專利名稱：通過轉(zhuǎn)基因聚合betA、NHX1、PPase基因提高玉米、小麥耐鹽耐旱性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬農(nóng)作物的生物工程育種領(lǐng)域，具體說，涉及一種通過轉(zhuǎn)基因聚合betA、NHX1、PPase基因提高玉米、小麥耐鹽耐旱性的方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
諸自然逆境中，干旱對世界作物產(chǎn)量的影響占居首位，其危害相當(dāng)于其它自然災(zāi)害之和。鹽漬化也是影響作物產(chǎn)量的主要環(huán)境因素。我國約二分之一國土面積處干旱、半干旱區(qū)。即使在非干旱地區(qū)的主要農(nóng)業(yè)區(qū)，也不時(shí)受到旱災(zāi)侵襲。在我國16億畝耕地中，鹽堿地有1億多畝，中低產(chǎn)田約10億畝。其中大部分中低產(chǎn)田也是由于干旱和鹽堿所致。此外有3億畝鹽堿荒地有待開發(fā)利用；灌溉地區(qū)次生鹽漬化田地還在逐年增加。在玉米、小麥主栽區(qū)，干旱和土壤鹽漬化是影響玉米、小麥產(chǎn)量的主要因素。頻繁發(fā)生的伏旱是影響我國玉米高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的首要因素，在抽穗期的嚴(yán)重干旱可造成玉米大幅度減產(chǎn)或絕收。而培育玉米耐旱品種是一個(gè)長期關(guān)注而又收效不大的難題，只要有適應(yīng)性好的耐旱品種，必將在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中迅速推廣。土壤鹽漬化造成玉米、小麥播種面積減小和產(chǎn)量銳減，農(nóng)民急需耐鹽高產(chǎn)玉米單交種和小麥品種。隨著我國淡水資源的逐年匱乏和氣候變暖，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育耐鹽耐旱玉米、小麥具有重要的戰(zhàn)略意義。因此，該項(xiàng)目產(chǎn)品具有廣闊的市場和重大的經(jīng)濟(jì)效益及社會效益。
干旱和鹽堿構(gòu)成了對植物的滲透脅迫，導(dǎo)致植物缺水和脂質(zhì)過氧化，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損和正常代謝活動(dòng)不能進(jìn)行。鹽脅迫還引起離子毒害效應(yīng)。植物的耐鹽性和耐旱性既相互關(guān)聯(lián)又存在差異，分別是由多基因控制的復(fù)雜性狀，涉及到多條代謝途徑，其中部分基因在進(jìn)化上高度保守。近年來植物耐鹽機(jī)理的研究取得了突破性進(jìn)展，已從不同生物中克隆出一批耐鹽相關(guān)基因，其中一些基因轉(zhuǎn)入植物后能明顯提高植株耐鹽性。植物耐旱基因鑒定及定位研究也取得較大進(jìn)展。
采用基因工程技術(shù)提高作物耐鹽耐旱性的研究目前集中在四個(gè)方面1)滲透保護(hù)與滲透調(diào)節(jié)，2)氧自由基的消除，3)離子均衡的調(diào)控，4)胞內(nèi)信號傳遞通道的調(diào)節(jié)。離子均衡的調(diào)控機(jī)制又可分為抑制Na+的吸收；向胞外排出Na+；維持細(xì)胞K+營養(yǎng)；將胞質(zhì)中有害Na+泵入并儲存在液泡中，實(shí)現(xiàn)區(qū)域化分布。
作物一般都具有或大或小的滲透調(diào)節(jié)功能，以適應(yīng)環(huán)境中滲透壓的變化。這種功能包括細(xì)胞中的滲透調(diào)節(jié)物(脯氨酸、甜菜堿、多羥基醇類等)的積累、膜通透性的變化等。在干旱和鹽脅迫下，一些植物細(xì)胞內(nèi)積累甘氨酸甜菜堿類物質(zhì)以維持細(xì)胞的正常膨壓和減輕離子毒害。甘氨酸甜菜堿合成酶基因的高強(qiáng)度表達(dá)及甜菜堿積累可大幅度提高植物的耐鹽耐旱性。近年的一些研究表明，一些編碼滲透調(diào)節(jié)劑合成酶的基因?qū)氲街参锖竽苁辜?xì)胞內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)劑濃度提高，使植株對脅迫表現(xiàn)出更好的抗性。但滲透調(diào)節(jié)劑提高的濃度均很小，不會產(chǎn)生明顯的滲透調(diào)節(jié)作用，推測是滲透調(diào)節(jié)劑保護(hù)了細(xì)胞結(jié)構(gòu)和酶活性所致。將CDH基因轉(zhuǎn)入煙草(Lilius等)、將BADH(甜菜醛脫氫酶)基因轉(zhuǎn)入草莓和煙草(陳受宜等)，植株的耐鹽性均明顯提高。糖類合成酶如甘露醇合成酶基因轉(zhuǎn)入煙草等植物提高了植株的耐鹽性(Tarczynski等，Liu等，Shen等)，海藻糖合成酶基因轉(zhuǎn)入煙草提高了植株的耐旱性(Pilon-Smits等)。
在復(fù)雜機(jī)制控制下的多條途徑參與了細(xì)胞質(zhì)中Na+濃度的調(diào)節(jié)。多數(shù)鹽生植物消除Na+毒害的主要機(jī)制是將吸收的Na+定位于液泡來降低胞質(zhì)中Na+的濃度，即離子區(qū)域化機(jī)制尤為重要。在甜土植物中，部分物種缺乏Na+/H+antiport活性，部分物種Na+/H+antiport活性低。因此，通過遺傳改良使非鹽生植物在液泡中積累大量Na+已成為植物耐鹽基因工程的策略。NHX1基因編碼擬南芥等植物液泡膜上的Na+/H+antiport。該蛋白是細(xì)胞內(nèi)離子區(qū)域化的關(guān)鍵酶。將帶有強(qiáng)啟動(dòng)子的AtNHX1基因轉(zhuǎn)入擬南芥(Apes等)和番茄(Hong-Xia Zhang等)中實(shí)現(xiàn)過量表達(dá)，獲得了耐鹽性大幅度提高的植株。
采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高植物耐鹽耐旱性是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)課題，已有大量的工作。將維持細(xì)胞內(nèi)離子平衡的基因、合成滲透保護(hù)物質(zhì)的基因、能減輕細(xì)胞內(nèi)自由基危害的基因等導(dǎo)入植物，提高了植物的耐鹽耐旱性，為培育耐鹽耐旱作物新品種開辟了一條有效途徑。但多數(shù)工作是以模式植物為材料進(jìn)行的，只有轉(zhuǎn)AtNHX1基因的耐鹽番茄和油菜具有良好的應(yīng)用價(jià)值。從策略和技術(shù)上講，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高作物耐鹽耐旱性已具有成熟的技術(shù)路線和必要的實(shí)施條件。
玉米是對土壤鹽漬化中度敏感的作物，耗水量大，生長發(fā)育期易受到干旱的侵襲。玉米耐鹽耐旱育種對于我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)意義重大。由于種質(zhì)材料缺乏和田間選擇困難等原因，常規(guī)育種選育耐鹽耐旱玉米品種的工作收效不大。采用基因工程技術(shù)可望在較短時(shí)間內(nèi)創(chuàng)造出玉米耐鹽耐旱自交系及單交種。由于玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)難度大，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)造耐鹽耐旱玉米的工作在國內(nèi)外尚處起步階段。王國英等以玉米雜交種愈傷組織為受體獲得了轉(zhuǎn)山梨醇-6-磷酸脫氫酶基因的植株，后者耐鹽性有一定提高。迄今國內(nèi)外未報(bào)道獲得耐鹽或/和耐旱性大幅度提高且具有實(shí)用價(jià)值的轉(zhuǎn)基因玉米。
小麥作為一種主要的糧食作物，其耐鹽耐旱品種的培育多年來一直受到人們的重視。傳統(tǒng)的小麥耐鹽耐旱育種方法有1)從已有品種中篩選耐鹽耐旱性強(qiáng)的基因型；2)篩選耐鹽耐旱性強(qiáng)的小麥野生近緣種，通過與小麥進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交培育耐鹽耐旱品種；3)將耐鹽耐旱品種與普通品種進(jìn)行雜交，從其后代選育耐鹽品種；4)利用組織培養(yǎng)和理化處理(如輻射等)等措施篩選出耐鹽細(xì)胞并再生植株，從其后代中選育出耐鹽品種。采用這些方法已培育出一批耐鹽耐旱小麥新品種。但由于可利用種質(zhì)資源的限制和效率很低等問題限制了小麥耐鹽耐旱育種的迅速發(fā)展，培育出的耐鹽品種能耐受0.6％NaCl溶液的較長時(shí)期的澆灌，而耐旱品種產(chǎn)量較低，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上很難大面積推廣。Sawahel等(2002)將脯氨酸合成酶基因?qū)胄←湯@得了耐鹽性顯著提高的轉(zhuǎn)基因植株。Abebe等(2003)將甘露醇合成酶基因?qū)胄←湹玫搅撕铣筛事洞嫉哪望}小麥。
玉米轉(zhuǎn)基因研究在國內(nèi)外均受到關(guān)注?？瓜x、抗除草劑玉米已在美洲大面積推廣。就轉(zhuǎn)化技術(shù)而言，主要工作集中在以農(nóng)桿菌為中介的遺傳轉(zhuǎn)化、基因槍轟擊法和以原生質(zhì)體為受體的遺傳轉(zhuǎn)化方面。在已報(bào)道的玉米轉(zhuǎn)基因工作中，多數(shù)是以單交種或農(nóng)藝性狀不良的自交系為材料，獲得的轉(zhuǎn)基因植株需經(jīng)過多代回交和選擇才能培育出優(yōu)良自交系。因此，優(yōu)良轉(zhuǎn)基因品種的選育周期長，風(fēng)險(xiǎn)大。若以玉米優(yōu)良自交系為受體進(jìn)行轉(zhuǎn)化則事半功倍。申請人實(shí)驗(yàn)室已發(fā)展起以自交系為材料采用農(nóng)桿菌中介法規(guī)?；@得轉(zhuǎn)基因玉米的技術(shù)。
玉米轉(zhuǎn)基因植株及其后代的遺傳學(xué)及基因表達(dá)的研究報(bào)道很少。已知基因沉默的現(xiàn)象經(jīng)常碰到，一些外源基因在玉米轉(zhuǎn)基因植株及其后代中不穩(wěn)定。轉(zhuǎn)基因植株及其后代的遺傳學(xué)和基因表達(dá)的研究在模式植物上已有較多的工作，基因沉默的現(xiàn)象經(jīng)常碰到，一些外源基因在轉(zhuǎn)基因植株及其后代中不穩(wěn)定。
小麥胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和植株再生普遍受到基因型的限制，適宜的轉(zhuǎn)基因受體體系往往因基因型而異，通常存在著若干缺點(diǎn)，而且轉(zhuǎn)基因過程中所涉及的組織培養(yǎng)、抗性愈傷組織篩選等過程耗時(shí)較長，在長期組織培養(yǎng)過程中容易產(chǎn)生體細(xì)胞無性系變異等。這些因素均限制了小麥轉(zhuǎn)基因工作的快速發(fā)展。因此以栽培品種為基礎(chǔ)，尋求不經(jīng)過組織培養(yǎng)、不受基因型限制的小麥遺傳轉(zhuǎn)化受體體系十分必要，這對于小麥基因工程研究和育種實(shí)踐都具有重要的價(jià)值和意義。申請人實(shí)驗(yàn)室建立的小麥遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)(中國發(fā)明專利)較好的解決了小麥不同基因型遺傳轉(zhuǎn)化的難題。
在作物育種中，急待解決的難題之一是大幅度提高優(yōu)良育種材料的耐鹽耐旱性，從而選育出具有重大突破的品種。要達(dá)到此目標(biāo)，有賴于將多個(gè)目標(biāo)基因聚合到優(yōu)良材料中，充分利用細(xì)胞抗御逆境的不同代謝活動(dòng)及調(diào)節(jié)機(jī)制。這方面的研究在國內(nèi)外尚處在起步階段，尚未確定最佳的技術(shù)路線和方法。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種通過轉(zhuǎn)基因聚合betA、NHX1、PPase基因提高玉米、小麥耐鹽耐旱性的方法，在本發(fā)明中，采用基因聚合的策略，將3個(gè)具有重要農(nóng)藝價(jià)值的異源基因?qū)胗衩缀托←?，可以培育出耐鹽耐旱性大幅度提高的玉米自交系及單交種和小麥優(yōu)良品種。
本發(fā)明的通過轉(zhuǎn)基因聚合betA、NHX1、PPase基因提高玉米、小麥耐鹽耐旱性的方法是，將來自植物的液泡膜鈉氫反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NHX1和液泡膜焦磷酸酶基因PPase、來自大腸桿菌的膽堿脫氫酶基因betA重組到植物表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)入玉米或小麥細(xì)胞并讓其高效表達(dá)，進(jìn)而再生出轉(zhuǎn)基因植株；從轉(zhuǎn)基因植株及其后代中篩選耐鹽耐旱性明顯提高的轉(zhuǎn)基因純合體；通過對轉(zhuǎn)基因純合體細(xì)胞進(jìn)行二次轉(zhuǎn)化或使帶有不同轉(zhuǎn)基因的植株相互交配獲得帶有3個(gè)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)基因植株，再從其后代中選擇耐鹽耐旱性優(yōu)異的個(gè)體，并進(jìn)行自交純合，進(jìn)而創(chuàng)建出玉米、小麥耐鹽耐旱育種新材料；或者直接利用轉(zhuǎn)基因聚合材料生產(chǎn)雜交種子。
其中，上述目標(biāo)基因NHX1和PPase基因可以分別以融合基因形式串聯(lián)插入在植物表達(dá)載體上，在玉米、小麥細(xì)胞內(nèi)能高效表達(dá)；betA基因重組在另一植物表達(dá)載體上，由在植物細(xì)胞內(nèi)能啟動(dòng)基因高效表達(dá)的啟動(dòng)子啟動(dòng)。
其中，上述NHX1和PPase基因來自鹽生植物或非鹽生植物。
其中，上述用于遺傳轉(zhuǎn)化的玉米、小麥基因型為優(yōu)良自交系或品種，受體細(xì)胞有莖尖分生組織細(xì)胞、離體培養(yǎng)的幼胚細(xì)胞、成熟胚細(xì)胞、胚性愈傷組織細(xì)胞或原生質(zhì)體。
其中，上述對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行耐鹽抗旱性測定以篩選出耐鹽耐旱性明顯提高的個(gè)體并進(jìn)行自交或回交。
其中，上述耐鹽耐旱性提高的轉(zhuǎn)基因植株通過自交、轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因純合體。
其中，上述帶有不同目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)基因植株可通過再次遺傳轉(zhuǎn)化獲得帶有3個(gè)目標(biāo)基因的植株，后者通過自交產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因純合體。
其中，上述來自同一基因型的帶有不同目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)基因純合體植株彼此交配，產(chǎn)生帶有3個(gè)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)基因植株，后者通過2-3代自交和轉(zhuǎn)基因檢測獲得轉(zhuǎn)基因純合體。
其中，上述對轉(zhuǎn)基因純合植株進(jìn)行耐鹽耐旱性檢測，從中選擇優(yōu)異材料培育玉米、小麥耐鹽耐旱新種質(zhì)。
其中，上述方法可將轉(zhuǎn)基因聚合植株直接應(yīng)用于玉米、小麥雜交種子培育。
本發(fā)明的基本思路是，依據(jù)植物抗逆生理和植物抗逆基因工程研究的新進(jìn)展，利用植物細(xì)胞中與抗逆性相關(guān)的代謝途徑的調(diào)控知識，采用轉(zhuǎn)基因和基因聚合技術(shù)，將能夠顯著提高細(xì)胞中甘氨酸甜菜堿含量并明顯提高植物玉米、小麥耐鹽耐旱性的betA基因、能夠大幅度增強(qiáng)細(xì)胞Na+區(qū)隔化的液泡膜上的鈉氫反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NHX1和能夠提高液泡膜質(zhì)子梯度增加Na+向液泡儲蓄從而增加細(xì)胞吸水能力的液泡膜焦磷酸酶基因PPase導(dǎo)入玉米優(yōu)良自交系或小麥優(yōu)良品種中，實(shí)現(xiàn)這些基因的過表達(dá)，從而大幅度提高植株的耐鹽耐旱性。由于在轉(zhuǎn)基因操作中選用了對人、畜安全的除草劑抗性基因als(來自于擬南芥，編碼突變型乙酰乳酸合成酶，后者是分支氨基酸合成途徑中的關(guān)鍵酶)和bar(來自土壤細(xì)菌S.hygroscopicus，編碼草丁膦乙?；D(zhuǎn)移酶(PAT，phosphinothricinacetyltranslase，可以解除草丁膦(phosphinothricin，PPT)和Glufosinate ammonium即草丁膦銨鹽的毒性。后者是商用非選擇性除草劑bialaphos、Basta、Finale和Liberty等的有效成分)，因此，賦予轉(zhuǎn)基因植物抗除草劑特性。
本發(fā)明所用的目標(biāo)基因?yàn)閬碜源竽c桿菌的膽堿脫氫酶基因betA，來自鹽芥和擬南芥的編碼液泡膜上的鈉氫反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NHX1、來自鹽芥的編碼液泡膜上焦磷酸酶基因PPase；所用的植物轉(zhuǎn)基因載體有pCAMB1A1300或pCAMBIA3300派生的載體和pKROII派生的載體。這些派生的載體分別重組進(jìn)betA基因、NHX1基因和PPase基因，或重組進(jìn)betA基因和NHX1基因、NHX1基因和PPase基因、betA基因和PPase基因。轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞選擇標(biāo)記基因分別為除草劑抗性基因bar和als突變基因。目標(biāo)基因和轉(zhuǎn)基因植物選擇標(biāo)記基因采用常規(guī)分子生物學(xué)方法通過多步驟重組插入到植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體中，并通過轉(zhuǎn)基因植物的檢測確定了這些基因能在植物中活躍表達(dá)，并提高了轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性(耐鹽耐旱性、耐冷性和除草劑抗性等)。
轉(zhuǎn)基因玉米、小麥采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法或基因槍轟擊法產(chǎn)生，轉(zhuǎn)基因植株用PCR檢測、Southern blotting驗(yàn)證，外源基因表達(dá)研究采用Northern blotting。植株抗逆性測定采用植物生理學(xué)和作物栽培學(xué)方法，其中轉(zhuǎn)基因植株耐鹽耐旱性測定采用盆栽試驗(yàn)-生理指標(biāo)測定、鹽堿地和干旱池栽培實(shí)驗(yàn)和田間多點(diǎn)實(shí)驗(yàn)法。轉(zhuǎn)基因遺傳穩(wěn)定性測定采用經(jīng)典的遺傳學(xué)方法，結(jié)合于PCR檢測和系譜分析。轉(zhuǎn)基因聚合采用轉(zhuǎn)基因采用雜交-自交技術(shù)和二次轉(zhuǎn)化方法，并通過PCR技術(shù)輔助選擇。
在玉米遺傳轉(zhuǎn)化中，以我國新選育的優(yōu)良自交系為材料，取無菌萌發(fā)的自交系種子、離體培養(yǎng)的叢生芽和胚性愈傷組織為受體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。叢生芽來自離體培養(yǎng)芽尖，胚性愈傷組織來自幼胚。由于用玉米優(yōu)良自交系為轉(zhuǎn)基因受體材料，經(jīng)選擇獲得的轉(zhuǎn)基因株系基本保持受體材料的特性，因此，依據(jù)雜種優(yōu)勢模式，可將攜帶數(shù)個(gè)目的基因的2個(gè)自交系進(jìn)行交配，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因聚合的單交種。也可通過二次轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)基因聚合。
在小麥遺傳轉(zhuǎn)化中，以我國新選育的優(yōu)良品種為材料，取無菌萌發(fā)的種子為受體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)選擇基本保持原品種特性，一般通過二次轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)基因聚合，也可將攜帶數(shù)個(gè)目的基因轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行人工套袋姊妹交，實(shí)現(xiàn)目的基因聚合。
分子標(biāo)記在作物抗逆育種中越來越多地得到應(yīng)用。目的基因和其啟動(dòng)子的部分DNA序列是理想的分子標(biāo)記，利用這些標(biāo)記不僅能檢測到轉(zhuǎn)基因是否存在于姊妹交植株的自交后代中，而且起到了輔助定向選擇作用。本發(fā)明利用轉(zhuǎn)基因分子標(biāo)記加速轉(zhuǎn)基因聚合和轉(zhuǎn)基因在不同基因型間的轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明實(shí)施的具體步驟為1)將目的基因和植物轉(zhuǎn)化細(xì)胞選擇標(biāo)記基因以不同組合(基本組合為1或2個(gè)目的基因加1個(gè)選擇標(biāo)記基因)的方式重組到植物表達(dá)載體中，并導(dǎo)入到大腸桿菌或/和農(nóng)桿菌中。
2)通過轉(zhuǎn)基因方法將目標(biāo)基因轉(zhuǎn)入玉米、小麥細(xì)胞中，獲得轉(zhuǎn)基因植株。通過分子檢測和植株抗逆性測定選出目的基因穩(wěn)定表達(dá)且植株抗性明顯提高的轉(zhuǎn)基因植株。后者用于轉(zhuǎn)基因聚合。
3)利用入選的轉(zhuǎn)基因植株或其自交結(jié)實(shí)的種子為材料，通過二次轉(zhuǎn)化法或姊妹交結(jié)籽達(dá)到轉(zhuǎn)基因聚合。對二次轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的植株和通過姊妹交獲得的植株進(jìn)行PCR檢測，選出轉(zhuǎn)基因聚合的植株。在進(jìn)行二次轉(zhuǎn)化中，所用的植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體所帶的植物細(xì)胞選擇標(biāo)記基因必須與初次轉(zhuǎn)化所用的表達(dá)載體上的植物細(xì)胞選擇標(biāo)記基因不同，以利于選擇出二次轉(zhuǎn)化體。若植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體不帶有植物選擇標(biāo)記基因，雖通過PCR檢測可獲得轉(zhuǎn)基因植株，但效率很低。
4)轉(zhuǎn)基因聚合材料的抗逆性鑒定和利用。對獲得的不同轉(zhuǎn)基因聚合材料，根據(jù)目的基因表達(dá)產(chǎn)物的生理作用，進(jìn)行相應(yīng)的生理生化指標(biāo)檢測，并通過盆栽試驗(yàn)和大田抗逆性測定試驗(yàn)，篩選出耐鹽耐旱性明顯提高的轉(zhuǎn)基因育種材料或雜交組合(單交種)。
具體實(shí)施例方式
以下敘述本發(fā)明的實(shí)施例。需說明的是，本發(fā)明的實(shí)施例只對本發(fā)明起說明作用而沒有限制作用。
實(shí)施例1創(chuàng)制耐鹽耐旱性優(yōu)異的玉米自交系1.玉米轉(zhuǎn)基因植株的獲得玉米骨干自交系種子，用70％乙醇浸泡10分鐘，再用0.1％氯化汞浸泡10-12分鐘，然后用無菌水洗滌3-5遍。滅菌后種子放在無菌三角瓶內(nèi)萌發(fā)，待種子萌動(dòng)(露白)后，將其放在改良MS培養(yǎng)基上，在黑暗條件下繼續(xù)萌發(fā)。待胚芽伸長至3-5厘米時(shí)，剝離胚芽鞘及2-3片幼葉，露出莖尖頂端生長錐進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
將帶有雙元載體(Mini-Ti質(zhì)粒帶有除草劑抗性基因als和目的基因betA，或帶有除草劑抗性基因bar和目的基因NHX1和PPase基因)的根瘤農(nóng)桿菌(AGL1或LBA4404)在附加抗生素的YEP培養(yǎng)基中28℃下分別震蕩培養(yǎng)，震蕩速率為110r/min，使細(xì)菌處于對數(shù)生長期。然后在3000r/min下離心10分鐘，棄上清液。菌體用1/2改良MS液體培養(yǎng)基洗滌，離心收集。再將菌體用添加100mg/l乙酰丁香酮的1/2MS改良液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋5-20倍用于轉(zhuǎn)化。
將菌液倒在4.5厘米直徑的培養(yǎng)皿中，傾斜培養(yǎng)皿，將剝離胚芽鞘及幼葉裸露出莖尖生長錐的無菌苗頂端浸泡在菌液中2-5分鐘(AGL1 2分鐘，LBA44045分鐘)，并附以0.5×105Pa大氣壓下處理。用無菌濾紙吸干浸染后的芽尖，將根部插入改良MS培養(yǎng)基中于黑暗中培養(yǎng)2-3天，培養(yǎng)溫度為22-24℃，然后將無菌苗放在散射光下培養(yǎng)2天。將照光培養(yǎng)后的轉(zhuǎn)化植株移栽到鋪有上層蛭石和下層壤土的花盆中，蛭石覆蓋植株頂部。然后讓植株在自然光照下生長，日溫22-28℃，夜溫18-23℃，隔天澆灌1/2改良MS培養(yǎng)基無機(jī)鹽。待轉(zhuǎn)化植株長出3片葉后，噴灑除草劑綠黃隆(轉(zhuǎn)基因選擇標(biāo)記基因?yàn)閍ls)或除草劑Finale(轉(zhuǎn)基因選擇標(biāo)記基因?yàn)閎ar)水溶液，以未轉(zhuǎn)化植株為對照。噴灑量以植株掉液滴為宜。未轉(zhuǎn)化植株在噴灑后3天停止生長，7-10天左右開始死亡。轉(zhuǎn)化處理后的植株，一些個(gè)體的變化與對照植株相似，另一些個(gè)體則持續(xù)生長，無明顯變化。植株長到5葉期，將其定植到田間。
抗除草劑轉(zhuǎn)化植株生長到7-8葉時(shí)，取葉片提取DNA，采用PCR技術(shù)檢測外源基因，對PCR陽性植株進(jìn)行Southern blotting檢測。約30％的抗除草劑植株為轉(zhuǎn)基因個(gè)體。
2.轉(zhuǎn)基因植株的管理和抗性檢測轉(zhuǎn)基因植株開花后套袋自交或姊妹交結(jié)實(shí)。種子播種在大田或溫室，植株長到4-6葉期時(shí)取葉片提取DNA，采用PCR技術(shù)檢測是否帶有外源基因。取轉(zhuǎn)基因陽性植株進(jìn)行抗逆性測定。
對于轉(zhuǎn)betA基因的小苗在干旱或高鹽處理前后取葉片測定甘氨酸甜菜堿含量，篩選目的基因表達(dá)高的植株套袋自交結(jié)籽。同時(shí)，對同一株系的植株進(jìn)行耐鹽性測定和干旱脅迫處理，以及農(nóng)藝性狀的觀測，測定與植株耐鹽耐旱性相關(guān)的生理生化指標(biāo)，確定植株耐鹽耐旱的最高級別。綜合植株農(nóng)藝性狀、甘氨酸甜菜堿含量和其它生理生化測定指標(biāo)、和盆栽干旱和鹽脅迫處理的結(jié)果等，選擇出耐鹽耐旱性優(yōu)良的材料用于轉(zhuǎn)基因聚合。
對于轉(zhuǎn)NHX1和PPase基因的小苗用高鹽(NaCl)溶液進(jìn)行脅迫處理，在處理前后取葉片測細(xì)胞Na+、K+和Ca2+離子含量，并觀測不同NaCl濃度處理下植株的生長勢、存活率和受害情況，對苗期表現(xiàn)出優(yōu)良耐鹽性的植株取來自同一轉(zhuǎn)化體的后代種子播種在花盆或鹽堿地，進(jìn)行全生育期耐鹽耐旱測定。綜合植株農(nóng)藝性狀、葉細(xì)胞Na+、K+和Ca2+離子含量測定結(jié)果及葉片水勢變化和其它生理生化測定指標(biāo)、盆栽和鹽堿地實(shí)驗(yàn)結(jié)果等，選擇出耐鹽耐旱性優(yōu)良的材料用于轉(zhuǎn)基因聚合。
3.轉(zhuǎn)基因聚合和耐鹽耐旱植株的利用轉(zhuǎn)基因聚合可通過三條途徑進(jìn)行第一條途徑為，以轉(zhuǎn)基因純合的轉(zhuǎn)betA基因(或NHX1和PPase基因)的植株自交種子為材料，按照本實(shí)例“玉米轉(zhuǎn)基因植株的獲得”部分所介紹的方法將NHX1和PPase基因(或betA基因)轉(zhuǎn)入，經(jīng)自交純合、耐鹽耐旱性檢測和農(nóng)藝性狀選擇等步驟，獲得綜合性狀好的耐鹽耐旱性狀優(yōu)異的自交系。
第二條途徑為，以來自同一自交系的分別轉(zhuǎn)betA基因和NHX1及PPase基因的植株互為父、母本，進(jìn)行交配，產(chǎn)生聚合有3個(gè)目的基因的后代。由于玉米雌雄穗分開，該途徑具有效率高，成本低，易操作等優(yōu)點(diǎn)。
第三條途徑為，直接利用A自交系的轉(zhuǎn)betA基因的純合植株與B自交系的轉(zhuǎn)NHX1和PPase基因的植株進(jìn)行雜交，產(chǎn)生雜種種子。該雜種攜帶來自雙親的3個(gè)目標(biāo)基因。為了使該雜交種有生產(chǎn)上利用價(jià)值，A自交系和B自交系間必須有很好的雜種優(yōu)勢。這樣可直接獲得可用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的耐鹽耐旱單交種。
對于轉(zhuǎn)基因聚合材料，一般通過和本實(shí)例“轉(zhuǎn)基因植株的管理和抗性檢測”部分闡述的方法和程序進(jìn)行耐旱耐鹽性測定及綜合性狀選擇，對獲得的優(yōu)異材料用于玉米育種或生產(chǎn)實(shí)踐。
實(shí)施例2創(chuàng)制耐鹽耐旱性優(yōu)異的小麥育種材料1.小麥轉(zhuǎn)基因植株的獲得選擇優(yōu)良品種如濟(jì)南17、穩(wěn)千一號等進(jìn)行農(nóng)桿菌為中介的遺傳轉(zhuǎn)化。(1)將無菌小麥黃化苗的須根全部切除，用解剖針和解剖刀剝除胚芽鞘及1-2片幼葉，暴露出莖尖生長錐，然后用解剖針刺傷莖尖生長錐。(2)傾斜4.5cm直徑的無菌培養(yǎng)皿，倒入加有乙酰丁香酮的LBA4404菌(Mini-Ti質(zhì)粒帶有除草劑抗性基因bar和目的基因betA和NHX1，或帶有除草劑抗性基因bar和目的基因PPase基因)液(OD600＝0.8)，將裸露出莖尖生長錐的無菌種子浸泡在菌液中6-8min，在此期間用0.5×105Pa大氣壓下處理以促進(jìn)農(nóng)桿菌滲入。(3)用無菌濾紙吸干小麥種子腹面沾染的菌液，然后腹面向下放在萌發(fā)培養(yǎng)基上，露出浸染過的莖尖，在25℃暗培養(yǎng)2-3天。(4)將轉(zhuǎn)化小苗移栽到上層蛭石下層壤土的花盆中，并用蛭石覆蓋小芽頂部。然后讓植株在自然光照下生長，日溫22-25℃，夜溫15-20℃，隔天澆灌1/2改良MS培養(yǎng)基無機(jī)鹽。(5)轉(zhuǎn)化小苗成活后用除草劑Finale篩選(0.1％濃度)，成活小苗長至3-4葉時(shí)移栽到大田越冬。(6)用PCR方法檢測移栽成活的植株，并用Southern雜交驗(yàn)證PCR陽性植株，獲得轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)基因植株返青后生長發(fā)育正常，植株形態(tài)和生育期等和未轉(zhuǎn)基因植株相比無明顯差異。
本實(shí)例中，農(nóng)桿菌培養(yǎng)同實(shí)施例1，但農(nóng)桿菌中的Mini-Ti質(zhì)?；驇в谐輨┛剐曰騜ar和目的基因betA、NHX1，或帶有除草劑抗性基因bar和目的基因PPase。前一Mini-Ti質(zhì)粒的bar基因由組成型啟動(dòng)子啟動(dòng)，在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中可持續(xù)表達(dá)。后一Mini-Ti質(zhì)粒的bar基因由乙醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子啟動(dòng)，當(dāng)不用乙醇處理細(xì)胞時(shí)bar基因不表達(dá)，因此轉(zhuǎn)基因細(xì)胞仍對除草劑Finale敏感。因此，當(dāng)用攜帶后一質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化細(xì)胞后，可用乙醇水溶液處理轉(zhuǎn)化小苗，3-4小時(shí)后再用除草劑Finale溶液處理小苗。在用乙醇水溶液和除草劑Finale溶液處理一次后，植株恢復(fù)3天，再用乙醇水溶液和除草劑Finale溶液處理一次。本工作中，所用除草劑為水劑，小麥大田噴施濃度為3.6mlFinale/L水溶液。因移栽到蛭石中的小苗很小，可用Finale水溶液浸泡的脫脂棉塊覆蓋小苗頂部的方法進(jìn)行抗除草劑植株的篩選，一般用脫脂棉塊覆蓋24小時(shí)以上。經(jīng)除草劑篩選后，大部分轉(zhuǎn)化植株死亡，存活植株仍繼續(xù)生長。
2.轉(zhuǎn)基因植株的管理和抗性檢測存活植株長到4-5葉期時(shí)移栽到田間，按照常規(guī)管理方法進(jìn)行管理。單穗收獲種子供遺傳穩(wěn)定性分析和耐鹽耐旱性鑒定等。
(1)轉(zhuǎn)betA和NHX1基因小麥的耐鹽性測定轉(zhuǎn)betA和NHX1小麥的T1代種子種在沙盆中，用1.5或2.0％NaCl(因供體品種基因型定)水溶液澆灌15天，然后再澆灌含1.5或2.0％NaCl的Hogland溶液，播種45天后，統(tǒng)計(jì)耐鹽種子萌發(fā)率和小苗成活率。耐鹽植株移栽至大田，并對其進(jìn)行PCR檢測和目的基因表達(dá)強(qiáng)度的檢測。
若將轉(zhuǎn)betA基因的濟(jì)南17種子(T1代)和對照種子(濟(jì)南17)播種后用2.0％鹽水澆灌，對照種子吸漲后發(fā)育很慢或停止發(fā)育，只有少數(shù)種子在23天后露出胚根，一個(gè)月后產(chǎn)生單葉小苗，然后逐漸死亡，45天時(shí)無存活小苗；多數(shù)轉(zhuǎn)基因植株的種子耐鹽性強(qiáng)，一些種子在播種7天時(shí)已開始萌發(fā)，10天左右出苗。在用1.5％NaCl水溶液澆灌15天后，改用含2.0％NaCl的Hoagland溶液澆灌，多數(shù)T1代小苗隨著鹽水澆灌時(shí)間延長長勢變差，逐漸死亡。45天后存活小苗一般葉片肥厚。將存活小苗移栽到大田，植株生長變快，葉片變薄，在4-6片葉時(shí)進(jìn)行PCR和PCR-Southern檢測，表明多數(shù)植株含有外源基因。
(2)轉(zhuǎn)betA和NHX1基因小麥的鹽堿地種植由于小麥對鹽害的敏感期為出苗和越冬后的返青期，在起身后耐鹽性較強(qiáng)。為了獲得具有應(yīng)用價(jià)值的數(shù)據(jù)，將篩選出的耐鹽植株產(chǎn)生的種子播種在鹽堿地中，統(tǒng)計(jì)出苗率、越冬前單株分蘗數(shù)、返青后存活率、單株成穗數(shù)、單株子粒數(shù)和千粒重等。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株比未轉(zhuǎn)基因的對照有顯著提高的耐鹽性。小麥通常只在含鹽量0.3％以下的土地中種植，而獲得的轉(zhuǎn)基因小麥具有優(yōu)異的耐鹽性，可含鹽量0.4-0.6％土地上豐產(chǎn)。
3.轉(zhuǎn)基因聚合和耐鹽植株的利用轉(zhuǎn)基因聚合可通過二條途徑進(jìn)行第一條途徑為，以轉(zhuǎn)基因純合的轉(zhuǎn)betA和NHX1基因(或PPase基因)的植株種子為材料，按照本實(shí)例“小麥轉(zhuǎn)基因植株的獲得”部分所介紹的方法將PPase基因(或betA和NHX1基因)轉(zhuǎn)入，經(jīng)自交純合、耐鹽耐旱性檢測和農(nóng)藝性狀選擇等步驟，獲得綜合性狀好的耐鹽耐旱性狀優(yōu)異的轉(zhuǎn)基因純合體。
第二條途徑為，以來自同一自交系的分別轉(zhuǎn)betA及NHX1基因和PPase基因的植株互為父、母本，進(jìn)行人工去雄、授粉，進(jìn)行姊妹交配，產(chǎn)生聚合有3個(gè)目的基因的后代。該途徑具有成本低，易操作等優(yōu)點(diǎn)。
對于轉(zhuǎn)基因聚合材料，一般按照本實(shí)例中“轉(zhuǎn)基因植株的管理和抗性檢測”部分闡述的方法和程序進(jìn)行耐鹽性測定及綜合性狀選擇，對獲得的優(yōu)異材料用于小麥育種。
權(quán)利要求
1.一種通過轉(zhuǎn)基因聚合betA、NHX1、PPase基因提高玉米、小麥耐鹽耐旱性的方法，其特征是，將來自植物的液泡膜鈉氫反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NHX1和液泡膜焦磷酸酶基因PPase、來自大腸桿菌的膽堿脫氫酶基因betA重組到植物表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)入玉米或小麥細(xì)胞并讓其高效表達(dá)，進(jìn)而再生出轉(zhuǎn)基因植株；從轉(zhuǎn)基因植株及其后代中篩選耐鹽耐旱性明顯提高的轉(zhuǎn)基因純合體；通過對轉(zhuǎn)基因純合體細(xì)胞進(jìn)行二次轉(zhuǎn)化或使帶有不同轉(zhuǎn)基因的植株相互交配獲得帶有3個(gè)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)基因植株，再從其后代中選擇耐鹽耐旱性優(yōu)異的個(gè)體，并進(jìn)行自交純合，進(jìn)而創(chuàng)建出玉米、小麥耐鹽耐旱育種新材料；或者直接利用轉(zhuǎn)基因聚合材料生產(chǎn)雜交種子。
2.如權(quán)利要求1所述的通過轉(zhuǎn)基因聚合betA、NHX1、PPase基因提高玉米、小麥耐鹽耐旱性的方法，其特征是，目標(biāo)基因NHX1和PPase基因可以分別以融合基因形式串聯(lián)插入在植物表達(dá)載體上，在玉米、小麥細(xì)胞內(nèi)能高效表達(dá)；betA基因重組在另一植物表達(dá)載體上，由在植物細(xì)胞內(nèi)能啟動(dòng)基因高效表達(dá)的啟動(dòng)子啟動(dòng)。
3.如權(quán)利要求2所述的通過轉(zhuǎn)基因聚合betA、NHX1、PPase基因提高玉米、小麥耐鹽耐旱性的方法，其特征是，NHX1和PPase基因來自鹽生植物或非鹽生植物。
4.如權(quán)利要求1所述的通過轉(zhuǎn)基因聚合betA、NHX1、PPase基因提高玉米、小麥耐鹽耐旱性的方法，其特征是，用于遺傳轉(zhuǎn)化的玉米、小麥基因型為優(yōu)良自交系或品種，受體細(xì)胞有莖尖分生組織細(xì)胞、離體培養(yǎng)的幼胚細(xì)胞、成熟胚細(xì)胞、胚性愈傷組織細(xì)胞或原生質(zhì)體。
5.如權(quán)利要求1所述的通過轉(zhuǎn)基因聚合betA、NHX1、PPase基因提高玉米、小麥耐鹽耐旱性的方法，其特征是，對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行耐鹽抗旱性測定以篩選出耐鹽耐旱性明顯提高的個(gè)體并進(jìn)行自交或回交。
6.如權(quán)利要求1所述的通過轉(zhuǎn)基因聚合betA、NHX1、PPase基因提高玉米、小麥耐鹽耐旱性的方法，其特征是，耐鹽耐旱性提高的轉(zhuǎn)基因植株通過自交、轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因純合體。
7.如權(quán)利要求1所述的通過轉(zhuǎn)基因聚合betA、NHX1、PPase基因提高玉米、小麥耐鹽耐旱性的方法，其特征是，帶有不同目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)基因植株可通過再次遺傳轉(zhuǎn)化獲得帶有3個(gè)目標(biāo)基因的植株，后者通過自交產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因純合體。
8.如權(quán)利要求1所述的通過轉(zhuǎn)基因聚合betA、NHX1、PPase基因提高玉米、小麥耐鹽耐旱性的方法，其特征是，來自同一基因型的帶有不同目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)基因純合體植株彼此交配，產(chǎn)生帶有3個(gè)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)基因植株，后者通過2-3代自交和轉(zhuǎn)基因檢測獲得轉(zhuǎn)基因純合體。
9.如權(quán)利要求1、7或8所述的通過轉(zhuǎn)基因聚合betA、NHX1、PPase基因提高玉米、小麥耐鹽耐旱性的方法，其特征是，對轉(zhuǎn)基因純合植株進(jìn)行耐鹽耐旱性檢測，從中選擇優(yōu)異材料培育玉米、小麥耐鹽耐旱新種質(zhì)。
10.如權(quán)利要求1所述的通過轉(zhuǎn)基因聚合betA、NHX1、PPase基因提高玉米、小麥耐鹽耐旱性的方法，其特征是，可將轉(zhuǎn)基因聚合植株直接應(yīng)用于玉米、小麥雜交種子培育。
全文摘要
本發(fā)明公開一種通過轉(zhuǎn)基因聚合betA、NHX1、PPase基因提高玉米、小麥耐鹽耐旱性的方法，是將來自植物的液泡膜鈉氫反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NHX1和液泡膜焦磷酸酶基因PPase、來自大腸桿菌的膽堿脫氫酶基因betA重組到植物表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)入玉米或小麥細(xì)胞并讓其高效表達(dá)，進(jìn)而再生出轉(zhuǎn)基因植株；從轉(zhuǎn)基因植株及其后代中篩選耐鹽耐旱性明顯提高的轉(zhuǎn)基因純合體；通過對轉(zhuǎn)基因純合體細(xì)胞進(jìn)行二次轉(zhuǎn)化或使帶有不同轉(zhuǎn)基因的植株相互交配獲得帶有3個(gè)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)基因植株，再從其后代中選擇耐鹽耐旱性優(yōu)異的個(gè)體，并進(jìn)行自交純合，進(jìn)而創(chuàng)建出玉米、小麥耐鹽耐旱育種新材料；或者直接利用轉(zhuǎn)基因聚合材料生產(chǎn)雜交種子。
文檔編號C12N15/53GK1769463SQ20051004479
公開日2006年5月10日 申請日期2005年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月22日
發(fā)明者張舉仁, 楊愛芳, 谷曉峰, 張可煒, 尹小燕 申請人:山東大學(xué)