專利名稱：蝦夷扇貝pymse005微衛(wèi)星標(biāo)記的快速檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蝦夷扇貝DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)，是一種蝦夷扇貝PYMSE005微衛(wèi)星標(biāo)記的快速檢測方法。
背景技術(shù)：
在真核生物基因組中，存在著由1-6個堿基對組成的簡單重復(fù)序列(SimpleSequence Repeats)，簡稱SSRs，又稱之為微衛(wèi)星DNA(Microsatellite DNA)。隨著分子標(biāo)記的發(fā)展，微衛(wèi)星標(biāo)記已經(jīng)成為國際上主流的標(biāo)記技術(shù)之一。微衛(wèi)星標(biāo)記有諸多優(yōu)點，如隨機分布在整個基因組中，多態(tài)性高；可通過PCR迅速擴增，需要的DNA樣品量較少，并且重復(fù)性好；孟德爾式遺傳，共顯性標(biāo)記。因此，微衛(wèi)星標(biāo)記在遺傳圖譜的構(gòu)建、遺傳多樣性分析和種質(zhì)鑒定等方面得到廣泛的應(yīng)用。
在扇貝相關(guān)物種的微衛(wèi)星研究中，僅報道了從海灣扇貝和櫛孔扇貝EST數(shù)據(jù)庫中篩選成功的幾個位點。Roberts等對29個海灣扇貝EST-SSRs設(shè)計引物擴增時發(fā)現(xiàn)，其中8個位點沒有得到擴增產(chǎn)物或者特異性產(chǎn)物，13個位點沒有多態(tài)性，篩選成功的位點僅有8個。李紅蕾等搜索了櫛孔扇貝6935條ESTs，發(fā)現(xiàn)42條序列含有微衛(wèi)星，選取了其中的7條序列設(shè)計引物，其中僅有3對引物有望在以后的工作中加以應(yīng)用。但利用已有的微衛(wèi)星標(biāo)記進行蝦夷扇貝的分子生物學(xué)分析和研究至今沒有報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提提供一種蝦夷扇貝微衛(wèi)星標(biāo)記的快速檢測方法。
本發(fā)明是按照以下操作步驟完成的首先提取蝦夷扇貝的基因組DNA備用；然后用菌落原位雜交法篩選已構(gòu)建的蝦夷扇貝微衛(wèi)星富集文庫，對陽性克隆測序，再在微衛(wèi)星核心重復(fù)序列的兩端設(shè)計引物；并使用該引物對蝦夷扇貝不同群體或群體內(nèi)個體的基因組DNA進行PCR擴增，再用10％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測；利用已有的軟件Quantity One準(zhǔn)確快速地確定每個個體的基因型，從而獲得蝦夷扇貝的遺傳多態(tài)性圖譜，準(zhǔn)確地檢測出每個個體的基因型，從而快速的檢測蝦夷扇貝每個個體在此微衛(wèi)星位點的遺傳變異。
富集文庫-菌落原位雜交得到的陽性克隆序列為CCTTAAACAATACGTTCATTAGTGAATAATCACTTAATAGCACTGACAATCAATAAGTATGTTGTATTTGTCATTTGGTGATTTTAATGATTAAACGTCCGTCGTATCGTTATTTCTATGTATTTTTATCCGTAGTTCTCCCTGACTATTCTCGCTCTATTCTCCCATCGTAGCGCTCTCTCACAGCCAATGACTATACTAAAAATATGATAGTATTAAATTCACACAGGCTGCCTTCGCCAGCGCGCTTTCAAACTAAACAATTCATACTCTAGCAGTCGTTATCTATTCTCACTCTTCATACTGCAGTCATACTCACTCTCTTCCATTCCCACTGGACCGTCCTTTATCTAGCTCCTTCACGCTGTTCAATTCATACCCTATAACTACACTGTAGTACAGAACGGTTGGTGGTTGTACAAATGCTTCATAGTGCTGACTCAAAGTCTTCAATTTTTACTGAGCCGTCTTCTCCGTCACTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCCCTATCTCTCTCTCTCCATTTCATCATATTACTTCACCAAAGAACTCTACGTTTGTCATAGTACTACATGTAGCTGATTGTCTTTAATTCTTACTAAACCTTCTTCATTATTGCTTTCCTAAGATTATTCCATTCATACTCTTTGCGTCATATCATGTTTTAGTTATTTGTTGTAAACCTTTTCCTTGTGCTTGCTTGACGTCTTCAATTCGTACTAAAACTCGTCGTCAAAATTTGCTCTCTATTATACTCATTAGTACTACCCCAGCCCCTGCGTATTTTATGAAGAATTTACCGACTGCTTT其中上述序列的微衛(wèi)星核心重復(fù)序列為(CT)12CCCTAT(CT)5。根據(jù)PYMSE005的核心序列兩端設(shè)計的特異性引物序列分別為正向引物5’-AGT ACA GAA CGG TTG GTG GT-3’；反向引物5’-GAC AAT CAG CTA CAT GTA GTA C-3’，退火溫度58℃。
根據(jù)已有的酚-氯仿方法提取蝦夷扇貝的基因組DNA，并將其稀釋為20ng/μl，每個PCR反應(yīng)體系中加入2μl，反應(yīng)體系為20μl。
對蝦夷扇貝不同群體或者蝦夷扇貝個體的基因組DNA進行PCR擴增，其PCR反應(yīng)條件為40ng蝦夷扇貝基因組DNA，0.2mmol/L的引物，200mmol/L的dNTPs，200mmol/L的Mg2+，1×PCR反應(yīng)緩沖液，1U的Taq DNA聚合酶。使用這兩對引物時設(shè)置的PCR程序參數(shù)為95℃變性45s，58℃退火45s，72℃延伸45s，反應(yīng)進行30個循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存。
PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)10％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓為5V/cm，每張膠上包括兩個分子量標(biāo)準(zhǔn)(pUC19/HaeIII)。電泳2-3小時后用濃度為0.15mg/mL的溴化乙錠染色，在凝膠成像系統(tǒng)上紫外成像并對電泳譜帶進行分析。利用軟件Quantity One對每個個體帶進行快速準(zhǔn)確的基因型確定。
應(yīng)用上述方法，可以檢測蝦夷扇貝的每個個體在此微衛(wèi)星區(qū)域的遺傳變異情況。通過電泳圖譜和Quantity One軟件分析結(jié)果，能夠準(zhǔn)確、方便、快捷地判讀出每個等位基因的大小以及每個個體的基因型。
具體實施例方式下面通過實施例詳細敘述本發(fā)明。
首先提取蝦夷扇貝的基因組DNA備用；然后用菌落原位雜交法篩選已構(gòu)建的蝦夷扇貝微衛(wèi)星富集文庫，對陽性克隆測序，再在微衛(wèi)星核心重復(fù)序列的兩端設(shè)計引物；并使用該引物對蝦夷扇貝不同群體或群體內(nèi)個體的基因組DNA進行PCR擴增，再用10％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測；利用已有的軟件Quantity One準(zhǔn)確快速地確定每個個體的基因型，從而獲得蝦夷扇貝的遺傳多態(tài)性圖譜，準(zhǔn)確地檢測出每個個體的基因型，從而快速的檢測蝦夷扇貝每個個體在此微衛(wèi)星位點的遺傳變異。
1、蝦夷扇貝基因組DNA的提取取扇貝閉殼肌約0.1克，加入500ml STE裂解緩沖液(NaCl100mM；EDTA1mM，PH＝8.0；Tris-Cl，10mM，PH＝8.0)，剪碎，再加入50ml SDS(10％)，以及5ml的蛋白酶K(20mg/ml)，56℃處理，直到裂解液澄清。加入等體積飽和酚(250ml)、氯仿/異戊醇(24∶1)(250ml)，抽提3次。取上清液，加入等體積氯仿/異戊醇(500ml)抽提1次。取上清液，加入50ml NaAc(3M)，緩慢搖勻，加滿冰無水乙醇，12000轉(zhuǎn)離心10min。將核酸沉淀于管底。70％乙醇(1000ml)洗滌沉淀并干燥直到乙醇全部揮發(fā)。加入100ml的無菌水和少量RNase A，4℃直到DNA全部溶解。紫外分光光度計定量稀釋成20ng/ml備用。
2、根據(jù)富集文庫-菌落原位雜交的結(jié)果，陽性克隆測序，其序列為CCTTAAACAATACGTTCATTAGTGAATAATCACTTAATAGCACTGACAATCAATAAGTATGTTGTATTTGTCATTTGGTGATTTTAATGATTAAACGTCCGTCGTATCGTTATTTCTATGTATTTTTATCCGTAGTTCTCCCTGACTATTCTCGCTCTATTCTCCCATCGTAGCGCTCTCTCACAGCCAATGACTATACTAAAAATATGATAGTATTAAATTCACACAGGCTGCCTTCGCCAGCGCGCTTTCAAACTAAACAATTCATACTCTAGCAGTCGTTATCTATTCTCACTCTTCATACTGCAGTCATACTCACTCTCTTCCATTCCCACTGGACCGTCCTTTATCTAGCTCCTTCACGCTGTTCAATTCATACCCTATAACTACACTGTAGTACAGAACGGTTGGTGGTTGTACAAATGCTTCATAGTGCTGACTCAAAGTCTTCAATTTTTACTGAGCCGTCTTCTCCGTCACTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCCCTATCTCTCTCTCTCCATTTCATCATATTACTTCACCAAAGAACTCTACGTTTGTCATAGTACTACATGTAGCTGATTGTCTTTAATTCTTACTAAACCTTCTTCATTATTGCTTTCCTAAGATTATTCCATTCATACTCTTTGCGTCATATCATGTTTTAGTTATTTGTTGTAAACCT
TTTCCTTGTGCTTGCTTGACGTCTTCAATTCGTACTAAAACTCGTCGTCAAAATTTGCTCTCTATTATACTCATTAGTACTACCCCAGCCCCTGCGTATTTTATGAAGAATTTACCGACTGCTTT3、微衛(wèi)星引物的設(shè)計在蝦夷扇貝微衛(wèi)星富集文庫基礎(chǔ)上，利用微衛(wèi)星DNA兩側(cè)的序列的保守性設(shè)計特異性引物，用于擴增該位點的微衛(wèi)星片斷。由于微衛(wèi)星核心重復(fù)序列重復(fù)次數(shù)不同，使擴增產(chǎn)物產(chǎn)生了長度的變化而呈現(xiàn)多態(tài)性，這是檢測微衛(wèi)星位點的多態(tài)性的根源所在。引物設(shè)計采用軟件Primer Premier 5.0和Oligo 6.44，引物設(shè)計采用以下嚴(yán)謹(jǐn)度(1)引物長度為19-25mer；(2)GC含量40％-60％；(3)退火溫度大于50℃；(4)預(yù)期PCR產(chǎn)物長度為100-250bp。根據(jù)測序結(jié)果，位點PYMSE005的特異性PCR引物序列為正向引物5’-AGT ACA GAA CGG TTG GTG GT-3’；反向引物5’-GAC AAT CAG CTA CAT GTAGTA C-3’，退火溫度58℃。
4、PCR擴增PCR反應(yīng)體系的組成為40ng蝦夷扇貝基因組DNA，0.2mmol/L的引物，200mmol/L的dNTPs，200mmol/L的Mg2+，1×PCR反應(yīng)緩沖液，1U的Taq DNA聚合酶。PCR反應(yīng)為30個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性45s，58℃退火45s，72℃延伸45s，反應(yīng)進行30個循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存。
5、PCR產(chǎn)物的檢測PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)10％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓為5V/cm，每張膠上包括兩個分子量標(biāo)佳(pUC19/HaeIII)。電泳完畢后用溴化乙錠(濃度為0.15mg/mL)染色，紫外觀察成像并對電泳譜帶進行分析。將譜帶轉(zhuǎn)換成軟件POPGENE 32能夠識別的數(shù)據(jù)，利用軟件POPGENE 32對遺傳學(xué)數(shù)據(jù)進行計算。
綜上所述，本發(fā)明具有以下特點微衛(wèi)星標(biāo)記的核心是根據(jù)微衛(wèi)星重復(fù)兩端的側(cè)翼序列設(shè)計特異性引物，因此本發(fā)明的核心是特異性PCR引物；本發(fā)明可以準(zhǔn)確、方便、快捷電判讀出櫛孔扇貝PYMSE005位點的每個等位基因的大小以及每個個體的基因型。操作簡單，方法簡便，結(jié)果穩(wěn)定直觀；本發(fā)明主要應(yīng)用于櫛孔扇貝遺傳圖譜的構(gòu)建、不同地理群體遺傳多樣性分析和種質(zhì)鑒定等方面的研究。
權(quán)利要求
1.一種蝦夷扇貝PYMSE005微衛(wèi)星標(biāo)記的快速檢測方法，其特征在于首先提取蝦夷扇貝閉殼肌的基因組DNA稀釋備用；然后菌落原位雜交法篩選已構(gòu)建的蝦夷扇貝微衛(wèi)星富集文庫，對陽性克隆進行測序，在其微衛(wèi)星核心重復(fù)序列兩端設(shè)計特異性引物；接著使用該引物對蝦夷扇貝不同群體或者群體內(nèi)個體的基因組DNA進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物用10％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測；最后利用產(chǎn)物出現(xiàn)的條帶進行分析，確定每個個體的基因型，即獲得蝦夷扇貝的遺傳多態(tài)性圖譜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蝦夷扇貝PYMSE005微衛(wèi)星標(biāo)記的快速檢測方法，其特征在于富集文庫—菌落原位雜交得到的陽性克降序列為CCTTAAACAATACGTTCATTAGTGAATAATCACTTAATAGCACTGACAATCAATAAGTATGTTGTATTTGTCATTTGGTGATTTTAATGATTAAACGTCCGTCGTATCGTTATTTCTATGTATTTTTATCCGTAGTTCTCCCTGACTATTCTCGCTCTATTCTCCCATCGTAGCGCTCTCTCACAGCCAATGACTATACTAAAAATATGATAGTATTAAATTCACACAGGCTGCCTTCGCCAGCGCGCTTTCAAACTAAACAATTCATACTCTAGCAGTCGTTATCTATTCTCACTCTTCATACTGCAGTCATACTCACTCTCTTCCATTCCCACTGGACCGTCCTTTATCTAGCTCCTTCACGCTGTTCAATTCATACCCTATAACTACACTGTAGTACAGAACGGTTGGTGGTTGTACAAATGCTTCATAGTGCTGACTCAAAGTCTTCAATTTTTACTGAGCCGTCTTCTCCGTCACTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCCCTATCTCTCTCTCTCCATTTCATCATATTACTTCACCAAAGAACTCTACGTTTGTCATAGTACTACATGTAGCTGATTGTCTTTAATTCTTACTAAACCTTCTTCATTATTGCTTTCCTAAGATTATTCCATTCATACTCTTTGCGTCATATCATGTTTTAGTTATTTGTTGTAAACCTTTTCCTTGTGCTTGCTTGACGTCTTCAATTCGTACTAAAACTCGTCGTCAAAATTTGCTCTCTATTATACTCATTAGTACTACCCCAGCCCCTGCGTATTTTATGAAGAATTTACCGACTGCTTT
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蝦夷扇貝PYMSE005微衛(wèi)星標(biāo)記的快速檢測方法，其特征在于微衛(wèi)星的核心重復(fù)序列為(CT)12CCCTAT(CT)5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蝦夷扇貝PYMSE005微衛(wèi)星標(biāo)記的快速檢測方法，其特征為在其核心重復(fù)序列兩端設(shè)計的特異性引物序列分別為正向引物5’-AGT ACA GAA CGG TTG GTG GT-3’；反向引物5’-GACAAT CAG CTA CAT GTA GTA C-3’，退火溫度58℃。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蝦夷扇貝PYMSE005微衛(wèi)星標(biāo)記的快速檢測方法，其特征為將提取好的蝦夷扇貝的基因組DNA稀釋為20ng/ml，且在每個PCR反應(yīng)體系中加入2μl，反應(yīng)體系為20μl。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蝦夷扇貝PYMSE005微衛(wèi)星標(biāo)記的快速檢測方法，其特征為對蝦夷扇貝不同群體或者蝦夷扇貝個體的基因組DNA進行的PCR擴增，其PCR反應(yīng)體系組成為40ng蝦夷扇貝基因組DNA，0.2mmol/L的引物，200mmol/L的dNTPs，200mmol/L的Mg2+，1×PCR反應(yīng)緩沖液，1U的Taq DNA聚合酶；使用這兩對引物時設(shè)置的PCR程序參數(shù)為95℃變性45s，60℃退火45s，72℃延伸45s，反應(yīng)進行30個循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蝦夷扇貝PYMSE005微衛(wèi)星標(biāo)記的快速檢測方法，其特征為PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)10％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓為5V/cm，每張膠上包括兩個分子量標(biāo)準(zhǔn)——pUC19/HaeIII；電泳2-3小時后用濃度為0.15mg/mL的溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)上紫外成像并對電泳譜帶進行分析；最后利用軟件Quantity One確定每個個體的基因型。
全文摘要
一種蝦夷扇貝PYMSE005微衛(wèi)星標(biāo)記的快速檢測方法首先提取蝦夷扇貝的基因組DNA備用；然后用菌落原位雜交法篩選已構(gòu)建的蝦夷扇貝微衛(wèi)星富集文庫，對陽性克隆測序，再在微衛(wèi)星核心重復(fù)序列的兩端設(shè)計引物；并使用該引物對蝦夷扇貝不同群體或群體內(nèi)個體的基因組DNA進行PCR擴增，再用10％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測；利用已有軟件Quantity One準(zhǔn)確快速地確定每個個體的基因型，而獲得蝦夷扇貝的遺傳多態(tài)性圖譜。本發(fā)明應(yīng)用于蝦夷扇貝遺傳圖譜的構(gòu)建、不同群體或者養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性分析和種質(zhì)鑒定等方面的研究。能夠準(zhǔn)確、方便、快捷地判讀出每個等位基因的大小和每個個體的基因型。
文檔編號C12Q1/68GK1800414SQ20051004479
公開日2006年7月12日 申請日期2005年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月23日
發(fā)明者胡景杰, 包振民, 汪小龍, 戰(zhàn)愛斌, 惠敏 申請人:中國海洋大學(xué)