(zhuǎn)化到鹽敏感植物中，并使其在液泡膜上過(guò)量表達(dá)以提高植物耐鹽性，是可行的植物基因工程策略。已在擬南芥、番茄、甜菜等植物獲得高耐鹽的轉(zhuǎn)基因植株。
馬藺是一種鹽生植物，馬藺最突出的特點(diǎn)就是能在其他高產(chǎn)作物不能生長(zhǎng)的重鹽堿土上種植。目前有關(guān)馬藺液泡膜上Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2的基因及其在植物轉(zhuǎn)基因工程育種中的應(yīng)用還沒(méi)有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)目前還沒(méi)有報(bào)道耐鹽堿的馬藺NHX基因及其在植物轉(zhuǎn)基因育種工程技術(shù)中得到應(yīng)用的現(xiàn)狀，本發(fā)明提供一種馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因、重組載體及植物轉(zhuǎn)基因育種方法，將馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因構(gòu)建在植物表達(dá)的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化小麥獲得轉(zhuǎn)基因植株。
本發(fā)明所提供的馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因(IINHX2)，具有如SEQ IDNO.1所示的序列ATGGGGTCTG GTATGGAGGA TCTGCTGGTG AGGCTGGGTG TCGTGTCGTC CACCTCCGAC 60CATGCCTCCG TGGTCTCCAT CAACCTCTTC GTAGCTCTCC TCTGCGCATG CATAGTCATC120GGACACCTCC TGGAGGAGAA TAGATGGATG AACGAGTCCA TCACCGCTCT AGCCATCGGG180TTGTGCACTG GCGTTGTGAT TCTTCTGACG ACAAATGGGA AGAGCTCTCA TATATTCGTA240TTCAGCGAAG ATCTCTTCTT CATCTACCTC CTCCCTCCAA TCATCTTCAA CGCCGGGTTT300CAAGTAAAAA AGAAACAATT TTTCCGCAAC TTCATGACAA TTATGCTGTT TGGTGCAGTT360GGGACCCTCA TCTCCTTTGT CATAATTTCT CTTGGTGCAA TTGGTTTATT CAGAAAAATG420
AACATAGGTC CACTGGAAGT TGGAGATTTT CTTGCAATTG GGGCAATCTT TTCTGCAACA 480GATTCTGTTT GCACCTTGCA GATTCTTAAC CAGGATGAAA CACCATTATT ATATAGCTTG 540GTCTTTGGTG AGGGAGTTGT CAATGATGCC ACATCAGTGG TGCTTTTCAA CGCAATACAA 600AACTTCGATC TTGAACATAT TGATGCAGGC ATTGCAGCAA AATTTATTGG AAATTTCTTT 660TATTTATTTG TCAGCAGCAC CTTCTTGGGA GCATTTGCTG GATTGCTTAG TGCGTATATC 720ATAAAAAAGT TGTATTATGG AAGGCATTCT ACTGATCGTG AAGTTGCACT CATGATGCTT 780ATGGCGTACC TTTCATATAT GCTGGCTGAG CTGTTAGATC TAAGTGGTAT CCTCACGGTT 840TTCTTCTGCG GCATAGTAAT GTCCCATTAT ACGTGGCACA ATGTGACAGA GAGTTCGAGA 900GTCACAACCA AGCATGCTTT TGCAACCTTG TCATTTATTT CGGAGATATT CCTCTTCCTT 960TATGTTGGCA TGGATGCATT AGACATTGAA AAGTGGAGAT TTGTCAGCGA CAGTCCTGGG 1020AAATCAATTG GTGTTAGCGC AATCATAATT GGTTTAGTTT TGATTGGAAG AGCAGCTTTC 1080GTCTTCCCGC TGTCTTTCCT ATCCAACTTA GCTAAGAAGT CCCCTAATGA AAAAATCACC 1140TTCAACCAGC AAGTTACCAT ATGGTGGGCA GGTTTGATGA GAGGTGCTGT ATCAATTGCA 1200CTTGCTTACA ATCAGTTCAC AAGAGCTGGT CATACTCAAC TTCCAGGGAA TGCAATGATG 1260ATCACCAGTA CCATCACAGT TGTGCTATTT AGCACTGTGG TATTCGGATT ATTGACAAAG 1320CCTTTGATAA GGCTCCTGTT GCCTCCTAGT ACAAAGCATC TTACCGGCAG TTGCAGTTTC 1380AACTCTGAGC CCTCTACCCC AAAATTTTA TCCGCTGCAC TACTAGAAAA TATTCCAGGA 1440TTTGAAGCAG AAGGAGGAAC AACAAACCTT GGGGCTCGGC CTTCAAGCCT TCGAATGCTC 1500CTTATGAAGC CAACTCACAC GGTTCATTAC TATTGGCGCA AGTTTGATGA TGCTTTCATG 1560CGTCCAATGT TTGGAGGGCG AGGCTTTGTT CCTTTTGTTC CCGGTTCACC TACTGAACAA 1620AGTGTTCATG GATGGGAATG A1641其中，包括與SEQ ID NO.1所示序列具有至少95％相同性的序列。
馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因(IINHX2)氨基酸序列如序列表SEQ IDNO.2所示MGSGMEDLLV RLGVVSSTSD HASVVSINLF VALLCACIVI GHLLEENRWM NESITALAIG 60LCTGVVILLT TNGKSSHIFV FSEDLFFIYL LPPIIFNAGF QVKKKQFFRN FMTIMLFGAV 120GTLISFVIIS LGAIGLFRKM NIGPLEVGDF LAIGAIFSAT DSVCTLQILN QDETPLLYSL 180VFGEGVVNDA TSVVLFNAIQ NFDLEHIDAG IAAKFIGNFF YLFVSSTFLG AFAGLLSAYI 240IKKLYYGRHS TDREVALMML MAYLSYMLAE LLDLSGILTV FFCGIVMSHY TWHNVTESSR 300VTTKHAFATL SFISEIFLFL YVGMDALDIE KWRFVSDSPG KSIGVSAIII GLVLIGRAAF 360VFPLSFLSNL AKKSPNEKIT FNQQVTIWWA GLMRGAVSIA LAYNQFTRAG HTQLPGNAMM 420ITSTITVVLF STVVFGLLTK PLIRLLLPPS TKHLTGSCSF NSEPSTPKFL SAALLENIPG 480FEAEGGTTNL GARPSSLRML LMKPTHTVHY YWRKFDDAFM RPMFGGRGFV PFVPGSPTEQ 540SVHGWE 546其中，包括與SEQ ID NO.2所示序列具有至少95％相同性的序列。
上述馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因可以構(gòu)建到原核表達(dá)載體中，通過(guò)本領(lǐng)域公知的研究方法將馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因?qū)朐松?，通過(guò)誘導(dǎo)，大量表達(dá)出馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2。其中，原核表達(dá)載體優(yōu)選原核表達(dá)載體pET-24a。
所述馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2可用于研究馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2的結(jié)構(gòu)、功能以及抗體制備。
所述馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因可以通過(guò)微注射、基因槍、農(nóng)桿菌介導(dǎo)、花粉管通道方法將馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因轉(zhuǎn)入作物和牧草，培育出抗鹽品質(zhì)優(yōu)良的品種/系。
所述馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因可以構(gòu)建到任何基于Ti-質(zhì)粒雙元載體中，通過(guò)本領(lǐng)域公知的研究方法將馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因?qū)朕r(nóng)桿菌中，進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。
所述馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因作為目的基因，構(gòu)建在植物表達(dá)的Ti-質(zhì)粒雙元載體pBIUbiGFP上；其中有LB和RB的T-DNA25bp重復(fù)序列，胭脂堿合成酶基因的啟動(dòng)子P-nos和終止子T-nos，還有在真核生物中作為選擇標(biāo)記使用的nptII，用于選擇的抗生素是卡那霉素和G418；在pBIUbiGFP中還有玉米泛素超強(qiáng)啟動(dòng)子Ubi和綠色熒光蛋白GFP基因；馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因插入在pBIUbiGFP質(zhì)粒的Ubiquitin啟動(dòng)子和GFP基因之間的多克隆位點(diǎn)上，并且與GFP基因形成融合基因，表達(dá)一個(gè)N末端連有GFP蛋白的馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2。
本發(fā)明所提供的馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因的Ti-質(zhì)粒雙元載體轉(zhuǎn)基因育種方法為1)構(gòu)建的雙元轉(zhuǎn)化重組載體質(zhì)粒pBIUbiGFPIINHX2轉(zhuǎn)化于農(nóng)桿菌中，通過(guò)農(nóng)桿菌苗端轉(zhuǎn)化法侵染植物，從而獲得轉(zhuǎn)基因植株。優(yōu)選雙元轉(zhuǎn)化重組載體pBIUbiGFPIINHX2轉(zhuǎn)化于農(nóng)桿菌AGL1中，通過(guò)農(nóng)桿菌苗端轉(zhuǎn)化法侵染小麥，從而獲得轉(zhuǎn)基因小麥。其中，根癌土壤農(nóng)桿菌AGL1是公知公用菌株。
2)轉(zhuǎn)基因株系的檢測(cè)方法用PCR和SOUTHERN印跡雜交法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株葉片中IINHX2基因。
本發(fā)明提供了一種馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因及其應(yīng)用，突破了IINHX2基因還沒(méi)有在植物轉(zhuǎn)基因工程育種中得到應(yīng)用的現(xiàn)狀，首次將IINHX2基因構(gòu)建在植物表達(dá)的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，以Ti-質(zhì)粒雙元載體pBIUbiGFPIINHX2轉(zhuǎn)化小麥并且獲得了轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)鑒定轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性明顯的得到提高。IINHX2基因轉(zhuǎn)基因小麥的T1代植株表現(xiàn)出明顯的抗鹽性，不同株系的T1代植株在170mM NaCl上的成活率為66％-83％，高于對(duì)照中國(guó)春(44％)，在170mM NaCl上的成活率為27％-38％，高于對(duì)照中國(guó)春(0％)。
本方明的轉(zhuǎn)基因重組載體可作為商業(yè)用途的品種、品系或作為基因資源在生產(chǎn)上直接使用或進(jìn)行農(nóng)業(yè)生物育種和轉(zhuǎn)基因植物以提高作物的抗鹽性。


圖1、馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因Ti-質(zhì)粒雙元載體構(gòu)建2、馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增結(jié)果其中，1，2分別是不同的模板濃度，M為λDNA的EcoRI+HindIII雙切Maker圖3、馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因的3’RACE其中，M為100bp Lader，1，2，3代表不同的重復(fù)圖4、馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因的5’RACE其中，M為100bp Lader，1，2代表不同的重復(fù)圖5、馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增其中，M為100bp Lader，1，2代表不同的重復(fù)圖6、轉(zhuǎn)基因T1代的Southern雜交結(jié)果其中，MλDNA(HindIII+EcoRI)，B53，B59轉(zhuǎn)基因植株，wt野生型中國(guó)春，+質(zhì)粒pBIUbiGFPIINHX具體實(shí)施方式
1.馬藺Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因部分片斷的克隆Trizol法提取萌發(fā)2周左右的馬藺幼苗的總RNA，PowerScriptTM逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，用兼并引物P15｀-GAT TCT GTW TGC ACM YTR CAG GT-｀3，P25｀-CAT KAG MCC AGC CCA CCA WAT-｀3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得一擴(kuò)增片斷，克隆測(cè)序。
按照下述條件擴(kuò)增目的基因片段反應(yīng)體系2×GC buffer I 25μl，10mM dNTP 3μl，10μM引物1和引物2各1.5μl，DNA模板250ng，LA GC Taq酶1μl，加水補(bǔ)足到50μl。
反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性3min，然后進(jìn)行36個(gè)循環(huán)，每一個(gè)循環(huán)包括94℃變性40s，59℃復(fù)性1min，72℃延伸1min。最后保持在72℃下延伸10min。
2.馬藺Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因3｀末端的獲得根據(jù)馬藺Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因部分片段的序列，設(shè)計(jì)3’RACE基因特異引物P15’-ACA ATG TGA CAG AGA GTT CG-3’，巢式引物P25’-CTT ATGAAG CCA ACT CAC ACG-3’。先使用引物P1和引物Olig(dT)18以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板擴(kuò)增，產(chǎn)物稀釋50倍，以巢式引物P2和Olig(dT)18經(jīng)過(guò)巢式PCR，獲得一擴(kuò)增片斷，克隆測(cè)序。
按照下述條件擴(kuò)增目的基因片段反應(yīng)體系2×GC buffer I 25μl，10mM dNTP 3μl，10μM引物1和引物2各1.5μl，DNA Template 250ng，LA GC Taq酶1μl，加水補(bǔ)足到50μl。
反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性3min，然后進(jìn)行36個(gè)循環(huán)，每一個(gè)循環(huán)包括94℃變性40s，55℃復(fù)性1min，72℃延伸2min。最后保持在72℃下延伸10min。
3.馬藺Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因5｀末端的獲得根據(jù)馬藺Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因部分片段的序列設(shè)計(jì)5’RACE基因特異引物.P15’-GAA AGA CAG CGG GAA GAC GAA AG-3’，巢式引物P25’-CCAACA TAA AGG AAG AGG AAT-3’。先使用引物P1和引物UMP，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板擴(kuò)增，產(chǎn)物稀釋50倍，以引物巢式引物P2和NUMP經(jīng)過(guò)巢式PCR，獲得一擴(kuò)增片斷，克隆測(cè)序。
按照下述條件擴(kuò)增目的基因片段反應(yīng)體系2×GC buffer I 25μl，10mM dNTP 3μl，10μM引物1和引物2各1.5μl，DNA Template 250ng，LA GC Taq酶1μl，加水補(bǔ)足到50μl。
反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性3min，然后進(jìn)行36個(gè)循環(huán)，每一個(gè)循環(huán)包括94℃變性40s，55℃復(fù)性1min，72℃延伸3min。最后保持在72℃下延伸10min。
4.馬藺Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因全長(zhǎng)cDNA的獲得根據(jù)5｀Race和3｀Race的結(jié)果，設(shè)計(jì)了引物對(duì)P15’-ACC GGT ATG GGG TCTGGT ATG GA-3’，P25’-CCA TGG ATT CCC ATC CAT GAA CAC-3’，擴(kuò)增cDNA模板獲得全長(zhǎng)片斷，克隆測(cè)序。
按照下述條件擴(kuò)增目的基因片段反應(yīng)體系2×GC buffer I 25μl，10mM dNTP 3μl，10μM引物1和引物2各1.5μl，DNA Template 250ng，LA GC Taq酶1μl，加水補(bǔ)足到50μl。
反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性3min，然后進(jìn)行36個(gè)循環(huán)，每一個(gè)循環(huán)包括94℃變性40s，51℃復(fù)性1min，72℃延伸2min。最后保持在72℃下延伸10min。
5.馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因測(cè)序用克隆載體構(gòu)建將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后分離相應(yīng)大小的條帶回收后與pUCm-T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞，并通過(guò)PCR法、酶切質(zhì)粒法等進(jìn)行驗(yàn)證克隆產(chǎn)物是否正確，然后進(jìn)行測(cè)序證明此基因已經(jīng)成功的以克隆質(zhì)粒的形式存儲(chǔ)在大腸桿菌DH10B中。
6.馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因的Ti-質(zhì)粒雙元載體構(gòu)建用于構(gòu)建雙元轉(zhuǎn)化-表達(dá)載體的質(zhì)粒是由pBI121改造而來(lái)。首先將pBI121內(nèi)的GUS基因用BamH I和Sac I去除，然后與pIRES-EGFP質(zhì)粒上用BamH I和Sac I酶切的GFP基因連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞，并通過(guò)酶切質(zhì)粒法等進(jìn)行驗(yàn)證此新載體(命名為pBIGFP)以正確的形式存儲(chǔ)在大腸桿菌DH10B中。
將載體pBIGFP內(nèi)的花椰菜花葉病毒的啟動(dòng)子35S(p35S)，用HindIII和BamH I去除，然后與pAL76質(zhì)粒上用HindIII和BamH I酶切的玉米泛素超強(qiáng)啟動(dòng)子Ubi連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞，并通過(guò)酶切質(zhì)粒法等進(jìn)行驗(yàn)證此新載體(命名為pBIUbiGFP)以正確的形式存儲(chǔ)在大腸桿菌DH10B中。
作為目的基因使用的馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因插入在pBIUbiGFP質(zhì)粒的Ubiquitin啟動(dòng)子和GFP基因之間的多克隆位點(diǎn)上并且與GFP基因形成融合基因，表達(dá)一個(gè)N末端連有GFP蛋白的馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2，使用的內(nèi)切酶是AgeI和NcoI。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞，并通過(guò)酶切質(zhì)粒法等進(jìn)行驗(yàn)證此新載體(命名為pBIUbiGFPIINHX2)以正確的形式存儲(chǔ)在大腸桿菌DH10B中。
7.馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因Ti-質(zhì)粒雙元載體的轉(zhuǎn)基因育種取中國(guó)春的種子，升汞滅菌10min，蒸餾水洗滌3次，整齊置于9cm培養(yǎng)皿中，25℃下露白。在4℃，黑暗條件下春化1個(gè)月以上。用雙面刀片切出生長(zhǎng)點(diǎn)，并滴加1-2滴的含有pBIUbiGFPIINHX2質(zhì)粒的農(nóng)桿菌AGL1菌液，繼續(xù)在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至新葉長(zhǎng)出，移栽。用PCR篩選出轉(zhuǎn)基因植株，將轉(zhuǎn)基因植株加代。
選取兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的T1代，提取萌發(fā)長(zhǎng)勢(shì)旺盛時(shí)期葉片的總DNA，用馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因全長(zhǎng)序列作為探針，進(jìn)行Southern雜交，表明馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因在轉(zhuǎn)基因株系B53和B59基因組中存在。
選取四個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的T1代幼苗分別在添加170mM和300mM的NaCl的MS營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)5天后，全部的轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)出比野生型中國(guó)春更高的成活率。其中兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系在300mM的成活率分別達(dá)到50％和38％，而野生型中國(guó)春全部萎蔫死亡。(見(jiàn)表1)表1轉(zhuǎn)基因株系T1代在不同鹽濃度下的成活率比較

序列表SEQ ID NO.1<110>山東大學(xué)<120>馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因及應(yīng)用<141>2005-5-13<170>PatentIn Version 2.1<210>1<211>1641<212>DNA<213>馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因<400>
atggggtctg gtatggagga tctgctggtg aggctgggtg tcgtgtcgtc cacctccgac60catgcctccg tggtctccat caacctcttc gtagctctcc tctgcgcatg catagtcatc 120ggacacctcc tggaggagaa tagatggatg aacgagtcca tcaccgctct agccatcggg 180ttgtgcactg gcgttgtgat tcttctgacg acaaatggga agagctctca tatattcgta 240ttcagcgaag atctcttctt catctacctc ctccctccaa tcatcttcaa cgccgggttt 300caagtaaaaa agaaacaatt tttccgcaac ttcatgacaa ttatgctgtt tggtgcagtt 360gggaccctca tctcctttgt cataatttct cttggtgcaa ttggtttatt cagaaaaatg 420aacataggtc cactggaagt tggagatttt cttgcaattg gggcaatctt ttctgcaaca 480gattctgttt gcaccttgca gattcttaac caggatgaaa caccattatt atatagcttg 540gtctttggtg agggagttgt caatgatgcc acatcagtgg tgcttttcaa cgcaatacaa 600aacttcgatc ttgaacatat tgatgcaggc attgcagcaa aatttattgg aaatttcttt 660tatttatttg tcagcagcac cttcttggga gcatttgctg gattgcttag tgcgtatatc 720ataaaaaagt tgtattatgg aaggcattct actgatcgtg aagttgcact catgatgctt 780atggcgtacc tttcatatat gctggctgag ctgttagatc taagtggtat cctcacggtt 840ttcttctgcg gcatagtaat gtcccattat acgtggcaca atgtgacaga gagttcgaga 900gtcacaacca agcatgcttt tgcaaccttg tcatttattt cggagatatt cctcttcctt 960tatgttggca tggatgcatt agacattgaa aagtggagat ttgtcagcga cagtcctggg 1020aaatcaattg gtgttagcgc aatcataatt ggtttagttt tgattggaag agcagctttc 1080gtcttcccgc tgtctttcct atccaactta gctaagaagt cccctaatga aaaaatcacc 1140ttcaaccagc aagttaccat atggtgggca ggtttgatga gaggtgctgt atcaattgca 1200cttgcttaca atcagttcac aagagctggt catactcaac ttccagggaa tgcaatgatg 1260atcaccagta ccatcacagt tgtgctattt agcactgtgg tattcggatt attgacaaag 1320cctttgataa ggctcctgtt gcctcctagt acaaagcatc ttaccggcag ttgcagtttc 1380aactctgagc cctctacccc aaaattttta tccgctgcac tactagaaaa tattccagga 1440tttgaagcag aaggaggaac aacaaacctt ggggctcggc cttcaagcc ttcgaatgctc 1500cttatgaagc caactcacac ggttcattac tattggcgca agtttgatga tgctttcatg 1560cgtccaatgt ttggagggcg aggctttgtt ccttttgttc ccggttcacc tactgaacaa 1620agtgttcatg gatgggaatg a 1641
SEQ ID NO.2<110>山東大學(xué)<120>馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因及應(yīng)用<141>2005-5-13<170>PatentIn Version 2.1<210>2<211>546<212>PRT<213>馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因氨基酸序列<400>
MGSGMEDLLV RLGVVSSTSD HASVVSINLF VALLCACIVI GHLLEENRWM NES ITALAIG 60LCTGVVILLT TNGKSSHIFV FSEDLFFIYL LPPIIFNAGF QVKKKQFFRN FMTIMLFGAV120GTLISFVIIS LGAIGLFRKM NIGPLEVGDF LAIGAIFSAT DSVCTLQILN QDETPLLYSL180VFGEGVVNDA TSVVLFNAIQ NFDLEHIDAG IAAKFIGNFF YLFVSSTFLG AFAGLLSAYI240IKKLYYGRHS TDREVALMML MAYLSYMLAE LLDLSGILTV FFCGIVMSHY TWHNVTESSR300VTTKHAFATL SFISEIFLFL YVGMDALDIE KWRFVSDSPG KSIGVSAIII GLVLIGRAAF360VFPLSFLSNL AKKSPNEKIT FNQQVTIWWA GLMRGAVSIA LAYNQFTRAG HTQLPGNAMM420ITSTITVVLF STVVFGLLTK PLIRLLLPPS TKHLTGSCSF NSEPSTPKFL SAALLENIPG480FEAEGGTTNL GARPSSLRML LMKPTHTVHY YWRKFDDAFM RPMFGGRGFV PFVPGSPTEQ540SVHGWE 54權(quán)利要求
1.馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因，其特征在于具有如SEQ ID NO.1所示的序列ATGGGGTCTG GTATGGAGGA TCTGCTGGTG AGGCTGGGTG TCGTGTCGTC CACCTCCGAC60CATGCCTCCG TGGTCTCCAT CAACCTCTTC GTAGCTCTCC TCTGCGCATG CATAGTCATC 120GGACACCTCC TGGAGGAGAA TAGATGGATG AACGAGTCCA TCACCGCTCT AGCCATCGGG 180TTGTGCACTG GCGTTGTGAT TCTTCTGACG ACAAATGGGA AGAGCTCTCA TATATTCGTA 240TTCAGCGAAG ATCTCTTCTT CATCTACCTC CTCCCTCCAA TCATCTTCAA CGCCGGGTTT 300CAAGTAAAAA AGAAACAATT TTTCCGCAAC TTCATGACAA TTATGCTGTT TGGTGCAGTT 360GGGACCCTCA TCTCCTTTGT CATAATTTCT CTTGGTGCAA TTGGTTTATT CAGAAAAATG 420AACATAGGTC CACTGGAAGT TGGAGATTTT CTTGCAATTG GGGCAATCTT TTCTGCAACA 480GATTCTGTTT GCACCTTGCA GATTCTTAAC CAGGATGAAA CACCATTATT ATATAGCTTG 540GTCTTTGGTG AGGGAGTTGT CAATGATGCC ACATCAGTGG TGCTTTTCAA CGCAATACAA 600AACTTCGATC TTGAACATAT TGATGCAGGC ATTGCAGCAA AATTTATTGG AAATTTCTTT 660TATTTATTTG TCAGCAGCAC CTTCTTGGGA GCATTTGCTG GATTGCTTAG TGCGTATATC 720ATAAAAAAGT TGTATTATGG AAGGCATTCT ACTGATCGTG AAGTTGCACT CATGATGCTT 780ATGGCGTACC TTTCATATAT GCTGGCTGAG CTGTTAGATC TAAGTGGTAT CCTCACGGTT 840TTCTTCTGCG GCATAGTAAT GTCCCATTAT ACGTGGCACA ATGTGACAGA GAGTTCGAGA 900GTCACAACCA AGCATGCTTT TGCAACCTTG TCATTTATTT CGGAGATATT CCTCTTCCTT 960TATGTTGGCA TGGATGCATT AGACATTGAA AAGTGGAGAT TTGTCAGCGA CAGTCCTGGG 1020AAATCAATTG GTGTTAGCGC AATCATAATT GGTTTAGTTT TGATTGGAAG AGCAGCTTTC 1080GTCTTCCCGC TGTCTTTCCT ATCCAACTTA GCTAAGAAGT CCCCTAATGA AAAAATCACC 1140TTCAACCAGC AAGTTACCAT ATGGTGGGCA GGTTTGATGA GAGGTGCTGT ATCAATTGCA 1200CTTGCTTACA ATCAGTTCAC AAGAGCTGGT CATACTCAAC TTCCAGGGAA TGCAATGATG 1260ATCACCAGTA CCATCACAGT TGTGCTATTT AGCACTGTGG TATTCGGATT ATTGACAAAG 1320CCTTTGATAA GGCTCCTGTT GCCTCCTAGT ACAAAGCATC TTACCGGCAG TTGCAGTTTC 1380AACTCTGAGC CCTCTACCCC AAAATTTTTA TCCGCTGCAC TACTAGAAAA TATTCCAGGA 1440TTTGAAGCAG AAGGAGGAAC AACAAACCTT GGGGCTCGGC CTTCAAGCCT TCGAATGCTC 1500CTTATGAAGC CAACTCACAC GGTTCATTAC TATTGGCGCA AGTTTGATGA TGCTTTCATG 1560CGTCCAATGT TTGGAGGGCG AGGCTTTGTT CCTTTTGTTC CCGGTTCACC TACTGAACAA 1620AGTGTTCATG GATGGGAATG A1641其中，包括與SEQ ID NO.1所示序列具有至少95％相同性的序列。
2.馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因，其特征在于具有如序列表SEQ IDNO.2所示氨基酸序列MGSGMEDLLV RLGVVSSTSD HASVVSINLF VALLCACIVI GHLLEENRWM NESITALAIG60LCTGVVILLT TNGKSSHIFV FSEDLFFIYL LPPIIFNAGF QVKKKQFFRN FMTIMLFGAV 120GTLISFVIIS LGAIGLFRKM NIGPLEVGDF LAIGAIFSAT DSVCTLQILN QDETPLLYSL 180VFGEGVVNDA TSVVLFNAIQ NFDLEHIDAG IAAKFIGNFF YLFVSSTFLG AFAGLLSAYI 240IKKLYYGRHS TDREVALMML MAYLSYMLAE LLDLSGILTV FFCGIVMSHY TWHNVTESSR 300VTTKHAFATL SFISEIFLFL YVGMDALDIE KWRFVSDSPG KSIGVSAIII GLVLIGRAAF 360VFPLSFLSNL AKKSPNEKIT FNQQVTIWWA GLMRGAVSIA LAYNQFTRAG HTQLPGNAMM 420ITSTITVVLF STVVFGLLTK PLIRLLLPPS TKHLTGSCSF NSEPSTPKFL SAALLENIPG 480FEAEGGTTNL GARPSSLRML LMKPTHTVHY YWRKFDDAFM RPMFGGRGFV PFVPGSPTEQ 540SVHGWE 546其中，包括與SEQ ID NO.2所示序列具有至少95％相同性的序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因，其特征是，所述馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因可以構(gòu)建到原核表達(dá)載體中，通過(guò)本領(lǐng)域公知的研究方法將馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因?qū)朐松?，通過(guò)誘導(dǎo)，大量表達(dá)出馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因，其特征是，所述馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2可用于研究馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2的結(jié)構(gòu)、功能以及抗體制備。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因，其特征是，所述馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因可以通過(guò)微注射、基因槍、農(nóng)桿菌介導(dǎo)、花粉管通道方法將馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因轉(zhuǎn)入作物和牧草，培育出抗鹽品質(zhì)優(yōu)良的品種/系。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因，其特征是，所述馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因可以構(gòu)建到任何基于Ti-質(zhì)粒雙元載體中，通過(guò)本領(lǐng)域公知的研究方法將馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因?qū)朕r(nóng)桿菌中，進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因，其特征是，將所述馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因作為目的基因，構(gòu)建在植物表達(dá)的Ti-質(zhì)粒雙元載體pBIUbiGFP上；其中有LB和RB的T-DNA25bp重復(fù)序列，胭脂堿合成酶基因的啟動(dòng)子P-nos和終止子T-nos，還有在真核生物中作為選擇標(biāo)記使用的nptII，用于選擇的抗生素是卡那霉素和G418；在pBIUbiGFP中還有玉米泛素超強(qiáng)啟動(dòng)子Ubi和綠色熒光蛋白GFP基因；馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因插入在pBIUbiGFP質(zhì)粒的Ubiquitin啟動(dòng)子和GFP基因之間的多克隆位點(diǎn)上，并且與GFP基因形成融合基因，表達(dá)一個(gè)N末端連有GFP蛋白的馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的馬藺液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2基因，其特征是，所述的雙元轉(zhuǎn)化重組載體pBIUbiGFPI1NHX2可轉(zhuǎn)化于農(nóng)桿菌AGL1中，通過(guò)農(nóng)桿菌苗端轉(zhuǎn)化法侵染小麥，從而獲得轉(zhuǎn)基因小麥。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種馬藺液泡膜Na
文檔編號(hào)C12N15/29GK1706951SQ20051004351
公開(kāi)日2005年12月14日 申請(qǐng)日期2005年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月13日
發(fā)明者夏光敏, 劉恒, 薛哲勇 申請(qǐng)人:山東大學(xué)