專利名稱：一種用于酶固定化的新型硅膠負(fù)載多孔殼聚糖載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酶固定化載體，特別是一種用于酶固定化的新型硅膠負(fù)載多孔殼聚糖載體。
背景技術(shù)：
酶作為一種生物催化劑，具有選擇性高、催化反應(yīng)條件溫和、無污染等諸多優(yōu)點(diǎn)。然而，酶的本質(zhì)是一種蛋白質(zhì)。游離酶對(duì)環(huán)境變化的耐受力低、易失去活性、從反應(yīng)產(chǎn)物中分離困難等缺點(diǎn)極大限制了它的大規(guī)模應(yīng)用。應(yīng)運(yùn)而生的固定化酶具有游離酶無法比擬的優(yōu)勢。固定化酶對(duì)溫度、pH值、溶劑極性等具有較高的耐受性，并能回收反復(fù)使用，從而避免了酶蛋白對(duì)產(chǎn)物造成的污染。目前，固定化酶在食品加工、醫(yī)藥和精細(xì)化工等產(chǎn)業(yè)中的重要性已經(jīng)得到廣泛認(rèn)同。以對(duì)載體材料和固定化方法研究為主的酶固定化技術(shù)一直是現(xiàn)代生物技術(shù)中十分活躍的領(lǐng)域。目前，酶的固定化已經(jīng)從實(shí)驗(yàn)室研究探索階段進(jìn)入實(shí)際應(yīng)用階段。我國對(duì)固定化酶的研究始于20世紀(jì)70年代，然而用于實(shí)際生產(chǎn)的卻較少。制約我國固定化酶發(fā)展的一個(gè)主要原因，是缺乏適合的固定化載體。
載體材料對(duì)所得固定化酶的活性和穩(wěn)定性有著重要的影響。理想的酶固定化載體除應(yīng)易于制備，價(jià)格低廉外，還應(yīng)具備如下特征首先載體本身必須對(duì)酶是惰性的。其次，酶的固定化先決條件是有足夠量的某些化學(xué)基團(tuán)存在，這些基團(tuán)可以在不影響載體結(jié)構(gòu)的情況下被活化或衍生，因此載體必須具有易于活化或衍生的基團(tuán)。第三，載體必須在機(jī)械性能和化學(xué)性質(zhì)上具有穩(wěn)定性，在改變pH值、離子強(qiáng)度、溫度、溶劑等實(shí)際操作條件下能穩(wěn)定存在。另外，與小分子的固定化載體不同，用于酶固定化的載體必須有利于酶分子構(gòu)像和活性的保持，因此載體必須具有大的比表面積、大的孔網(wǎng)絡(luò)和高的孔隙度。這主要是由于(1)相對(duì)于表面無孔結(jié)構(gòu)，高的孔隙度一方面可以增加載體的比表面積，另一方面可以提供更多反應(yīng)底物與酶的接觸機(jī)會(huì)；(2)比表面積決定表面可活化基團(tuán)量的多少，大的比表面積可以提供更多的表面可活化基團(tuán)，從而提高酶的固定量；(3)大的孔網(wǎng)絡(luò)可以提供足夠大的空間，使得在較高酶密度下，酶分子仍能以舒展的活性構(gòu)像存在，避免由于分子間的擁擠而造成的構(gòu)像變化及活性損失。然而，迄今為止，尚無能全面滿足這些條件的載體。瓊脂糖系列凝膠一直被認(rèn)為是較好的酶固定化載體，而在我國此類載體多數(shù)依賴進(jìn)口，價(jià)格昂貴。這種情況十分不利于我國固定化酶技術(shù)的發(fā)展和工業(yè)應(yīng)用。因此開發(fā)和尋找廉價(jià)的國產(chǎn)固定化酶載體，對(duì)于酶固定化技術(shù)在我國的普遍應(yīng)用具有重要意義。
殼聚糖(Chitosan)是天然類多糖甲殼素的重要衍生物，廣泛存在于甲殼類動(dòng)物如蝦蟹及昆蟲等的外殼以及許多低等植物如菌藻類的細(xì)胞壁中，是自然界中儲(chǔ)量僅次于纖維素的最豐富的天然高分子材料，也是目前發(fā)現(xiàn)的唯一的天然堿性多糖。以殼聚糖作為酶固定化載體的研究十分活躍。這主要取決于殼聚糖的優(yōu)良特性。除來源廣泛，價(jià)格低廉外，殼聚糖對(duì)人體無毒和生物無毒，在自然界中可生物降解，是典型的環(huán)境友好材料。此外，殼聚糖分子中存在的豐富羥基和氨基賦予其許多獨(dú)特的性能。一方面，殼聚糖具有良好的生物相容性，尤其是與各種蛋白質(zhì)具有高的親和力；另一方面，殼聚糖分子中的氨基易于參加化學(xué)反應(yīng)，衍生容易，十分利于酶的共價(jià)固定。然而，殼聚糖酸溶性的特點(diǎn)使其在使用過程中易于流失。因此，通常將殼聚糖制備成交聯(lián)微珠使用。一般采用的方法是使殼聚糖在微乳液體系中，在交聯(lián)劑如戊二醛、甲醛、環(huán)氧氯丙烷、甘油雙環(huán)氧丙基醚等存在下交聯(lián)成球。值得注意的是，這個(gè)過程通常需要使用大量的有機(jī)溶劑，故經(jīng)濟(jì)性差。除此之外，所得殼聚糖微珠通常機(jī)械強(qiáng)度較差。這都極大地限制了殼聚糖在酶固定化方面的廣泛使用。
本發(fā)明的目的是提供一種制備簡單、性能優(yōu)良、適用于酶固定化的殼聚糖基質(zhì)載體。本發(fā)明將殼聚糖負(fù)載在硅膠上，所得載體機(jī)械強(qiáng)度高。本發(fā)明采用的交聯(lián)試劑為含有環(huán)氧基團(tuán)、水溶性的無機(jī)硅烷試劑γ-環(huán)氧丙氧丙基三甲氧基硅烷，酶固定化載體的制備過程簡單，無需任何有機(jī)溶劑，所得載體性質(zhì)穩(wěn)定。本發(fā)明的酶固定化載體，采用致孔劑聚乙二醇20000使得載體材料具有表面多孔結(jié)構(gòu)，十分有利于酶的固定及活性保持。同時(shí)，本發(fā)明制品還具有價(jià)格低，使用方便簡單等優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種價(jià)格低廉、制備過程簡單、適用于酶固定化的硅膠負(fù)載多孔殼聚糖載體。本發(fā)明酶固定化載體是通過以下步驟完成的——a在1mol/L 100mL醋酸溶液中加入殼聚糖2-4g，致孔劑聚乙二醇5-15g，磁力攪拌30min，過濾；
——b在濾液中加入無機(jī)硅烷試劑γ-環(huán)氧丙氧丙基三甲氧基硅烷2-8mL，磁力攪拌30min；——c向溶液中加入100-200目硅膠50g，攪拌均勻，超聲40min；——d將溶液傾倒到培養(yǎng)皿中，攪拌均勻，室溫靜置48h；——e將所得固體在0.01mol/L 100mL氫氧化鈉溶液中浸泡30min，蒸餾水洗至中性；——f將所得固體置于50倍體積的蒸餾水中，80℃抽提，每2h更換蒸餾水，8h后將固體取出，40℃烘干，即得硅膠負(fù)載多孔殼聚糖載體。
本發(fā)明殼聚糖的交聯(lián)是通過交聯(lián)試劑實(shí)現(xiàn)的。水溶性的γ-環(huán)氧丙氧丙基三甲氧基硅烷交聯(lián)劑含有雙官能團(tuán)硅甲氧基和環(huán)氧基團(tuán)。一方面，如圖1所示硅甲氧基可以通過在溶液中的水解、縮合形成無機(jī)氧化物網(wǎng)絡(luò)。硅膠涂漬液中的醋酸組分及制備過程中溶液的逐漸揮發(fā)均可加速此無機(jī)氧化物網(wǎng)絡(luò)的形成。另一方面，如圖2所示殼聚糖分子中的氨基與環(huán)氧基團(tuán)的反應(yīng)，可以實(shí)現(xiàn)殼聚糖鏈之間的交聯(lián)并將殼聚糖成功引入到無機(jī)網(wǎng)絡(luò)中。殼聚糖分子中豐富的羥基、氨基及無機(jī)硅烷組分產(chǎn)生的硅醇基團(tuán)可提供大量的氫鍵形成位點(diǎn)，非常有利于在硅膠表面制備得到結(jié)構(gòu)均勻、性能優(yōu)良的材料。
本發(fā)明是將殼聚糖負(fù)載在硅膠表面制備載體材料，硅膠具有大的比表面積和優(yōu)良的機(jī)械強(qiáng)度，因此制備的載體材料機(jī)械強(qiáng)度高。同時(shí)，不同于純殼聚糖載體，該硅膠負(fù)載殼聚糖載體在使用過程中無明顯溶漲。
本發(fā)明酶固定化載體，采用一種高分子聚合物-聚乙二醇20000作為致孔劑。聚乙二醇分子中豐富的醚鍵使其具有優(yōu)良的水溶性。制備步驟e中得到的固體材料是由不溶性的硅膠、交聯(lián)殼聚糖以及易溶于水的聚乙二醇三種組分組成的。由于聚乙二醇分子中具有大量的氫鍵形成位點(diǎn)(氧原子)，因此聚乙二醇與另外兩組分之間存在大量的氫鍵而具有良好的相容性。制備過程f中，溫度的升高導(dǎo)致氫鍵的斷裂和致孔劑聚乙二醇的溶解，從而使得載體材料具有表面多孔結(jié)構(gòu)。表面抽提過的載體的紅外光譜譜圖中無聚乙二醇的特征吸收峰，因此表面抽提過的載體中不含聚乙二醇。SIRION掃描電子顯微鏡(FEI，USA)用于檢測硅膠和本專利制備的載體表面形貌，固體均經(jīng)鍍金后進(jìn)行測試。圖3為制備過程中使用的硅膠和本專利制得的載體的掃描電子顯微鏡圖。硅膠表面為平整的無孔結(jié)構(gòu)(圖3A，B)，而本專利制備的載體(圖3C，D)硅膠表面的殼聚糖層十分明顯，并且具有與硅膠表面無孔形貌具有顯著性差異的多孔結(jié)構(gòu)。
將酶固定于水不溶的載體上，根據(jù)結(jié)合形式的不同可以分為非共價(jià)結(jié)合和共價(jià)結(jié)合法。與包埋法、被動(dòng)吸附法等非共價(jià)結(jié)合法相比，通過固定在載體上的金屬固定酶的方法近年來引起人們的關(guān)注。這種酶固定方法是基于酶分子表面的一些氨基酸含有可以提供電子的基團(tuán)，如組氨酸的咪唑基團(tuán)、半胱氨酸巰基和色氨酸的吲哚基團(tuán)等。這些基團(tuán)可以與固定在載體上的金屬形成配位復(fù)合物從而使酶固定在載體上。這種酶固定化方法過程簡單，所用金屬離子配基價(jià)格低廉，在高鹽濃度下等條件下酶仍不會(huì)脫落等優(yōu)點(diǎn)。共價(jià)結(jié)合是酶固定化方法中應(yīng)用最多的。此類方法將酶以共價(jià)鍵結(jié)合于載體上，固定的酶結(jié)合牢固，穩(wěn)定性好。
本發(fā)明制備的酶固定化載體，可通過非共價(jià)結(jié)合和共價(jià)結(jié)合兩種方式固定酶。這主要是由于(1)殼聚糖可與過渡金屬結(jié)合，通過結(jié)合上的金屬可以實(shí)現(xiàn)酶的非共價(jià)固定；(2)殼聚糖分子中未發(fā)生交聯(lián)的氨基易于與雙官能團(tuán)試劑反應(yīng)，然后通過接上的官能團(tuán)將酶共價(jià)固定在載體上。
選用最為常用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白牛血清白蛋白(有金屬配位能力)作為一種簡單易得的模型蛋白。以上述兩種方法為例，檢測本專利所得載體固定化酶(蛋白)的效果。蛋白測定采用考馬斯亮蘭染色法。
(1)非共價(jià)固定將本專利載體浸在100mg/L的Cu2+標(biāo)準(zhǔn)溶液(pH＝5.0)中，使得載體對(duì)Cu2+達(dá)到飽和吸附。根據(jù)Cu2+標(biāo)準(zhǔn)溶液吸附前后濃度變化，得出每克本專利載體對(duì)Cu2+飽和吸附量為4.17mg。將結(jié)合了金屬的載體，用0.1mol/L的磷酸緩沖液(pH＝6.0)平衡后，加入溶于0.1mol/L磷酸緩沖液(pH＝6.0)的牛血清白蛋白溶液中，震蕩結(jié)合2h。根據(jù)牛血清白蛋白溶液吸附前后蛋白含量變化，得出每克本專利載體對(duì)牛血清白蛋白吸附量為180mg。
(2)共價(jià)固定采用的雙能團(tuán)試劑為戊二醛。將本專利載體加入到含有1％戊二醛的0.1mol/L的硼酸緩沖液(pH＝8.2)中，震蕩反應(yīng)2h。觀察到載體顆粒由白色變?yōu)辄S色。將所得固體取出，用蒸餾水將殘留的戊二醛洗凈后，加入溶于0.1mol/L磷酸緩沖液(pH＝6.0)的牛血清白蛋白溶液中，震蕩結(jié)合2h。根據(jù)牛血清白蛋白溶液吸附前后蛋白含量變化，得出每克本專利載體對(duì)牛血清白蛋白吸附量為278mg。
本發(fā)明制得的酶固定化載體通過對(duì)殼聚糖的有效交聯(lián)克服了殼聚糖的酸溶性，在1mol/L的醋酸溶液對(duì)該載體材料震蕩抽提2h后，溶液中未檢測到殼聚糖，說明該載體材料在酸中具有良好的穩(wěn)定性。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及效果1、本發(fā)明將殼聚糖負(fù)載在硅膠上，通過交聯(lián)劑交聯(lián)使其均勻地包在硅膠表面，所得載體為堅(jiān)實(shí)的固體顆粒，使用時(shí)無明顯溶漲。本發(fā)明制備的載體機(jī)械強(qiáng)度高，改善了殼聚糖載體質(zhì)軟的缺點(diǎn)。
2、本發(fā)明采用的交聯(lián)劑為水溶性的無機(jī)硅烷試劑γ-環(huán)氧丙氧丙基三甲氧基硅烷，酶固定化載體的制備過程反應(yīng)條件溫和，無需任何有機(jī)溶劑，環(huán)境友好。
3、本發(fā)明制得的酶固定化載體易于衍生，可以通過非共價(jià)結(jié)合和共價(jià)結(jié)合兩種方式實(shí)現(xiàn)蛋白(酶)的固定化，固定量大。
4、本發(fā)明制得的酶固定化載體具有優(yōu)良的多孔結(jié)構(gòu)。
5、本發(fā)明制得的酶固定化載體在酸中具有良好的穩(wěn)定性，改善了殼聚糖載體酸溶性。

圖1、交聯(lián)試劑水解、縮合過程示意圖。
圖2、殼聚糖交聯(lián)過程示意圖。
圖3、硅膠和制備的載體的掃描電子顯微鏡圖。
具體實(shí)施方式本發(fā)明是在1mol/L 100mL醋酸溶液中加入精制殼聚糖2g和致孔劑聚乙二醇10g，磁力攪拌30min，濾布過濾后去除不溶殘?jiān)?；向?yàn)V液中加入無機(jī)硅烷試劑γ-環(huán)氧丙氧丙基三甲氧基硅烷2mL，磁力攪拌30min后邊攪拌邊在溶液中加入100-200目硅膠50g，攪拌均勻，超聲40min；將懸浮液傾倒到培養(yǎng)皿中，攪拌均勻，室溫靜置48h至固體干燥；將所得固體在0.01mol/L 100mL氫氧化鈉溶液中浸泡30min后取出吸附劑，蒸餾水洗至中性，將所得固體置于50倍體積的蒸餾水中，80℃抽提8h，將固體取出40℃烘干，即可得到用于酶固定化的新型硅膠負(fù)載多孔殼聚糖載體。
權(quán)利要求
1.一種用于酶固定化的新型硅膠負(fù)載多孔殼聚糖載體，其特征是該酶固定化載體是通過以下步驟制備的——a在1mol/L 100mL醋酸溶液中加入殼聚糖2-4g，致孔劑聚乙二醇5-15g，磁力攪拌30min，過濾；——b在濾液中加入無機(jī)硅烷試劑2-8mL，磁力攪拌30min；——c向溶液中加入100-200目硅膠50g，攪拌均勻，超聲40min；——d將溶液傾倒到培養(yǎng)皿中，攪拌均勻，室溫靜置48h；——e將所得固體在0.01mol/L 100mL氫氧化鈉溶液中浸泡30min，蒸餾水洗至中性；——f將所得固體置于50倍體積的蒸餾水中，80℃抽提，每2h更換蒸餾水，8h后將固體取出40℃烘干，得硅膠負(fù)載多孔殼聚糖載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于酶固定化的新型硅膠負(fù)載多孔殼聚糖載體，其特征在于殼聚糖的脫乙酰度為98％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于酶固定化的新型硅膠負(fù)載多孔殼聚糖載體，其特征在于殼聚糖的分子量為3.2×104g/mol。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于酶固定化的新型硅膠負(fù)載多孔殼聚糖載體，其特征在于致孔劑為聚乙二醇20000。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于酶固定化的新型硅膠負(fù)載多孔殼聚糖載體，其特征在于交聯(lián)劑為γ-環(huán)氧丙氧丙基三甲氧基硅烷。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于酶固定化的新型硅膠負(fù)載多孔殼聚糖載體，其特征在于該載體易于衍生，可通過非共價(jià)結(jié)合和共價(jià)結(jié)合兩種方式固定酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于酶固定化的新型硅膠負(fù)載多孔殼聚糖載體。本發(fā)明酶固定化載體是將殼聚糖負(fù)載在硅膠上，載體的制備采用含有環(huán)氧基團(tuán)、水溶性的無機(jī)硅烷試劑γ－環(huán)氧丙氧丙基三甲氧基硅烷作為殼聚糖的交聯(lián)劑。殼聚糖的交聯(lián)通過殼聚糖與環(huán)氧基團(tuán)的反應(yīng)及硅烷試劑的水解、縮合過程實(shí)現(xiàn)。在制備過程中采用了致孔劑聚乙二醇20000，使得載體材料具有優(yōu)良的表面多孔結(jié)構(gòu)。本發(fā)明酶固定化載體價(jià)格低廉、制備過程簡單、機(jī)械強(qiáng)度高、性質(zhì)穩(wěn)定且易于衍生，可通過非共價(jià)結(jié)合和共價(jià)結(jié)合兩種方式實(shí)現(xiàn)酶的固定。
文檔編號(hào)C12N11/04GK1804033SQ200510045268
公開日2006年7月19日 申請(qǐng)日期2005年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月6日
發(fā)明者李峰, 張書圣 申請(qǐng)人:青島科技大學(xué)